甘慧泉 林 婷 甘文佳 羅燕飛*

(1廣東省人民醫(yī)院，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，病理醫(yī)學(xué)部檢驗(yàn)科，廣東 廣州 510080；2中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510080)

·論著·

丁型肝炎病毒抗體IgM與乙肝表面抗原相關(guān)性探討

甘慧泉1林 婷1甘文佳2羅燕飛1*

(1廣東省人民醫(yī)院，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，病理醫(yī)學(xué)部檢驗(yàn)科，廣東 廣州 510080；2中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510080)

目的:探討酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)丁型肝炎病毒抗體IgM(抗-HD IgM)與乙肝表面抗原(HBsAg)之間的相關(guān)性。方法：檢測(cè)某三甲醫(yī)院4 428例門(mén)診和住院患者抗-HD IgM；經(jīng)阻斷試驗(yàn)和巰基乙醇破壞試驗(yàn)后確認(rèn)抗-HD IgM真假陽(yáng)性；真陽(yáng)性樣品同時(shí)用ELISA和電化學(xué)發(fā)光法(ELC)檢測(cè)HBsAg；假陽(yáng)性樣品進(jìn)行類(lèi)風(fēng)濕因子(RF)的檢測(cè)。結(jié)果：經(jīng)ELISA檢測(cè)有155例抗-HD IgM陽(yáng)性樣品，確認(rèn)有118例是真陽(yáng)性、37例假陽(yáng)性。118例抗-HD IgM真陽(yáng)性樣品用ELISA和 ELC法檢測(cè)HBsAg都有超過(guò)50%是陰性；37例抗-HD IgM假陽(yáng)性樣品有28例RF陽(yáng)性。結(jié)論：抗-HD IgM陽(yáng)性同時(shí)HBsAg陰性主要可能是HBV隱匿性感染；HDV急性感染時(shí)HBsAg大量消耗、濃度太低、難以檢測(cè)等原因。

丁型肝炎；阻斷試驗(yàn)；巰基乙醇破壞試驗(yàn)

丁型肝炎病毒由意大利學(xué)者Rizzetto于1977年發(fā)現(xiàn)，是一種單負(fù)鏈RNA缺陷性病毒，只有在HBV已經(jīng)存在于肝內(nèi)或者同時(shí)侵入肝內(nèi)才能建立感染[1]。其合成與復(fù)制必須依賴(lài)HBV提供的蛋白包膜，其衣殼為HBsAg，故理論上HDV的感染應(yīng)該以HBsAg“+”為前提。在實(shí)際臨床工作中，我們發(fā)現(xiàn)有相當(dāng)數(shù)量的抗HD-IgM陽(yáng)性患者，其乙肝血清學(xué)標(biāo)志物中HBsAg陰性。本研究回顧性分析2013年1月至2015年12月某三甲醫(yī)院檢測(cè)的抗-HD IgM陽(yáng)性樣品的乙肝病毒標(biāo)志物的模式(HBV-M)資料，旨在探討酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)丁型肝炎病毒抗體IgM(抗-HD IgM)與HBsAg之間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本組患者4 428例，男2 341例，女2 087例；年齡16～92歲，平均年齡(34.31±3.67)歲。

1.2 儀器與試劑

Multiskan MK3酶標(biāo)儀(英國(guó)雷勃公司)；Microlab?AT plus2、FAME 24/20(瑞士哈美頓公司)；丁肝抗原、HDV-IgM檢測(cè)試劑盒、HBsAg檢測(cè)試劑盒(中山生物公司)；羅氏E170電化學(xué)發(fā)光儀、HBsAg電化學(xué)發(fā)光試劑盒(羅氏公司)；類(lèi)風(fēng)濕因子試劑盒、IMMAGE800特種蛋白分析儀(貝克曼公司)。

1.3 方法

1.3.1 抗HD-IgM檢測(cè) 4 428例血清樣品按照抗HD-IgM檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)和結(jié)果判斷。

