付曉森，劉鳳軍，張玉玲，董文亞，李毅恒，劉向陽(yáng)

(河南科技大學(xué)，河南洛陽(yáng) 471003)

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誘導(dǎo)多能干細(xì)胞治療動(dòng)物骨骼病的研究進(jìn)展

付曉森，劉鳳軍*，張玉玲，董文亞，李毅恒，劉向陽(yáng)

(河南科技大學(xué)，河南洛陽(yáng) 471003)

摘要:由于骨骼疾病恢復(fù)所需時(shí)間較長(zhǎng)、動(dòng)物不配合治療等原因，給動(dòng)物骨骼疾病治療帶來(lái)了較大困難，縮短治療周期將會(huì)大大提高動(dòng)物骨骼疾病治療的成功率，而傳統(tǒng)方法已無(wú)法再超越目前的治療周期。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(IPS)具有強(qiáng)大的增殖和分化能力，可分化為修復(fù)骨骼病所需的多種細(xì)胞以及細(xì)胞因子等，這為加速動(dòng)物骨骼疾病痊愈帶來(lái)了新的希望。論文對(duì)IPS的研發(fā)歷程及優(yōu)勢(shì)，IPS向骨細(xì)胞分化，IPS在治療骨骼病中的應(yīng)用等方面進(jìn)行了綜述，并對(duì)其治療動(dòng)物骨折的前景進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞:多能干細(xì)胞；誘導(dǎo)分化；動(dòng)物骨骼疾??；骨細(xì)胞；治療

以動(dòng)物骨折為代表的動(dòng)物骨骼病在畜牧生產(chǎn)和獸醫(yī)臨床上非常常見(jiàn)，對(duì)于一般性生產(chǎn)動(dòng)物可以選擇直接淘汰，但對(duì)于具有較高價(jià)值的珍稀野生動(dòng)物、種畜、特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物、寵物等要進(jìn)行積極治療。骨折是指骨結(jié)構(gòu)的連續(xù)性完全或部分?jǐn)嗔选９钦蹠?huì)給患者帶來(lái)極大疼痛，并影響其正常生活，嚴(yán)重者會(huì)造成殘疾(如體態(tài)畸形、肢體殘缺等)[1]，甚至危及生命。骨折若經(jīng)及時(shí)恰當(dāng)處理，多數(shù)病例能恢復(fù)原來(lái)的功能，少數(shù)病例可能遺留不同程度的后遺癥(如關(guān)節(jié)僵硬或強(qiáng)直等)。

動(dòng)物不愿配合治療及骨折愈合所需時(shí)間較長(zhǎng)都嚴(yán)重影響動(dòng)物骨折的治療效果。隨著人類醫(yī)學(xué)的發(fā)展，許多治療骨折的理論、方法、技術(shù)已廣泛應(yīng)用到動(dòng)物骨折治療中，如外固定技術(shù)和內(nèi)固定技術(shù)。外固定具有固定可靠、骨折愈合快、功能恢復(fù)好、治療費(fèi)用低、并發(fā)癥少等優(yōu)點(diǎn)，但固定太松或固定墊使用不當(dāng)易出現(xiàn)骨折再移位，固定太緊可導(dǎo)致壓迫性潰瘍、缺血性肌痙攣，甚至肢體壞疽；內(nèi)固定主要用于切開(kāi)復(fù)位后，采用金屬內(nèi)固定物，將骨折斷端復(fù)位后予以固定，優(yōu)點(diǎn)是可以較好地保持骨折的解剖復(fù)位，缺點(diǎn)是固定物屬機(jī)體異物，在其下面及周圍易發(fā)生骨質(zhì)疏松或者松動(dòng)，且一旦感染，將會(huì)嚴(yán)重地阻礙傷口和骨折愈合。同時(shí)，安置內(nèi)固定物時(shí)，需廣泛剝離軟組織和骨膜，影響血液運(yùn)輸，延遲骨折愈合。此外，在骨折治療過(guò)程中，動(dòng)物常掙扎反抗，不配合治療，這使得獸醫(yī)不得不把骨折部位固定相對(duì)牢固，這可造成骨折延遲愈合或不愈合及恢復(fù)期內(nèi)因缺乏活動(dòng)導(dǎo)致的肌肉萎縮。即使把骨折處固定好后，動(dòng)物也會(huì)隨著機(jī)體恢復(fù)而抓、啃、蹭骨折固定部位，影響骨折愈合效果。因此，如何加速動(dòng)物骨折愈合對(duì)獸醫(yī)來(lái)說(shuō)也是一個(gè)難題。

