馬瑩 綜述 吳青青 審校

(首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院產(chǎn)科，北京 100026)

病理性胎兒生長受限的產(chǎn)前診斷研究進展

馬瑩 綜述 吳青青 審校

(首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院產(chǎn)科，北京 100026)

胎兒生長受限為產(chǎn)科高危妊娠，病因復雜，表現(xiàn)為胎兒生長發(fā)育緩慢，可伴有或不伴有胎兒畸形及胎兒窘迫，其實質(zhì)是胎兒未達到其應發(fā)育的全部潛能，發(fā)生胎兒生長受限的一部分病因與遺傳物質(zhì)異常相關，由于遺傳物質(zhì)異常導致的胎兒生長受限，往往發(fā)生孕周時間較早，生后還會面臨體格和智能方面的發(fā)育異?；蜻t緩，并且尚無有效的治療方法，所以評估胎兒是否為病理性生長受限是產(chǎn)前診斷的重點。通過利用細胞遺傳學和分子遺傳學技術，從染色體核型分析、FISH、各種PCR相關技術到染色體微陣列分析技術，分析胎兒染色體和基因，來預防嚴重病理性生長受限患兒的出生。近年來產(chǎn)前診斷技術不斷成熟，研究逐漸深入。本文就各種遺傳學技術方法在此方面的進展作為綜述。

胎兒生長受限；產(chǎn)前診斷；核型分析；微陣列分析；單核苷酸多態(tài)性

胎兒生長受限(fetal growth restriction，F(xiàn)GR)即因各類原因所致胎兒體質(zhì)量低于同孕齡平均體質(zhì)量第10百分位數(shù)或低于同孕齡平均體質(zhì)量的2個標準差，或孕37周后出生體質(zhì)量小于2 500 g。國內(nèi)外報道FGR的發(fā)生率占所有妊娠的3%～10%，F(xiàn)GR胎兒的死亡率較高，可出現(xiàn)新生兒呼吸窘迫綜合征(NRDS)、低體溫、腦室出血及血糖水平低下等并發(fā)癥，還可能面臨出生后的生長發(fā)育和智力問題，出現(xiàn)較多的遠期并發(fā)癥，臨床研究還發(fā)現(xiàn)FGR與部分成人疾病相關[1-2]。胎兒體重的差異受遺傳因素、母源性疾病和胎盤、臍帶等因素影響，自胚胎期起遺傳因素即開始發(fā)生作用，并在生后的整個生長發(fā)育期繼續(xù)發(fā)揮重要作用。FGR實質(zhì)是胎兒的生長沒有達到所遺傳的全部潛能，體現(xiàn)在胎兒出生體質(zhì)量低，或伴有胎兒畸形，一部分FGR胎兒與遺傳異常相關，遺傳異常可包括有染色體的數(shù)目和結構的改變，基因突變，染色體細微結構的異常即拷貝數(shù)變異(copy number variations，CNVs)，目前國內(nèi)外欠缺有效治療染色體疾病的方法，因此辨別遺傳異常相關的病理性FGR，是FGR產(chǎn)前診斷的重點，利用何技術怎樣尋找其發(fā)病原因，篩查病理性FGR，多年來臨床研究者做了相當多的工作，取得了較大的成就，現(xiàn)綜述如下：

