林上進(jìn)　程群

200040　上海，　　復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院骨科

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內(nèi)皮祖細(xì)胞與骨折愈合

林上進(jìn)程群

200040上海，復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院骨科

摘要內(nèi)皮祖細(xì)胞具有參與血管再生和修復(fù)的功能，以及分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞和成骨細(xì)胞的潛能，在血管再生和新骨形成方面起到關(guān)鍵作用。骨折時(shí)，內(nèi)皮祖細(xì)胞被動(dòng)員從骨髓遷移至外周循環(huán)來(lái)促進(jìn)骨折愈合。內(nèi)皮祖細(xì)胞的移植治療開(kāi)辟了骨折不愈合新的治療途徑。該文就內(nèi)皮祖細(xì)胞與骨折愈合作一綜述。

關(guān)鍵詞內(nèi)皮祖細(xì)胞；血管發(fā)生；新骨形成；骨折愈合

眾所周知，骨組織內(nèi)的脈管系統(tǒng)對(duì)骨組織重塑、骨生成及穩(wěn)態(tài)平衡有著不可或缺的作用。新的血管發(fā)生不僅對(duì)成骨有促進(jìn)作用，而且對(duì)骨折后骨的修復(fù)起著關(guān)鍵作用，且血管的發(fā)生先于新骨形成[1]。骨折愈合是一個(gè)快速和有效的過(guò)程，它通過(guò)形成骨痂來(lái)填補(bǔ)骨折的裂縫和缺口，但有5%～10%的骨折患者愈合失敗，從而導(dǎo)致延遲愈合或永久不愈合。同時(shí)骨折愈合也是一個(gè)復(fù)雜而連續(xù)的過(guò)程，不僅涉及新骨形成，還存在新生血管再生過(guò)程。嚴(yán)重移位的粉碎性骨折會(huì)大大破壞骨折部位骨組織血管及其血供，從而增加骨折不愈合的風(fēng)險(xiǎn)[2]。在眾多骨折不愈合因素中，新生血管數(shù)量及功能不足是影響骨痂形成和骨痂骨重建最關(guān)鍵的因素之一。而內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)是從骨髓釋放到外周血循環(huán)且具有多種分化潛能如分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞和造血細(xì)胞，從而參與骨折部位新生血管生成和新骨形成的一類細(xì)胞[3]。本文就EPC與骨折愈合作一綜述。

1EPC概述

Asahara等于1997年將體外培養(yǎng)的CD34+EPC成功分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞，這一發(fā)現(xiàn)為血管再生和修復(fù)機(jī)制提供新的解釋，且提示EPC可能參與血管修復(fù)[4]。

1.1分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞參與血管再生

EPC能在骨髓和外周循環(huán)中被發(fā)現(xiàn)，主要分布于骨髓中，外周血中數(shù)量較少，在骨髓中的EPC稱為骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞(BM-EPC)，在外周循環(huán)的EPC稱為循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞(cEPC)，cEPC是BM-EPC從骨髓遷移至外周循環(huán)而來(lái)，它們具有分化為成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞的潛能。前期研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)組織缺血或創(chuàng)傷時(shí)，機(jī)體通過(guò)釋放細(xì)胞因子和趨化因子等動(dòng)員EPC從骨髓遷移到外周血，進(jìn)而遷移到缺血部位且分化為成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞參與新生血管建立。同理，骨折時(shí)EPC從骨髓遷移至外周循環(huán)，進(jìn)而遷移至骨折部位以提高該組織的血管再生能力、新生毛細(xì)血管密度并促進(jìn)新骨形成，從而促使骨折愈合[5]。 Laing等[6]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)人體發(fā)生創(chuàng)傷導(dǎo)致組織缺血時(shí)，cEPC的數(shù)量較正常時(shí)增高，提示當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)組織缺血或血管受損時(shí)，EPC作為一種新型的血管內(nèi)皮前體細(xì)胞從骨髓釋放至外周循環(huán)是對(duì)組織創(chuàng)傷的一種代償反應(yīng)。Yao等[7]向心肌梗塞小鼠模型注射標(biāo)記SPIO的EPC，經(jīng)MRI檢查發(fā)現(xiàn)這些標(biāo)記的EPC聚集在心肌梗塞缺血區(qū)域，這進(jìn)一步證實(shí)EPC具有向缺血部位遷移并分化成血管內(nèi)皮的潛能。關(guān)于機(jī)體促使EPC從骨髓遷移至組織缺血部位及分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的病理生理機(jī)制尚未完全明確，但目前多數(shù)研究認(rèn)為組織損傷釋放的炎性因子、趨化因子、細(xì)胞因子及蛋白水解酶等可能與EPC釋放和遷移有關(guān)。Shen等[8]研究認(rèn)為，白細(xì)胞介素(IL)-8可能是促使EPC遷移至組織缺血部位的重要因子。Huang 等[9]的體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蛋白激酶B(AKT)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)于EPC的遷移、增殖及分化起著不可缺少的作用。Cheng等[10]研究發(fā)現(xiàn)，EPC通過(guò)在心肌缺血區(qū)域高表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(VEGFR)-2、磷酸化蛋白激酶B(pAKT)、一氧化氮(NO)等介質(zhì)來(lái)促進(jìn)血管再生和血管修復(fù)。