干細(xì)胞研究為加速骨折愈合帶來(lái)了新希望。干細(xì)胞具有強(qiáng)大的再生、分化能力，可以分化成多種類型的細(xì)胞及組織器官，其中包括骨細(xì)胞及軟骨組織。干細(xì)胞之所以能加速骨折愈合，是因?yàn)樗梢约铀傩迯?fù)損傷的骨組織或分化成骨組織，然后通過(guò)移植替代相應(yīng)的受損骨組織，進(jìn)而使機(jī)體恢復(fù)到受傷前的狀態(tài)[2-5]。目前已知胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ES)、間充質(zhì)干細(xì)胞等干細(xì)胞可以修復(fù)骨骼，而最近興起的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，IPS)除了可以分化出多種類型細(xì)胞和一些組織外也具有同樣的修復(fù)能力。論文就近年來(lái)國(guó)內(nèi)外在IPS向骨細(xì)胞分化及其在骨骼病的研究應(yīng)用進(jìn)行了綜述和展望。

1IPS研究概況

IPS是通過(guò)采用導(dǎo)入外源基因的方法使體細(xì)胞去分化為多能干細(xì)胞，具有與ES相似的細(xì)胞全能性，在一定條件下，可分化為多種功能細(xì)胞或組織器官。最早由日本的兩位科學(xué)家Yamanaka K和Takahashi S于2006年報(bào)道的[6]，他們把Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4這4種轉(zhuǎn)錄因子基因克隆入病毒載體，然后引入小鼠成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)其發(fā)生轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生的IPS細(xì)胞在形態(tài)、基因和蛋白表達(dá)、表觀遺傳修飾狀態(tài)、細(xì)胞倍增能力、類胚體和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都與ES相似。與ES相比，IPS不會(huì)面臨長(zhǎng)期困擾ES研究與應(yīng)用在法律、倫理道德等方面的問(wèn)題，由于是使用同一機(jī)體的細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化移植因而基本不會(huì)產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)；與成體干細(xì)胞相比，IPS來(lái)源廣泛、取材方便，并且可以向更多細(xì)胞類型、更廣方向分化。可見(jiàn)，IPS可謂是集ES與成體干細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)于一體。

IPS給再生醫(yī)學(xué)和臨床治療疾病帶來(lái)了新希望。Karumbayaram S等用IPS首次分化出人運(yùn)動(dòng)神經(jīng)細(xì)胞。之后，科學(xué)家們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)IPS還可分化為血小板、抗癌細(xì)胞、胰腺、色素細(xì)胞、軟骨組織、牙齒等[7-8]。最令人驚喜的是IPS的四倍體補(bǔ)償試驗(yàn)和利用IPS克隆出活體試驗(yàn)小鼠，這證明IPS與ES一樣具有全能性，同時(shí)也為IPS臨床應(yīng)用的研究注入了新的活力[9]。這些研究表明，IPS有修復(fù)動(dòng)物骨折的潛能。

2IPS向骨細(xì)胞分化

IPS通過(guò)誘導(dǎo)分化出與骨發(fā)育密切相關(guān)的因子或細(xì)胞，在骨折修復(fù)中起促進(jìn)作用。骨組織中的成骨蛋白、骨鈣蛋白、骨粘連蛋白與骨發(fā)育、骨修復(fù)密切相關(guān)；同時(shí)，骨細(xì)胞中的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞是參與骨形成(即骨化)的主要細(xì)胞。調(diào)控成骨細(xì)胞發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子主要有Sox9、Runx2、Dlx5、Twist1等，調(diào)控破骨細(xì)胞發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子主要有RANKL、M-CSF、PU.1、MITF、c-FOS等，這些轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞偶聯(lián)，在骨發(fā)育、骨重塑、骨修復(fù)的全過(guò)程中都是非常重要的[10]。

學(xué)者們?cè)谶@方面進(jìn)行了嘗試，并取得了一定成果。2011年，Bilousova G等利用IPS技術(shù)成功地分化出小鼠軟骨細(xì)胞。2012年，Hayashi T等發(fā)現(xiàn)IPS向骨分化過(guò)程的第3周骨鈣蛋白表達(dá)最高。2014年，Phillips M D等[11]讓IPS分別在體內(nèi)和體外向骨細(xì)胞分化，結(jié)果顯示都可以向骨細(xì)胞分化。