1 染色體核型分析及FISH

染色體結構和數(shù)目異常可引起FGR和兒童生長發(fā)育滯后。染色體核型分析技術是利用染料處理標本后染色體顯帶的特點，肉眼在顯微鏡下觀察染色體形態(tài)和數(shù)目結構，分辨率低，可檢測到大片段約5 Mb以上的遺傳物質(zhì)改變。1992年報道研究了60名身材矮小女性(n= 60)的染色體核型分析，結果為45，X(n=22)，46，XX/46, Xi(Xq)(n=4)，46,XX/46,XXq-(n=3)……46,XX(n=11)，而且相關性研究顯示患者臨床表型的嚴重程度與X染色體數(shù)目相關，證實了部分女性的身體發(fā)育與X染色體異常相關[3]。熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)技術是分子遺傳學和免疫學相結合，使用熒光素標記探針，與分裂中期的染色體或分裂間期的染色質(zhì)進行雜交，在熒光顯微鏡下檢查并定位、定性得出結果。相較染色體核型分析，F(xiàn)ISH具有獨特的優(yōu)勢，耗時短，檢測靈敏度高，而且可用于外周血細胞、臍血、未經(jīng)培養(yǎng)的間期細胞染色檢查，在制備特定的探針后甚至可以篩查染色體微缺失綜合征，可進行產(chǎn)前診斷及胚胎植入前診斷[4]，但FISH技術不能檢測全染色體范圍的異常，局限性較大。

2011年姚妍怡等[5]報道對于74例FGR，染色體核型分析出染色體異常為9.4%(8/74)，8例異常染色體核型包括數(shù)目異常6例及結構異常2例，平衡易位1例，倒位1例，研究結果發(fā)現(xiàn)均稱型FGR組染色體異常核型檢出率高于非均稱型FGR組，合并胎兒畸形的均稱型FGR染色體異常率高達36.3%(4/11)，未合并胎兒畸形的均稱型FGR染色體異常率僅為5.0% (1/20)，說明染色體異常是均稱型FGR的病因之一，合并胎兒畸形的均稱型FGR染色體異常率高于不合并胎兒畸形的均稱型FGR。鐘進等[6]采用染色體核型分析技術對20例FGR進行核型分析，結果發(fā)現(xiàn)胎兒染色體異常1例，該例患者孕38周時超聲提示胎兒雙頂徑相當于孕31周，股骨長相當于孕35周，臍血染色體核型顯示45,XN,rob(14:15)(q10:q10)，診斷胎兒為病理性FGR。2014年國外報道回顧調(diào)查2008-2012年孕14～27周超聲提示腹圍小于第五百分位的單胎FGR 239例，37例(15%)胎兒有異常的染色體核型或明確的異常綜合征，67例(28%)胎兒有至少一個相關的結構異常而沒有染色體非整倍體異常和綜合征[7]，說明染色體異常是發(fā)生FGR的病因之一，超聲測量發(fā)現(xiàn)胎兒小于相應孕周后應詳細篩查是否同時存在胎兒解剖結構異常，產(chǎn)科醫(yī)生需要對FGR胎兒加以重視和考慮進行產(chǎn)前診斷。但是染色體核型分析技術有諸多限制，如細胞培養(yǎng)的耗時長、有失敗率以及分辨率較低等。