1.2分化為成骨細(xì)胞參與新骨形成

EPC不僅具有分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，而且還可能具有分化為成骨細(xì)胞的能力。Bick等[11]在體外實(shí)驗(yàn)中成功將cEPC培育分化為成骨細(xì)胞，提示EPC可能具有分化為成骨細(xì)胞的潛能。 Ford等[12]研究發(fā)現(xiàn)，骨折部位周圍存在一些成骨細(xì)胞能表達(dá)與EPC相同的表面標(biāo)志物CD34。Gossl等[13]研究發(fā)現(xiàn)，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化患者血循環(huán)中表達(dá)骨相關(guān)蛋白和骨鈣素的EPC比例較正常人高，且在早期動(dòng)脈粥樣硬化患者冠狀循環(huán)中還能檢測(cè)到表達(dá)骨鈣素的EPC。Zampetaki等[14]研究發(fā)現(xiàn)，EPC從骨髓被動(dòng)員進(jìn)入外周循環(huán)至血管損傷部位參與血管修復(fù)過(guò)程中，作為血管內(nèi)皮前體細(xì)胞對(duì)骨代謝和血管內(nèi)皮系統(tǒng)產(chǎn)生了影響。Pirro等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在絕經(jīng)后女性體內(nèi)表達(dá)骨鈣素或堿性磷酸酶的CD34+細(xì)胞數(shù)量與機(jī)體內(nèi)骨轉(zhuǎn)化率呈正相關(guān)。Peris等[16]研究認(rèn)為，EPC表達(dá)這些骨相關(guān)蛋白可能會(huì)促使血管鈣化誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化而不僅是參與血管修復(fù)或再生。此外，F(xiàn)lammer等[17]研究發(fā)現(xiàn)在高水平糖化血紅蛋白的糖尿病患者體內(nèi)可檢測(cè)到高濃度的共表達(dá)骨鈣素蛋白的EPC，這也間接表明EPC具有分化成成骨細(xì)胞的潛能并能表達(dá)成骨相關(guān)蛋白。

1.3分期

EPC包含早期EPC和晚期EPC兩個(gè)亞群，每個(gè)亞群的表面標(biāo)志物不相同。早期EPC不成熟，可表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志物CD133和CD34，進(jìn)入分化階段后，造血干細(xì)胞標(biāo)志物逐漸消失，開(kāi)始表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物如血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(VE-cadherin)、血管性血友病因子(vWF)、CD31和一氧化氮合酶，分化成為晚期EPC[18]。目前認(rèn)為早期EPC為CD133+/CD34+/VEGFR-2+，而晚期EPC為CD34+/VEGFR-2+/CD31+/VE-cadherin+/vWF+，明顯失去CD133，并開(kāi)始表達(dá)vWF。但大多數(shù)研究表明，EPC的常用特征性表面標(biāo)志為CD34、CD133及VEGFR-2。CD34是Ⅰ型跨膜糖蛋白，表達(dá)于造血干細(xì)胞、造血祖細(xì)胞、胚胎纖維母細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞表面。CD133是一種5次跨膜的細(xì)胞表面分子，表達(dá)于骨髓和外周血造血干細(xì)胞及EPC表面，是區(qū)分EPC與成熟內(nèi)皮細(xì)胞的主要指標(biāo)。VEGFR-2是一種酪氨酸激酶受體，分布于成熟內(nèi)皮細(xì)胞及EPC表面[19]。因此，目前研究EPC的分離和鑒定主要通過(guò)免疫檢測(cè)CD34、CD133及VEGFR-2表達(dá)情況。此外，EPC在不同發(fā)展階段所具備的作用也不相同。晚期EPC較早期EPC更具有增殖分化能力，而早期EPC則在主動(dòng)分泌血管生長(zhǎng)因子等旁分泌作用方面更甚一籌[16]。Minami 等[20]根據(jù)培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)EPC進(jìn)行分期，將培養(yǎng)基培養(yǎng)3～7 d的EPC定義為早期EPC，培養(yǎng)10～16 d的EPC為中期EPC，培養(yǎng)17～23 d的EPC為晚期EPC，培養(yǎng)24～30 d的EPC為超晚期EPC，發(fā)現(xiàn)晚期EPC增殖分化能力和集落形成能力最強(qiáng)。