TheinHan W等先將IPS分化為間充質(zhì)干細(xì)胞，然后使用分化劑誘導(dǎo)其向骨分化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有肌動(dòng)蛋白纖維表達(dá)、成骨細(xì)胞存在并有礦化基質(zhì)形成。任秋穎等[12]在小鼠IPS骨向分化過(guò)程中添加成骨蛋白7(BMP7)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組的礦化結(jié)節(jié)率明顯增高。 Kato H[13]的課題組把1,25-二羥基維生素D3加到IPS向骨細(xì)胞分化培養(yǎng)液中，6 d后觀察有成骨細(xì)胞出現(xiàn)。伊朗醫(yī)學(xué)家Ardeshirylajimi A和Soleimani M[14]把將要向骨細(xì)胞分化的IPS放到極低頻電磁場(chǎng)(50 Hz)下進(jìn)行培養(yǎng)，一段時(shí)間后用MTT法測(cè)定發(fā)現(xiàn)，被標(biāo)記的堿性磷酸酶(ALP)活性增強(qiáng)、鈣物質(zhì)沉積增多，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在一定范圍內(nèi)適當(dāng)增加極低頻電磁場(chǎng)強(qiáng)度，以上指標(biāo)會(huì)有所提高。這些研究為IPS向骨細(xì)胞分化提供了新方法、新思路，為后續(xù)相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

3干細(xì)胞治療骨骼病

干細(xì)胞治療是把健康的干細(xì)胞移植到病人或自己體內(nèi)，以達(dá)到修復(fù)病變組織器官或重建功能正常的組織器官的目的。干細(xì)胞療法就像給機(jī)體注入新的活力，是從根本上治療許多疾病的有效方法。干細(xì)胞治療最早始于1956年，美國(guó)醫(yī)生Thomas E D應(yīng)用雙胞胎間的骨髓移植成功地治療了白血病，開(kāi)啟了干細(xì)胞治療疾病的新時(shí)代。到目前為止，人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞可以改善心臟功能、治療Ⅰ型糖尿病[15]、緩解帕金森癥狀、修復(fù)視網(wǎng)膜[16]等。這些臨床試驗(yàn)為干細(xì)胞應(yīng)用于臨床打下了基礎(chǔ)。

干細(xì)胞治療骨骼疾病的探索始于20世紀(jì)末，并取得了初步的成果。1991年Connolly J F利用自體骨髓血移植成功治療了脛骨骨折遷延不愈； 1999年Horwitz E M等通過(guò)自體骨髓間充質(zhì)細(xì)胞移植治療兒童成骨不全癥，取得了不錯(cuò)的效果。2003年Tsuchida H等[2]從大鼠體內(nèi)提取間充質(zhì)干細(xì)胞并對(duì)其成骨蛋白2基因進(jìn)行了修飾，然后將其應(yīng)用于有股骨節(jié)段性缺陷的大鼠，結(jié)果顯示大鼠的股骨得到了修復(fù)。這為同種異體動(dòng)物間進(jìn)行干細(xì)胞治療骨折提供了科學(xué)依據(jù)，開(kāi)辟了干細(xì)胞治療骨骼疾病的新紀(jì)元。

2011年Xue G等將培養(yǎng)純化好的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，通過(guò)靜脈注射的方式輸入有骨折不愈合和神經(jīng)受損的患者體內(nèi)，治療2個(gè)月后患者骨折處有愈合并對(duì)外界反應(yīng)變得靈敏，1年后對(duì)患者進(jìn)行隨訪觀察，基本沒(méi)有副作用。2012年Obermeyer T S等探討了濫用酒精和靜脈注射間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)小鼠脛骨骨折模型骨折愈合的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，濫用酒精會(huì)明顯降低骨折的修復(fù)速度，但應(yīng)用間充質(zhì)干細(xì)胞治療可以提高其修復(fù)速度。2015年Wang P等[17]對(duì)IPS、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和臍帶干細(xì)胞向骨分化能力的比較，將上述3種干細(xì)胞分別移植到顱骨缺損的不同大鼠身上，12周后對(duì)長(zhǎng)出的骨面積分析比較，結(jié)果顯示差異不顯著，說(shuō)明這3種干細(xì)胞向骨分化的能力相當(dāng)。