2 微陣列-比較基因組雜交

染色體微缺失綜合征指亞顯微結構的小片段染色體缺失所造成的臨床癥候群，缺失區(qū)域有時可以包含一個或多個基因，一種新的產(chǎn)前診斷和先天性疾病診斷技術，稱為微陣列-比較基因組雜交(array comparative genomic hybridization，aCGH)，此技術為采用不同熒光標記的待測DNA和參照DNA雜交，雜交后的基因芯片被掃描，通過比較兩種熒光強度的比率，在全基因組范圍內(nèi)檢測是否存在片段缺失或擴增，稱為拷貝數(shù)變異(CNVs)。CNVs是指通過與參考基因組序列相比較存在的染色體結構差異，包含微缺失或微重復，發(fā)生在基因組區(qū)域的CNVs可引起表型異?；蜻z傳疾病或增加疾病易感性[8]。但是研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在人類即使是不同的人群中基因組中出現(xiàn)CNVs是很常見的。分析CNVs包括三種情況，一為致病性，二為多態(tài)性即良性，三為未知性即臨床意義尚不明確。通過檢查CNVs染色體區(qū)域所包含的基因、查找權威CNVs數(shù)據(jù)庫和分析胎兒父母的染色體可以幫助分析其意義。當胎兒的CNVs與表型正常胎兒父母的染色體CNVs相一致，或通過檢索數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)同樣的CNVs存在于正常人群時，這些CNVs很可能是良性，其與胎兒的生長發(fā)育異常及胎兒畸形無關。對于存在未知性或新突變的CNVs，需要對此類胎兒進行全面的超聲結構篩查以及出生后追蹤生長發(fā)育情況，這些步驟是臨床診斷或產(chǎn)前診斷基因組病的重要環(huán)節(jié)。由于aCGH具有明顯優(yōu)勢，2013年美國婦產(chǎn)科醫(yī)師協(xié)會發(fā)布了關于染色體微陣列分析技術在產(chǎn)前診斷中應用的581號指南，提示當超聲發(fā)現(xiàn)胎兒有一個或多個解剖結構異常時，臨床醫(yī)生考慮可對胎兒母親行介入性產(chǎn)前診斷，建議使用染色體微陣列分析技術，可取代傳統(tǒng)的染色體核型分析，而對超聲提示胎兒結構正常的孕婦進行介入性產(chǎn)前診斷時，可使用染色體核型分析或染色體微陣列分析[9]。2011年國內(nèi)已經(jīng)有報道利用aCGH技術分析15 767例合并各種發(fā)育遲緩、智力障礙和畸形等的異常兒童，其中73%的患兒為智力低下和/或發(fā)育遲緩及自閉癥，與8 329名健康成人對照比較，發(fā)現(xiàn)嚴重癥狀的患兒出現(xiàn)大片段的CNVs的發(fā)病率增加，明顯多于對照組，而且CNVs片段越大病癥越嚴重[10]。

3 聚合酶鏈式反應(PCR)相關技術

熒光定量聚合酶鏈反應(quantitative fluorescent polymerase chain reaction，QF-PCR)技術利用熒光引物對染色體上特異的短串聯(lián)重復序列(short tandem report，STR)位點進行擴增，通過檢測熒光來判斷染色體數(shù)目，具有操作簡單、耗時短、高效和成本低廉的優(yōu)點。紀妍等[11]使用染色體核型分析及QF-PCR兩種方法對羊水或臍血進行染色體分析，納入研究1 035例，結果兩種方法均能檢測出18例染色體非整倍體數(shù)目異常，符合率為100%，其認為可將QF-PCR作為產(chǎn)前診斷染色體核型分析的補充檢查方法。多重連接探針擴增技術(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)于2002年首先被報道，是近年來發(fā)展的對待檢DNA序列可以進行定性和半定量分析的技術，包括雜交、連接和PCR擴增。該技術結合了DNA探針雜交和PCR技術，在一次反應中可以檢測45個核苷酸序列拷貝數(shù)的改變，但是不能用于單個細胞的檢測，不適合檢測未知的點突變類型和不能檢測染色體平衡易位。2014年來自哥倫比亞地區(qū)的研究顯示利用MLPA技術研究了患先天性矮小癥患者的DNA，發(fā)現(xiàn)8.1%的患者存在有X染色體或Y染色體短臂上控制生長的基因即身材矮小同源盒基因(short stature homeobox，SHOX)的異常，包括基因內(nèi)和非編碼區(qū)的插入或缺失變異，而且報道一例患者攜帶有此基因非編碼區(qū)的微重復和內(nèi)含子6 bp的缺失[12]。