1.4影響因素

EPC既是血管內(nèi)皮細(xì)胞前體細(xì)胞，也是成骨細(xì)胞和造血細(xì)胞前體細(xì)胞，是具有游走遷移性、增殖分化及自我更新的定向干細(xì)胞，任何影響其凋亡、增殖、歸巢、分化等生理活動(dòng)的因素或病理狀態(tài)均可使外周循環(huán)EPC數(shù)量減少，進(jìn)而影響血管再生和新骨形成。Toupadakis等[21]研究發(fā)現(xiàn)，AMD3100作為趨化因子受體-4(CXCR4)拮抗劑通過(guò)抑制基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1)/CXCR4軸作用來(lái)動(dòng)員EPC從骨髓向外周循環(huán)釋放，從而增加cEPC的數(shù)量。Huang等[9]研究發(fā)現(xiàn)，每日攝入適量紅酒可提高cEPC水平及改變NO生物利用度而提高EPC功能，從而減少冠心病發(fā)病率。Antonio等[22]研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者cEPC水平較正常人明顯下降，表明高血糖狀態(tài)會(huì)減少cEPC數(shù)量并影響其功能，這是糖尿病患者發(fā)生心血管并發(fā)癥的可能發(fā)病機(jī)制之一。Silva等[23]報(bào)道，長(zhǎng)而持久的運(yùn)動(dòng)會(huì)增加外周循環(huán)VEGF釋放以促進(jìn)cEPC數(shù)量并提高其增殖分化為血管內(nèi)皮的能力。

2EPC在骨折愈合中的作用機(jī)制

骨組織是一種含有豐富血管的組織，它的生長(zhǎng)、重塑及修復(fù)過(guò)程需要血管內(nèi)皮細(xì)胞和骨細(xì)胞存在緊密的時(shí)間和空間聯(lián)系，故影響骨折愈合的主要因素是血供不足及血管-骨偶聯(lián)過(guò)程受到破壞[24]。對(duì)于骨折不愈合或延遲愈合的患者，帶血管蒂自體骨移植或異體骨移植被認(rèn)為是唯一能夠解決骨不連部位血供問(wèn)題的傳統(tǒng)方法，但帶血管蒂骨移植手術(shù)要求術(shù)者具備熟練的顯微血管外科技術(shù)和超長(zhǎng)時(shí)間的手術(shù)操作毅力，此外自體骨移植也有一定的失敗率及移植后并發(fā)癥發(fā)生率，其主要原因是由于移植骨血管再生困難導(dǎo)致的血供不足[25]。而骨組織工程學(xué)和細(xì)胞治療學(xué)在過(guò)去10年內(nèi)的迅速發(fā)展給骨折不愈合治療帶來(lái)了新希望，EPC作為一種新的內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源，參與組織缺血后血管再生、血管內(nèi)皮修復(fù)及組織血循環(huán)復(fù)蘇，在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域上應(yīng)用較多[26]。

