雷　輝，　饒　猛，　朱長虹

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院計劃生育研究所，武漢　430030

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綜述

熱休克蛋白70-2在精子發(fā)生及精卵識別中的研究進(jìn)展*

雷輝，饒猛，朱長虹△

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院計劃生育研究所，武漢430030

精子發(fā)生；熱休克蛋白70-2；減數(shù)分裂；精卵識別

熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)是所有生物細(xì)胞在理化和生物等應(yīng)激原刺激后，發(fā)生熱休克反應(yīng)時所產(chǎn)生的一類伴隨細(xì)胞內(nèi)功能性蛋白的伴侶蛋白分子。熱休克蛋白根據(jù)分子量大小，主要分為4個家族：HSP90家族(83～90 kD)、HSP70家族(66～78 kD)、HSP60家族及小分子HSP家族(15～30 kD)。此外還有分子量在100～110 kD的大分子HSPs。HSP70家族是HSP中最大的家族，也是研究最深入的一種，在人類基因組至少包含13種成員，其中只有小部分是熱休克反應(yīng)時所產(chǎn)生的[1]。精子發(fā)生是一個高度復(fù)雜的細(xì)胞分裂分化過程，歷經(jīng)精原細(xì)胞的增殖分化、精母細(xì)胞的減數(shù)分裂以及精子變形3個階段。HSP70-2(HSPA2)是HSP70家族中的一員，目前各類研究表明它是人類以及嚙齒類動物睪丸中的生精特異性蛋白，在精子發(fā)生、調(diào)控以及精卵識別中具有重要作用，與男性生殖功能密切相關(guān)。迄今為止，關(guān)于HSPA2在精子發(fā)生中作用的研究較為零散，本文將對其進(jìn)行總結(jié)，從HSPA2基因的發(fā)現(xiàn)、在熱應(yīng)激及缺氧狀態(tài)下的表達(dá)、在精子發(fā)生和精卵識別中的作用等方面進(jìn)行綜述。

1　HSPA2基因的發(fā)現(xiàn)

Krawczyk等[2]對從大鼠睪丸中分離出的總RNA進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)了一個含量相當(dāng)豐富的2.5 kb轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，這是第1次檢測出睪丸特異性HSP-70相關(guān)基因的存在。隨后Zakeri等[3]則使用PM1.8質(zhì)粒作為探針篩選小鼠DNA基因庫鑒定出小鼠HSPA2基因，其研究顯示大鼠和小鼠HSPA2基因的轉(zhuǎn)錄單位結(jié)構(gòu)相似，它們都在5′端未翻譯區(qū)有一個內(nèi)含子，除此之外，大鼠和小鼠的兩個主要轉(zhuǎn)錄起始點(T2和T1)分別位于ATG起始密碼子上游115堿基對和350堿基對附近。盡管它們的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物大小相似，但是5′尾端的結(jié)構(gòu)不同，來源于較遠(yuǎn)處T1起始位點的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)歷了剪接過程，而來源于T2處的則沒有[4-5]。這個基因最終從大鼠基因組中分離、克隆，命名為HSPA2[6]。

人類HSPA2基因是從人胎盤基因庫中克隆而得到，5′RACE和RT-PCR分析顯示它不含內(nèi)含子，且僅有一個轉(zhuǎn)錄起始位點，只表達(dá)一種mRNA。人HSPA2基因編碼的蛋白質(zhì)與基因家族的其他成員的氨基酸序列相似性較低，例如與HSC70和HSP70-1的相似性分別為86.1%、83.3%。但是與小鼠和大鼠HSPA2基因所編碼的產(chǎn)物的氨基酸序列相似性卻達(dá)到98.2%、98.4%。除此之外，人類HSPA2蛋白質(zhì)靠近羧基末端處插入的7個氨基酸是人類和鼠類HSPA2蛋白質(zhì)最顯著的不同。盡管人HSPA2基因在大部分組織中都有表達(dá)，但是在睪丸和肌肉組織中表達(dá)量最高，目前對其在睪丸中的表達(dá)研究也最為深入[7-8]。