4 單核苷酸多態(tài)性芯片

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)是指由于單個核苷酸改變而導致基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態(tài)性，作為不同個體在某一特定位置上的核苷酸差異，它占全部己知多態(tài)性的90%以上并且可以遺傳。SNP既有可能在基因以外的非編碼序列上，也可能在基因序列內(nèi)，是以有些SNP會影響基因的功能，一部分遺傳性疾病和腫瘤都與基因序列中的核苷酸突變密切相關。與aCGH類似，以單核苷酸多態(tài)性芯片(single nucleotide polymorphism array，SNP-array)為平臺的染色體微陣列技術(chromosome microarray analysis，CMA)可對染色體亞顯微結構異常進行診斷定位，并能準確地測定其大小。SNP-array的原理是將大量SNP位點序列采用特殊方法固定在硅芯片上，獲得高密度的SNP微陣列，然后與樣品雜交，通過激光掃描及軟件分析獲得結果[13]。有報道使用Affymetrix SNP 6芯片發(fā)現(xiàn)了8例(19.5%)原始侏儒癥或類似表現(xiàn)的兒童存在范圍為672～9.158 Mb的CNVs，5例檢測到的CNVs的致病性仍不清楚，但是作者建議SNP芯片技術可作為此類患者的遺傳學診斷方法[14]。

白小藝等[15]2015年對比312例血清學唐氏篩查高風險孕婦羊水的染色體核型分析與SNP-array兩種產(chǎn)前診斷技術結果，兩種方法均識別出2例21三體，開展對CNVs的分析有利于進一步研究人類基因組及SNP的多態(tài)性情況。付春云等[16]利用SNP-array檢測56例生長障礙患兒的外周血，發(fā)現(xiàn)性染色體上存在致病性CNVs者6例，常染色體上存在致病性CNVs者6例，異常片段＜2.5 MB的即染色體核型分析無法檢出的致病性微缺失或微重復者4例，認為SNP-array技術優(yōu)于傳統(tǒng)的染色體核型分析，可作為遺傳學診斷的有效方法。常亮等[17]對照分析SNP array與染色體核型分析技術，發(fā)現(xiàn)兩者聯(lián)合分析檢出率(12.1%)高于單純SNP array檢出率(11.3%)，遠高于單純?nèi)旧w核型分析檢出率(6.4%)。2014年通過比較多代同堂的高海拔居民(安第斯人)與歐洲移民發(fā)生的FGR，檢測了與嬰兒出生體重相關的63個單核苷酸多態(tài)性，利用SNP技術確定了與出生體重相關的參與氧傳感和血管控制的兩基因PRKAA1和EDNRA[18]。

由于SNP-array的優(yōu)勢，國外已經(jīng)利用SNP-array技術研究基因識別等領域，但是SNP-array技術也有自身的局限性，就是不能檢測是否存在染色體平衡易位，而染色體核型分析可以檢出染色體平衡易位。2012年有報道對一例妊娠合并FGR、胎足畸形、腦室擴張及羊水過多的病例進行了產(chǎn)前診斷，發(fā)現(xiàn)此病例為一個獨特的、涉及2、5和7號染色體復雜的從頭重排和2號染色體長臂的多個微缺失，產(chǎn)前診斷為首例2q32微缺失綜合征，作者為了全面分析該病例的染色體使用了多個診斷技術，包括染色體核型分析、FISH、aCGH和SNP-array[19]。因此分析復雜的染色體異常時醫(yī)學研究者需要依靠多個遺傳學技術才能明確其核型及病理類型。

綜上所述，需要進行產(chǎn)前診斷明確是否為病理性FGR時，目前國內(nèi)的主要手段是采集羊水或臍帶血進行染色體核型分析和/或FISH檢查，只能檢測出一些大片段的遺傳物質(zhì)異常，會漏診細微結構異常和致病性CNVs的胎兒?？焖?、準確如aCGH和SNP-array技術在我國的產(chǎn)科研究中還處于起步和探索階段，臨床研究人員應重視利用先進技術提高產(chǎn)前診斷的水平，避免病理性FGR患兒的出生，提高現(xiàn)有的遺傳病檢出率。

[1]Kady S,Gardosi J.Perinatal mortality and fetal growth restriction[J]. Best Pract Res Clin Obstet Gynecol,2004,18(3):397-410.