當(dāng)機(jī)體發(fā)生骨折導(dǎo)致血管損傷并破壞骨組織的血供及骨的完整性時(shí)，骨折部位向血循環(huán)釋放炎性因子、細(xì)胞因子等炎癥介質(zhì)，細(xì)胞因子動(dòng)員骨髓中的EPC向外周循環(huán)遷移，且靶向到達(dá)缺血部位，從而參與骨折部位骨生成和血管生成，最終盡快恢復(fù)骨折部位血供和促進(jìn)骨折愈合[24]。近期研究[27]發(fā)現(xiàn)，骨折患者外周循環(huán)內(nèi)cEPC數(shù)量在骨折24 h后升高，3 d后達(dá)到高峰，較正常人cEPC數(shù)量明顯增多，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這也支持骨折可以誘發(fā)機(jī)體動(dòng)員EPC從骨髓遷移至外周循環(huán)，最終到達(dá)骨折部位參與骨折愈合修復(fù)的結(jié)論。EPC參與骨生成、血管生成的病理生理機(jī)制和動(dòng)力學(xué)機(jī)制，目前尚未明確。它促進(jìn)骨折愈合的可能機(jī)制有2種：①EPC具有分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞和成骨細(xì)胞的潛能，為兩種細(xì)胞的前體細(xì)胞。大量研究表明，表達(dá)CD34的EPC在體外能分化成成骨細(xì)胞[13]和血管內(nèi)皮細(xì)胞[28-30]以促進(jìn)骨折部位新骨形成和新生血管形成。有學(xué)者[2]為證明這一假設(shè),經(jīng)靜脈注射免疫標(biāo)記的CD34+細(xì)胞至骨折動(dòng)物模型內(nèi)，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞被靶向遷移至骨折部位且2周后表達(dá)出與人類特有的內(nèi)皮細(xì)胞和成骨細(xì)胞相同的細(xì)胞表面標(biāo)志物。②EPC通過(guò)旁分泌機(jī)制分泌VEGF來(lái)促進(jìn)血管內(nèi)皮生成和新生骨形成。Kuroda等[31]研究發(fā)現(xiàn)，靜脈注射VEGF拮抗劑組骨折部位血管內(nèi)皮細(xì)胞和成骨細(xì)胞數(shù)量較未注射組明顯減少，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Li等[32]研究發(fā)現(xiàn)，將帶有VEGF基因的纖維母細(xì)胞移植至兔骨折模型可明顯促進(jìn)骨折愈合。Pufe等[33]研究發(fā)現(xiàn)，骨折愈合早期VEGF對(duì)骨折愈合起非常重要的作用，且VEGF的峰值在骨折5 d后開(kāi)始逐漸下降。Li等[34]移植EPC支架至大鼠骨折部位來(lái)促進(jìn)骨折愈合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)骨折部位VEGF基因表達(dá)明顯升高。骨折引起的缺血和VEGF釋放可促進(jìn)新生毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)-2和上調(diào)BMP-2 mRNA表達(dá)，BMP-2作為成骨因子對(duì)新生骨形成起直接促進(jìn)作用[35]。因此，當(dāng)骨折發(fā)生時(shí)EPC在骨折部位釋放的炎性因子、細(xì)胞因子、趨化因子等介導(dǎo)下從骨髓遷移至外周血循環(huán)，再被靶向招募至骨折部位，然后EPC分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞和成骨細(xì)胞并釋放VEGF，從而為骨折愈合和血流恢復(fù)提供最適宜的微環(huán)境。

3 EPC在骨折愈合中的應(yīng)用

EPC作為新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的祖細(xì)胞，能對(duì)缺血組織進(jìn)行反應(yīng)并在第一時(shí)間進(jìn)入缺血部位以刺激新生血管形成和修復(fù)損傷組織，它還具有分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞和成骨細(xì)胞的潛能，以及快速增殖的能力。但EPC對(duì)骨折愈合的治療目前主要處于臨床前研究階段，臨床應(yīng)用至今報(bào)道較少。