2　HSPA2基因在熱應(yīng)激和缺氧狀態(tài)下的表達(dá)

當(dāng)體細(xì)胞暴露于熱應(yīng)激時，熱激轉(zhuǎn)錄因子1(HSF1)與應(yīng)激誘導(dǎo)基因激活子中的熱應(yīng)激應(yīng)答元件(HSES)相結(jié)合激活HSP基因的一個子集，激活的HSP基因表達(dá)相應(yīng)的熱休克蛋白隨后參與熱休克反應(yīng)。雖然鼠類HSPA2基因也包含HSE類似序列，但是它和典型的HSE相比具有很低的相似度，也并不能和HSF1結(jié)合形成活性突變體。Krawczyk等[9-10]建立一個大鼠隱睪模型來增加睪丸周圍溫度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HSPA2 mRNA的快速消失以及生精上皮細(xì)胞的變性；除此之外，在睪丸持續(xù)性表達(dá)HSF1的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，檢測睪丸中HSPA2基因的表達(dá)產(chǎn)物，和正常小鼠對比發(fā)現(xiàn)HSF1的持續(xù)表達(dá)也并沒有激活HSPA2基因，反而導(dǎo)致生精細(xì)胞的凋亡增加[11]。截止目前，HSF1影響HSPA2基因表達(dá)的機(jī)制依舊不清楚，研究推測有些基因能夠編碼對HSPA2表達(dá)有重要作用的因子，而HSF1則可能抑制這些基因的表達(dá)來影響睪丸中HSPA2的表達(dá)[10]。

在后續(xù)研究中證實了應(yīng)激也不能誘導(dǎo)人類HSPA2基因的表達(dá)，而且在人類細(xì)胞中也并不能檢測到HSF1與HSP激活子之間的結(jié)合；盡管熱激并不能誘導(dǎo)體細(xì)胞中HSPA2基因的表達(dá)，但是溫度突然上升會導(dǎo)致HSPA2蛋白快速從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到胞核、核仁以及中心體區(qū)域；這表明在熱應(yīng)激環(huán)境下，HSPA2可能參與保護(hù)細(xì)胞核或是中心體完整性的過程[12-15]。

缺氧誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子1(HIF1)是在細(xì)胞缺氧狀態(tài)下表達(dá)明顯上調(diào)的因子，功能激活研究以及染色質(zhì)免疫沉淀分析證實HIF1與HRE(缺氧應(yīng)答元件)的相互作用能夠調(diào)節(jié)HSPA2基因的激活。已有研究顯示缺氧增加了人類肝臟、乳腺以及宮頸腫瘤細(xì)胞中HSPA2的表達(dá)[16]。

3　HSPA2在精子發(fā)生中的作用

3.1在減數(shù)分裂過程中的作用

HSPA2在嚙齒類及哺乳類動物精子發(fā)生過程中發(fā)揮重要的作用，主要表現(xiàn)在對減數(shù)分裂過程的調(diào)節(jié)。減數(shù)分裂是一個極其復(fù)雜的過程，需要許多新的結(jié)構(gòu)蛋白和酶的參與，它們對染色體的排列、斷裂、重組和修復(fù)等具有重要意義。減數(shù)分裂始于細(xì)線前期的初級精母細(xì)胞，經(jīng)歷偶線期、粗線期、雙線期、次級精母細(xì)胞后，形成圓形精細(xì)胞。

研究發(fā)現(xiàn)在野生型小鼠粗線期精母細(xì)胞內(nèi)，HSPA2沿著聯(lián)會復(fù)合物形成的結(jié)構(gòu)分布，并參與聯(lián)會復(fù)合物消失的過程[17-18]。HSPA2基因敲除時則可觀察到精子發(fā)生過程停滯于G2/M期，而且并不會進(jìn)展到M期的減數(shù)分裂階段。周期蛋白CDK1/Cyclin B1異時相的表達(dá)有助于正常細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞分裂周期，而HSPA2在初級精母細(xì)胞CDK1/Cyclin B1復(fù)合物的形成中是必不可少的，但是HSPA2僅與CDK1相互作用，因此若CDK1與Cyclin B1形成復(fù)合物則不再與HSPA2相互作用[19]。Alekseev等[20]發(fā)現(xiàn)這種復(fù)合物的活性至少接受2種蛋白的調(diào)節(jié)：睪丸特異性可變連接組蛋白H1(H1t)、睪丸/胚胎形式的核自身抗原精子蛋白(tNASP)，而tNASP屬于特異性組蛋白分子伴侶家族，它能促進(jìn)染色質(zhì)中連接組蛋白的結(jié)合和細(xì)胞周期的G1/S期的發(fā)展[21]。數(shù)據(jù)顯示在小鼠的初級精母細(xì)胞中，tNASP、H1t、HSPA2以及CDK1之間會發(fā)生相互作用。H1t與tNASP-HSPA2復(fù)合物相結(jié)合，增強(qiáng)HSPA2內(nèi)在ATP酶活性以及與CDK1的結(jié)合能力，與此同時，阻止Cyclin B1與HSPA2/CDK1復(fù)合物的結(jié)合?？偠灾?，tNASP和H1t之間的協(xié)調(diào)合作調(diào)控了HSPA2的能力，有助于形成有活力的CDK1/Cyclin B1復(fù)合物，并進(jìn)一步調(diào)控了減數(shù)分裂的發(fā)展歷程[20]。