近年來(lái)，新型材料與干細(xì)胞結(jié)合應(yīng)用到骨折治療研究上。Kingham E[18]研究團(tuán)隊(duì)在塑性材料表面上培養(yǎng)人ES并評(píng)估其向骨細(xì)胞分化的能力，以期將來(lái)把塑性材料和培養(yǎng)好的細(xì)胞直接作用到骨折處修復(fù)損傷。Bradley F等[19]發(fā)明了一種剛硬輕型塑料，其可被患者自己的干細(xì)胞植入附著，并生長(zhǎng)出新的骨細(xì)胞，這種塑料會(huì)隨著新的骨組織生長(zhǎng)逐漸地發(fā)生降解而被替換，這種方法將來(lái)很可能用來(lái)治療粉碎性骨折。

4IPS治療骨骼病

IPS誘導(dǎo)分化為間充質(zhì)干細(xì)胞后，能夠間接用于骨組織的再生與修復(fù)。骨是由胚胎時(shí)期的間充質(zhì)細(xì)胞分化發(fā)育來(lái)的，很多試驗(yàn)已經(jīng)證明，間充質(zhì)干細(xì)胞可以分化為骨系細(xì)胞并形成軟骨和骨[20]，有些試驗(yàn)成果已經(jīng)應(yīng)用于臨床治療。

目前，獸醫(yī)臨床上用于治療骨骼疾病的干細(xì)胞主要是間充質(zhì)干細(xì)胞，而且取得了不錯(cuò)的成績(jī)[21]。由于間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源有限、傳代后分化能力減弱，推廣應(yīng)用受到限制。而IPS分化為間充質(zhì)干細(xì)胞，為其間接向骨系細(xì)胞分化注入了活力，有試驗(yàn)證明源于IPS的間充質(zhì)干細(xì)胞比直接從骨髓獲取的間充質(zhì)干細(xì)胞更有活力，并且一樣可以分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞。另有試驗(yàn)報(bào)道[22]， IPS分化成間充質(zhì)干細(xì)胞后，將其移植到有牙周缺陷的小鼠體內(nèi)，隨后發(fā)現(xiàn)移植部位有礦化組織形成，這為IPS分化為間充質(zhì)干細(xì)胞后治療骨折開(kāi)辟了新思路。

對(duì)于該領(lǐng)域的研究，值得一提的是2012年美國(guó)科學(xué)家Diekman B O等[5]利用IPS技術(shù)在體外培養(yǎng)下分化出軟骨組織。他們先建立了體外軟骨缺損模型，然后把導(dǎo)入有綠色熒光蛋白(GFP)基因的IPS進(jìn)行骨化培養(yǎng)，隨后將培養(yǎng)的細(xì)胞移植到軟骨缺損模型上。21 d后，通過(guò)觀察綠色熒光蛋白確定有軟骨基質(zhì)生成與集合，軟骨缺損部位周圍出現(xiàn)軟骨組織。這是科學(xué)家首次利用IPS技術(shù)獲得的成型骨結(jié)構(gòu)。

IPS分化為成型再生器官——牙齒。2013年中國(guó)科學(xué)家成功利用人尿液IPS獲得了再生牙齒[23]。他們首先把ifhU-iPSCs(人的IPS)分化上皮細(xì)胞,并與牙齒缺失老鼠的牙間質(zhì)結(jié)合。3周后有30%的老鼠牙間質(zhì)出現(xiàn)牙齒結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)分化出的牙齒擁有與人類牙齒相似的結(jié)構(gòu)和硬度。這是科學(xué)家首次利用人IPS獲得成型的再生器官，為將來(lái)IPS技術(shù)應(yīng)用于器官再生奠定了基礎(chǔ)。

5展望

雖然IPS技術(shù)在向骨細(xì)胞分化方面取得了一定的成果[24]，尤其是在軟骨受損和骨關(guān)節(jié)炎研究方面。但是還存在一些問(wèn)題，如IPS面臨沒(méi)有統(tǒng)一規(guī)范的誘導(dǎo)步驟、誘導(dǎo)率低、可能形成腫瘤、帶有表觀遺傳記憶、基因組不穩(wěn)定等[25]，但其在治療動(dòng)物疾病的應(yīng)用上前景廣闊。