1.3.2 特異性阻斷試驗(yàn) 抗HD-IgM檢測(cè)陽(yáng)性的血清樣品、抗-HD IgM檢測(cè)試劑盒配備的陰性、陽(yáng)性對(duì)照血清均一式兩份，分為對(duì)照組和試驗(yàn)組：對(duì)照組直接用抗-HD IgM檢測(cè)試劑盒測(cè)定抗-HD IgM 抗體，檢測(cè)OD值為A；試驗(yàn)組樣品分別與丁肝抗原1∶10混勻，37 ℃中和1 h。離心后取上清,用抗-HD IgM檢測(cè)試劑盒測(cè)定抗-HD IgM 抗體，試劑盒要求樣品與生理鹽水1∶10稀釋?zhuān)捎谥芭c丁肝抗原混合時(shí)已經(jīng)相當(dāng)于同倍數(shù)稀釋?zhuān)试摬襟E省略，其余步驟不變，檢測(cè)OD值為B。(A-B)/A>0.5，即阻斷試驗(yàn)陽(yáng)性。

1.3.3 2-巰基乙醇破壞試驗(yàn) 取特異性阻斷試驗(yàn)陽(yáng)性的血清樣品、抗-HD IgM檢測(cè)試劑盒配備的陽(yáng)性對(duì)照各0.1 mL ,用PBS 稀釋5倍,分成試驗(yàn)組和對(duì)照組：試驗(yàn)組中加入等量0.2 mol/L 2-巰基乙醇,對(duì)照組中加入等量PBS ,同時(shí)置37 ℃作用1 h，然后用抗-HD IgM檢測(cè)試劑盒檢測(cè)(試劑盒要求樣品稀釋10倍，而之前用PBS稀釋5倍，又與巰基乙醇等量混合,相當(dāng)于等同倍數(shù)稀釋?zhuān)试摬襟E省略，其余步驟不變)。結(jié)果按照抗HD-IgM檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)判斷，抗-HD IgM結(jié)果陰性即巰基乙醇試驗(yàn)陽(yáng)性，反之則巰基乙醇試驗(yàn)陰性。

1.3.4 特異性阻斷試驗(yàn)和2-巰基乙醇破壞試驗(yàn) 均陽(yáng)性的血清樣品用HBsAg檢測(cè)試劑盒(ELISA法)和羅氏的HBsAg電化學(xué)發(fā)光試劑盒(ELC法)進(jìn)行檢測(cè)。操作均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.5 類(lèi)風(fēng)濕因子(RF)檢測(cè) 將抗HD-IgM假陽(yáng)性樣品進(jìn)行RF檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，對(duì)結(jié)果進(jìn)行McNemar卡方檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

4 428例樣品中155例抗HD-IgM檢測(cè)陽(yáng)性，其中121例特異性阻斷試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性；121例特異性阻斷試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性樣品中118例巰基乙醇試驗(yàn)陽(yáng)性。兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

118例抗-HD真陽(yáng)性樣品經(jīng)ELC和ELISA法檢測(cè)HBsAg，分別有70例和74例陰性，組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

37例抗HD-IgM假陽(yáng)性樣品檢測(cè)RF，有28例陽(yáng)性，陽(yáng)性率75.68%。

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，抗HD-IgM陽(yáng)性與HBV-M不符的部分原因是所用抗-HD IgM試劑盒檢測(cè)的假陽(yáng)性問(wèn)題。近年來(lái)有不少文獻(xiàn)報(bào)道RF對(duì)病毒性肝炎抗體檢測(cè)的影響。尤其是對(duì)IgM類(lèi)抗體檢測(cè)的影響。目前國(guó)內(nèi)使用的ELISA法檢IgM類(lèi)抗體的試劑盒主要用抗μ鏈為固相抗原，RF能與包被的抗拌鏈的Fc段結(jié)合。類(lèi)風(fēng)濕因子、高免疫球蛋白血癥、高濃度IgM等因素的干擾[2]導(dǎo)致部分抗-HD IgM假陽(yáng)性，從本文試驗(yàn)結(jié)果知道，這種干擾作用不容忽視。而之前所推斷HBsAg假陰性問(wèn)題，在本試驗(yàn)中顯示并非主要原因。結(jié)合實(shí)際情況：本室在做HBsAg檢測(cè)時(shí)一直使用衛(wèi)生部臨檢中心的相關(guān)質(zhì)控物，并嚴(yán)格遵守操作規(guī)程：一旦發(fā)現(xiàn)失控，則整板重新再做。所開(kāi)展的其他肝炎項(xiàng)目(除HEV外)也配備有衛(wèi)生部臨檢中心所售的質(zhì)控物作為日常工作的監(jiān)控，每年也均有數(shù)次參加全國(guó)、省級(jí)相關(guān)部門(mén)的室間質(zhì)評(píng)活動(dòng)；而抗-HD IgM的檢測(cè)尚無(wú)相關(guān)質(zhì)控物，更無(wú)從參與上述活動(dòng)。這種現(xiàn)狀在某種程度上影響了日常工作中對(duì)該項(xiàng)目的準(zhǔn)確檢測(cè)。