大量的生物化學(xué)及臨床觀察結(jié)果表明人類男性生育力同樣需要HSPA2基因的表達(dá)，它在精子發(fā)生、成熟過程和精子受精能力中扮演著重要的角色。但是到目前為止，各類發(fā)表的研究結(jié)果顯示人類和嚙齒類精子發(fā)生過程中HSPA2的功能和表達(dá)模式可能沒有完全重疊。在人類睪丸中，HSPA2在長形精子及精細(xì)胞中的表達(dá)要明顯高于初級精母細(xì)胞[22-24]。除此之外，既沒有文獻(xiàn)表明人類HSPA2在聯(lián)會復(fù)合體分離中的作用，也沒有文獻(xiàn)表明它在CDK1/Cyclin B1復(fù)合物成分中充當(dāng)分子伴侶。

3.2在精子變形中的作用

在精子發(fā)生過程中，最明顯的形態(tài)學(xué)變化是精子細(xì)胞的改變，其中細(xì)胞核的濃縮對精子形成至關(guān)重要。核濃縮時，生精細(xì)胞核內(nèi)核蛋白組分發(fā)生了明顯的變化，先由富含賴氨酸的體細(xì)胞型組蛋白被睪丸特異性的組蛋白取代，最后被富含精氨酸和胱氨酸的精核蛋白所取代。精核蛋白能中和DNA電荷，降低DNA分子間的靜電排斥作用，并通過二硫鍵的交聯(lián)形成致密的細(xì)胞核。

實驗數(shù)據(jù)表明，在小鼠精子發(fā)生過程中，HSPA2同樣參與了染色質(zhì)的壓縮過程。染色質(zhì)壓縮的起始階段，核心組蛋白和連接組蛋白被它們的睪丸特異性類型所取代，與此同時，染色質(zhì)的高度乙?；茐牧撕诵◇w結(jié)構(gòu)，并有助于TPs(轉(zhuǎn)化蛋白)和DNA折疊蛋白質(zhì)取代睪丸特異性組蛋白[25]。Govin等[26]采用蛋白組學(xué)分析以及顯微鏡觀察揭示了長形精細(xì)胞中的HSPA2經(jīng)歷了從核內(nèi)到頂體下結(jié)構(gòu)域的重新分布，并表明這種行為與組蛋白乙?；慕K止和組蛋白的遷移有關(guān)聯(lián)。隨后對包含TP1、TP2、HSPA2的復(fù)合物進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示HSPA2在TPs參與DNA折疊過程中扮演了一個特殊的分子伴侶，參與新的精細(xì)胞特異性核結(jié)構(gòu)的組裝。

染色質(zhì)的壓縮過程中，TPs依賴HSPA2對組蛋白進(jìn)行替換的過程受到PARP-1和PARP-2兩種多聚聚合酶的調(diào)控。這2種酶屬于多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)大家族，在精子發(fā)生過程中，這個家族的成員有助于染色質(zhì)重組等各種生理過程的表觀遺傳調(diào)控[27-29]。大量質(zhì)譜分析表明在小鼠的精細(xì)胞中，PARP-2依賴TP2與HSPA2發(fā)生相互作用，而PARP-1則通過ADP核糖基化修飾HSPA2結(jié)構(gòu)。以上研究結(jié)果表明，HSPA2能與TP2、PARP-2、PARP-1一起形成精子特異性復(fù)合物，可能在染色質(zhì)重塑中扮演著至關(guān)重要的角色。除此之外，HSPA2依賴PARP-1和TP依賴PARP-2進(jìn)行的多聚ADP核糖基化過程、以及HSPA2對TP2及TP1的伴侶行為都可能有助于染色質(zhì)重組和精子的形成[28]。