首先，可操作性較強(qiáng)。目前干細(xì)胞治療在醫(yī)學(xué)上取得了一定的成果，但由于缺乏統(tǒng)一治療標(biāo)準(zhǔn)和存在產(chǎn)生腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)以及法律方面的限制，其在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用和推廣受到限制。而動(dòng)物方面面臨的問(wèn)題相比要少得多：一方面，在進(jìn)行動(dòng)物治療前可以先用其他動(dòng)物進(jìn)行治療試驗(yàn)，然后評(píng)價(jià)治療的效果和存在的風(fēng)險(xiǎn)，最后決定是否進(jìn)行治療及如何進(jìn)行治療；另一方面，動(dòng)物治療涉及的法律問(wèn)題較少、監(jiān)管相對(duì)寬松，方便進(jìn)行試驗(yàn)和治療。

其次，經(jīng)濟(jì)效益前景廣闊。具有治療價(jià)值的動(dòng)物除了野生動(dòng)物和種畜外，另一個(gè)不容忽視的大群體就是寵物。隨著寵物飼養(yǎng)量的日益增多，車禍、打斗、高處墜落等原因造成的寵物骨折數(shù)量也在上升，開(kāi)篇提到的動(dòng)物骨折延遲愈合或不愈合問(wèn)題在寵物上凸顯出來(lái)。在發(fā)達(dá)國(guó)家，有些動(dòng)物醫(yī)院已經(jīng)開(kāi)始使用干細(xì)胞治療寵物骨骼疾病，且寵物恢復(fù)良好。據(jù)悉，一例寵物干細(xì)胞治療的費(fèi)用大約在2 000元。截止2013年，中國(guó)寵物的數(shù)量大約有1.2億只，而且數(shù)量還在持續(xù)快速增長(zhǎng)。而用傳統(tǒng)手術(shù)方法治療一例骨折的費(fèi)用從1 500元到上萬(wàn)元不等，因而干細(xì)胞治療的費(fèi)用并不算高，而且與手術(shù)治療相比干細(xì)胞治療風(fēng)險(xiǎn)要小的多。大體估算目前我國(guó)寵物發(fā)生骨折的概率是千分之一，而采用干細(xì)胞治療骨折的概率是十分之一，那么每年至少可產(chǎn)生2 400萬(wàn)元的經(jīng)濟(jì)效益。隨著干細(xì)胞治療技術(shù)逐漸成熟，進(jìn)行干細(xì)胞治療的動(dòng)物會(huì)越來(lái)越多，而產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)效益則會(huì)快速增長(zhǎng)。

綜上所述，盡管目前IPS治療骨折的技術(shù)尚不成熟，存在著一些不足，但相信隨著ISP技術(shù)的發(fā)展，安全、高效的IPS技術(shù)治療動(dòng)物骨折終將取得突破并實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用，同時(shí)也將產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)價(jià)值。

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Progress on Treatment of Animal Orthopedic Diseases with Induced Pluripotent Stem Cells

FU Xiao-sen，LIU Feng-jun，ZHANG Yu-ling，DONG Wen-ya，LI Yi-heng，LIU Xiang-yang

(HenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang,Henan,471003，China)

Abstract:Greater difficulties to treat animal orthopedic diseases were the longer recovery duration and uncooperative animals during treatment.Thus,shortening the treatment period may greatly improve the success rate of treatment of animal bone diseases,but traditional methods cannot exceed the current treatment cycle.Induced pluripotent stem cells (IPS) with a strong proliferation and differentiation can differentiate into a variety of cells and factors needed to repair bone disease,which bring new hope to accelerate healing of animal orthopedic diseases.This paper reviewed the research and development process of IPS,its advantages,differentiation into bone cells,and application to treat orthopedic diseases.Meanwhile,the paper also fores the prospects of IPS treatment for animal bone fracture.

Key words:pluripotent stem cell；induced differentiate；animal orthopedic disease；bone cell；treatment

文章編號(hào):1007-5038(2016)03-0099-04

中圖分類號(hào):S857.161

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

作者簡(jiǎn)介：付曉森(1989-)，男，河南安陽(yáng)人，碩士研究生，主要從事小動(dòng)物疾病防治研究。*通訊作者

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30901026);河南省高等學(xué)校青年骨干教師資助計(jì)劃項(xiàng)目(2010GGJS-071)

收稿日期：2015-07-20