[2]Jacobsson B,Ahlin K,Francis A,et al.Cerebral palsy and restricted growth status at birth:population based case-control study[J]. BJOG,2008,115(10):1250-1255.

[3]Temtamy SA,Ghali I,Salam MA,et al.Karyotype/phenotype correlation in females with short stature[J].Clin Genet,1992,41(3): 147-151.

[4]黃艷儀,孫筱放,黎青,等.應用熒光原位雜交技術診斷羊水細胞染色體異常[J].中華婦產(chǎn)科雜志,1999,34(3):153-156.

[5]姚妍怡,宋婕萍,郭淮,等.74例胎兒生長受限臍血染色體核型分析[J].中國婦幼保健,2011,26(6):884-885.

[6]鐘進,郭曉玲,史淑瓊.732例孕中晚期胎兒臍血染色體核型分析[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志,2013,21(7):38-39.

[7]Vanlieferinghen S,Bernard JP,Salomon LJ,et al.Second trimester growth restriction and underlying fetal anomalies[J].Gynecol Obstet Fertil,2014,42(9):567-571.

[8]Lee C,Scherer SW.The clinical context of copy number variation in the human genome[J].Expert Rev Mol Med,2010,12:e8.

[9]ACOG.Committee Opinion No.581:The use of chromosomal microarray analysis in prenatal diagnosis[J].Obstet Gynecol,2013,122 (6):1374-1377.

[10]Cooper GM,Coe BP,Girirajan S,et al.A copy number variation morbidity map of developmental delay[J].Nat Genet,2011,43(9): 838-846.

[11]紀妍,朱津,盧燕.QF-PCR快速產(chǎn)前診斷常見非整倍體病的價值[J].海南醫(yī)學,2016,27(1):56-59.

[12]Sandoval GT,Jaimes GC,Barrios MC,et al.SHOX gene and conserved noncoding element deletions/duplications in Colombian patients with idiopathic short stature[J].Mol Genet Genomic Med, 2014,2(2):95-102.

[13]Peiffer DA,Le JM,Steemers FJ,et al.High-resolution genomic profiling of chromosomal aberrations using infinium whole-genome genotyping[J].Genome Res,2006,16(9):1136-1148.

[14]Spengler S,Begemann M,Ortiz Brüchle N,et al.Molecular karyotyping as a relevant diagnostic tool in children growth retardation with Silver-Russell features[J].J Pediatr,2012,161(5):933-942.

[15]白小藝,章鈞,田琪,等.單核苷酸多態(tài)性芯片與染色體核型分析在唐氏篩查高風險孕婦產(chǎn)前診斷中的比較研究[J].中國病理生理雜志,2015,31(4):707-712.

[16]付春云，陳少科,陳榮譽,等.56例生長障礙患兒單核苷酸多態(tài)性基因芯片檢測結果分析[J].臨床兒科雜志,2014,32(12):1119-1121.

[17]常亮,趙楠,魏媛,等.單核苷酸多態(tài)性微陣列與染色體核型分析的產(chǎn)前診斷意義比較[J].北京大學學報(醫(yī)學版),2014,46(5):676-680.

[18]Bigham AW,Julian CG,Wilson MJ,et al.Maternal PRKAA1 and EDNRA genotypes are associated with birth weight,and PRKAA1 with uterine artery diameter and metabolic homeostasis at high altitude[J].Physiol Genomics,2014,46(18):687-697.

[19]Thorson HL,Surti U,Sathanoori M,et al.Prenatal diagnosis of 2q32 deletion syndrome characterized by multiple segmental deletions and complex chromosomal rearrangement involving chromosomes 2,5 and 7[J].Fetal-Diagn Ther,2012,31(3):196-200.

R714.51

A

1003—6350(2016）22—3729—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.22.039

2016-01-16)

吳青青。E-mail：wuqq2013@163.com