HSPA2除了通過與TP、PARP相互作用來參與染色質(zhì)重組過程以外，還有些間接證據(jù)表明HSPA2的磷酸化也能影響精子特異性染色質(zhì)重組過程。根據(jù)PhosphoSitePlus數(shù)據(jù)庫，HSPA2絲氨酸和蘇氨酸殘端在體內(nèi)能被磷酸化，而且在絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶1γ2(PPP1CC2)潛在作用對象中也可找到HSPA2[30]。PPP1CC2是PPP1CC基因編碼的2種剪接亞型中的一種，它的表達(dá)受到生精細(xì)胞的限制。Forgione等[31]的研究顯示PPP1CC基因受損時將導(dǎo)致異常的精子發(fā)生，例如組蛋白滯留產(chǎn)生的異常染色質(zhì)、生殖細(xì)胞凋亡數(shù)量增加、長形精細(xì)胞數(shù)量減少等。由于PPP1CC2能直接與HSPA2發(fā)生作用，而且它的損耗能引起睪丸中HSPA2的高磷酸化累積，故可以推測HSPA2這種依賴PPP1CC2對自己的結(jié)構(gòu)和活性進(jìn)行調(diào)節(jié)的行為將有助于小鼠生精過程中的染色質(zhì)重塑[30]。

4　HSPA2在精卵識別中的作用

精子膜表面與卵子透明帶表面都有特殊的相互識別裝置，識別是受精過程的啟動或扳機(jī)，也是保證種族特異性的關(guān)鍵。盡管對HSPA2在獲能精細(xì)胞內(nèi)的定位存在爭議，但是不可否認(rèn)HSPA2在精卵識別上有著重要作用[23-24，32]。

當(dāng)HSPA2在精細(xì)胞中表達(dá)水平下降時，精子與卵子的相互作用能力以及精子受精能力也會隨之下降，這也往往預(yù)示著體外受精的失敗[33-34]。根據(jù)Redgrove等[32]的研究結(jié)果可知HSPA2是多聚體精卵識別復(fù)合物中的一員，這個復(fù)合物還包含精子黏附分子1(SPAM1)和芳基硫酸酯酶(ARSA)2種蛋白成分，這2種蛋白在以前就證實參與了精卵間的相互作用，在其研究模型中，HSPA2定位于細(xì)胞內(nèi)，它的活性能為SPAM1和ARSA的運動提供動力。對HSPA2/ARSA/SPAM1復(fù)合物的動態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，可知HSPA2的磷酸化是通過蛋白激酶A的活性來調(diào)節(jié)的。這進(jìn)一步說明HSPA2翻譯后的修飾對它的活性有至關(guān)重要的影響。盡管HSPA2在精卵識別中扮演著重要的作用，但是對于HSPA2是否能在后續(xù)的頂體反應(yīng)以及精卵融合中繼續(xù)發(fā)揮作用，我們?nèi)匀恍枰M(jìn)一步探索才能了解它在受精過程中更為全面的功能。

5　結(jié)語

HSPA2蛋白已經(jīng)研究了30余年，除了睪丸，人體某些特定的體細(xì)胞也能表達(dá)HSPA2，甚至在某些腫瘤細(xì)胞中還能檢測到它的表達(dá)，但是在其它細(xì)胞中的研究并不深入，并未發(fā)現(xiàn)HSPA2的特異性功能[35]；HSPA2作為在睪丸中發(fā)現(xiàn)的特異性蛋白，它在精子發(fā)生過程中所發(fā)揮的作用一直是研究熱點。大量文獻(xiàn)已表明它在精子的減數(shù)分裂、精子的成熟變形以及精卵識別過程中扮演著重要角色。盡管迄今為止對HSPA2在精子發(fā)生中的功能研究得越來越深入，相互關(guān)聯(lián)的作用機(jī)制也逐漸被發(fā)現(xiàn)，但在精原細(xì)胞的增殖分化過程中并未檢測到HSPA2的功能表達(dá)，而且人類生殖細(xì)胞中HSPA2的具體作用機(jī)制仍不夠明朗。因此，仍需要后續(xù)的大量實驗進(jìn)一步證實這其中的諸多猜測，并對此展開深入研究，為探索男性不育的分子靶點提供新的思路。

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(2015-09-17收稿)

，Corresponding author，E-mail：reprodcentre@163.com

R34

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.04.026

*十二五科技支撐計劃資助項目(No.2012BAI31B08)；國家自然科學(xué)基金資助項目(No.31171380)

雷輝，女，1990年生，醫(yī)學(xué)碩士，E-mail：1012782592@qq.com