試驗(yàn)中仍然有60%左右的抗-HD真陽(yáng)性樣品HBsAg陰性?？赡芘c下列原因有關(guān)：①隱匿性乙型肝炎病毒感染( occult hepatitis B virus infection，OBI)的流行。OBI 是指在感染者肝臟中能夠檢出 HBV DNA 而 HBsAg 呈陰性的狀態(tài)。現(xiàn)有的研究顯示，我國(guó)無(wú)償獻(xiàn)血者中的 OBI 流行率為 1∶570～1∶7 517[3-6]。由于HBsAg缺失，不能以常規(guī)方法診斷，其檢測(cè)依賴(lài)于高敏感性的PCR方法。②HDV對(duì)HBV復(fù)制的抑制。大量HDV復(fù)制，與HBV競(jìng)爭(zhēng)細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，抑制其基因表達(dá)[7]，使HBV數(shù)量極度下降，HBsAg在血中濃度低于檢測(cè)范圍。③HDV對(duì)HBsAg的消耗。在HDV的裝配過(guò)程中，需要HBsAg參與。急性期大量HDV裝配時(shí)，可以大量消耗HBsAg，使其在血中濃度檢測(cè)不出。④HBV已被清除，而HDV基因組因整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)而避免被清除，進(jìn)而能繼續(xù)在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，并表達(dá)HDAg，引起宿主產(chǎn)生抗-HD IgM[8]。⑤部分HBsAg陰性乙肝患者HBV基因組S 區(qū)發(fā)生免疫逃逸突變，使 HBsAg的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變從而導(dǎo)致現(xiàn)有商品試劑盒無(wú)法檢出，造成假陰性[9]。最后，乙肝血清學(xué)標(biāo)志物模式的轉(zhuǎn)換也是影響因素，但本次研究未進(jìn)行追蹤調(diào)查，不能確定其產(chǎn)生的影響程度。

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(本文編輯:張輝)

Correlation between anti-HD IgM and HBsAg

GanHuiquan1,LinTing1,GanWenjia2,LuoYanfei1*

(1DepartmentofLaboratoryMedicine,DepartmentofPathology,GuangdongProvincialPeople’sHospital,GuangdongAcademyofMedicalScience,Guangzhou510080;2ZhongshanMedicalCollege,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China)

*Correspondingauthor:Email：13544596975@163.com

Objective:To investigate the correlation between anti-hepatitis D IgM (anti-HD IgM) determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and HBsAg. Methods: The anti-HD IgM in 4428 outpatients and inpatients hospitalized in a 3A-grade hospital were determined. The blocking test and 2-mercaptoethanol destructive experiment were used to confirm that the anti-HD IgM was true or false positive. The HBsAg in the true positive samples were determined by ELISA and electrochemiluminescence (ELC). The false positive samples were determined for rheumatoid factor (RF). Results: A total of 155 anti-HD IgM positive samples were determined by ELISA,and 118 true positive and 37 false positive were confirmed. Among the 118 true positive anti-HD IgM samples,more than 50% of the HBsAg was negative determined by ELISA and ELC; and 28 of the 37 false positive anti-HD IgM samples were RF positive. Conclusion: Anti-HD IgM positive and HBsAg-negative may be HBV occult infection. The HBsAg consumption is large,and its concentration is too low in HDV acute infection,which is difficult to detect.

hepatitis D; Blocking test; 2-mercaptoethanol destructive experiment

10.3969/j.issn.2095-9664.2016.05.05

*通訊作者：Email：13544596975@163.com

R512.6

A

2095-9664(2016)05-0022-03

2016-08-15)