EPC移植治療研究主要可分為2個(gè)階段：①經(jīng)靜脈注射進(jìn)行EPC移植治療來(lái)觀察血管損傷修復(fù)的效果，主要應(yīng)用在心血管系統(tǒng)疾病治療方面。Fang等[36]通過(guò)兔子耳緣靜脈注射體外擴(kuò)增的自體EPC來(lái)促進(jìn)動(dòng)脈瘤修復(fù)和內(nèi)皮增生。Iwasaki等[37]通過(guò)靜脈注射人EPC促進(jìn)大鼠心肌和血管再生來(lái)恢復(fù)心肌泵血功能。Matsumoto等[38]通過(guò)靜脈注射人EPC來(lái)促進(jìn)壞死骨組織的血管修復(fù)和新生血管形成，進(jìn)而促進(jìn)骨折愈合。②通過(guò)生物載體進(jìn)行EPC局部移植來(lái)促進(jìn)骨折愈合效果，主要應(yīng)用于骨折愈合或創(chuàng)傷骨科方面。鑒于靜脈注射EPC是全身性反應(yīng)，移植的EPC不僅能有效促進(jìn)骨折愈合，而且這些細(xì)胞還會(huì)遷移至其他組織和器官如肺、肝、胸腺、腦等，可能在骨外組織產(chǎn)生一些無(wú)法預(yù)見(jiàn)和控制的遠(yuǎn)期影響，故目前EPC對(duì)骨折愈合影響的研究基本采用局部移植方法。Rozen等[39]在兔骨折模型骨折端之間人為構(gòu)建一楔形纖維竇道，移植預(yù)先在體外擴(kuò)增的EPC至該纖維竇道中，經(jīng)顯微CT檢查發(fā)現(xiàn)EPC局部移植能在骨折缺損處促進(jìn)形成大量致密的編織骨以達(dá)到骨折愈合。Atesok等[40]在大鼠股骨骨折模型中運(yùn)用無(wú)菌明膠海綿載體局部移植EPC，發(fā)現(xiàn)EPC移植治療組骨折全部愈合，而對(duì)照組骨折全部不愈合。Li等[2]利用明膠海綿為載體局部移植EPC治療大鼠股骨骨折，發(fā)現(xiàn)局部EPC移植治療不僅能促進(jìn)骨折愈合，還能提高骨的微結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)穩(wěn)定性。以上研究均提示，EPC對(duì)于骨折尤其是骨折延遲愈合、骨折不愈合和骨組織缺損患者有潛在而明顯的治療效果?；谝陨涎芯浚琄uroda等[41]首次進(jìn)行運(yùn)用自體EPC治療骨折不愈合的病例報(bào)道，他們運(yùn)用膠原蛋白支架來(lái)承載粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)動(dòng)員的自體EPC并采用髂前上棘進(jìn)行自體骨移植，將支架移植至脛骨不愈合斷端，結(jié)果顯示患者術(shù)后無(wú)嚴(yán)重不良事件發(fā)生，且在術(shù)后9個(gè)月骨折成功愈合。隨后Kuroda等[42]又運(yùn)用膠原蛋白支架承載G-CSF動(dòng)員的自體EPC移植治療7例骨折不愈合，術(shù)后隨訪1年，結(jié)果無(wú)不良及嚴(yán)重并發(fā)癥出現(xiàn)，且術(shù)后12周5例(71.4%)達(dá)到影像學(xué)骨折愈合，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)根據(jù)歷史資料制定的預(yù)先設(shè)定閾值(18.1%)。隨著臨床Ⅰ/Ⅱa期實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，EPC移植治療在人體實(shí)驗(yàn)中獲得較大的成就，且獲得和分離創(chuàng)傷小、安全、有效，不像骨髓間質(zhì)干細(xì)胞只能麻醉下通過(guò)手術(shù)從骨髓中提取[43]，這些都對(duì)EPC 在骨折不愈合中的應(yīng)用具有巨大的推動(dòng)作用。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和有限的體內(nèi)研究顯示，EPC能明顯促進(jìn)新生血管生成和新生骨形成，提高骨折愈合能力。但血管形成與骨發(fā)生在空間和時(shí)序上有怎樣的聯(lián)系；它們對(duì)骨轉(zhuǎn)換和破骨細(xì)胞的功能作用如何；既然EPC具有分化為成骨細(xì)胞的潛能，那么EPC在骨質(zhì)疏松性骨折，甚至預(yù)防和治療成骨功能低下引起的骨質(zhì)疏松癥方面是否也同樣有效，這需要對(duì)EPC促進(jìn)骨折愈合的分子生物學(xué)機(jī)制進(jìn)一步理解和探索。相信在不久的將來(lái)，體外擴(kuò)增的自體EPC移植治療將會(huì)成為骨折不愈合的重要治療策略。

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(收稿：2015-04-29; 修回：2015-11-30)

(本文編輯：盧千語(yǔ))

DOI：10.3969/j.issn.1673-7083.2016.01.008

通信作者：程群E-mail: quncheng_2014@163.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81471089)、上海市衛(wèi)生系統(tǒng)重要疾病聯(lián)合攻關(guān)項(xiàng)目(2013ZYJB0801)