李淑珍 武飛 陳月林 楊穎

【摘要】目的：對(duì)沙棘葉總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。方法：采用溶劑浸提法提取沙棘葉總黃酮，利用分光光度法測(cè)定總黃酮的含量，正交試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果：取7月份沙棘葉粉碎物，過(guò)35目篩，經(jīng)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后的提供工藝為：用60%的乙醇作溶劑，固液比為1∶20，在80℃提取30min，用此方法100g葉粉碎物經(jīng)提取可得8.71g粗制品，總黃酮提取率達(dá)0.14%。結(jié)論：上述工藝操作簡(jiǎn)單、方法可靠，產(chǎn)品得率高，提取性能較好，適合于沙棘總黃酮大規(guī)模提取。

【關(guān)鍵詞】沙棘葉；總黃酮；提取工藝；正交試驗(yàn)

【中圖分類(lèi)號(hào)】R284.2 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2016）01-0014-03

沙棘（Hippophe rhamnoids L.）屬胡頹子科沙棘屬植物，又名醋柳，被國(guó)際醫(yī)藥學(xué)家和營(yíng)養(yǎng)學(xué)家譽(yù)為人類(lèi)21世紀(jì)最具發(fā)展前途的醫(yī)藥及營(yíng)養(yǎng)保健植物。其根、莖、葉、果實(shí)等都含有維生素、黃酮類(lèi)化合物和豐富的礦物質(zhì)元素等，為藥食同源植物，并廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等多個(gè)領(lǐng)域[1]。沙棘1977年收載于《中華人民共和國(guó)藥典》，所含的黃酮類(lèi)化合物具有抗氧化、抗癌、降血糖、保護(hù)心血管等多種生物活性[2-3]。內(nèi)蒙古沙棘資源具有分布廣、種植面積大、果實(shí)質(zhì)量高等特點(diǎn)，對(duì)沙棘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展十分有利。且沙棘作為防護(hù)林發(fā)揮著巨大作用，種植面積也逐年增加。而沙棘果實(shí)黃酮的開(kāi)發(fā)已經(jīng)報(bào)道很多[4-5]，從葉中提取黃酮類(lèi)化合物也具有原料來(lái)源廣泛、成本低廉的優(yōu)勢(shì)[6]。研究從沙棘葉提取黃酮，旨在篩選適合沙棘葉黃酮的提取工藝，獲取高含量的總黃酮，促進(jìn)沙棘資源的綜合利用。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 722可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；DZKW-S-8電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；RE-52旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式多用真空泵（上海亞榮生化儀器廠）；101-2型數(shù)顯電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱（上海陽(yáng)光實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

1.2 材料 沙棘葉采于內(nèi)蒙古烏蘭察布市（集寧區(qū)）卓資縣郊野，經(jīng)楊鴻飛教授鑒定沙棘（Hippophe rhamnoids L.）的葉。并將其充分粉碎，過(guò)35目篩，置于干燥器中備用。蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：100080-201407，中國(guó)藥品生物制品檢定所）。其他試劑均為分析純。

2 方法及結(jié)果

2.1 沙棘葉總黃酮含量的測(cè)定

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 準(zhǔn)確稱(chēng)取在120℃干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20mg，用70%的乙醇溶解并定容至100ml，使其濃度為200μg/ml。分別取10、15、20、25、30、35、40、45ml，用70%的乙醇定容50ml，即為40、60、80、100、120、140、160、180μg/ml的蘆丁溶液。各取1ml于試管中，加70%的乙醇1ml，加入0.5ml 5%的NaNO2，混勻后放置6min；然后加入0.5ml 10%的Al（NO3）3溶液，搖勻后放置6min；最后再加入6ml 4%NaOH，放置15min，在510nm處測(cè)定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值（亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法）。以吸光度為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程：Y=477.38X-2.261（R=0.9979），結(jié)果表明蘆丁在0～120μg/ml濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.1.2 樣品中黃酮含量的測(cè)定 取一定量的沙棘葉黃酮樣品，配制成樣液。再取一定量總黃酮樣液，定容至某一體積。各取1ml于試管中，采用“2.1.1”項(xiàng)比色法測(cè)定吸光值，計(jì)算總黃酮含量。

X=Y×V×n×100%/m。

式中，X為樣品中總黃酮含量，Y為樣液中總黃酮濃度（mg/mL），由回歸方程可算得；V為樣液體積（mL）；n為稀釋倍數(shù)；m為樣品量（mg）[7]。

2.2 提取條件的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇 取8份過(guò)35目篩的6月份沙棘葉粉碎物各1g，分別加入甲醇、乙醇、水、氯仿、丙酮、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇10ml，在70℃水浴加熱提取10min，過(guò)濾。用70%乙醇統(tǒng)一定容到50ml，各取1ml于試管中，采用2.1.1項(xiàng)比色法測(cè)定吸光值，計(jì)算提取率。同樣方法做3次平行試驗(yàn)，確定提取的最佳溶劑，結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可知，沙棘總黃酮在甲醇、乙醇、水等極性溶劑中溶解度大，提取率高；在氯仿、正丁醇、乙醚、乙酸乙酯、丙酮等溶劑中溶解度小，提取率低。在所測(cè)溶劑中，甲醇最好，但甲醇有毒，給操作帶來(lái)不便。由于乙醇具有、無(wú)異味、無(wú)殘留、安全性好等優(yōu)點(diǎn)，且容易回收，故選用乙醇為提取溶劑。

2.2.2 提取原材料的選擇 取5份過(guò)35目篩的5～9月份沙棘的葉粉碎樣品各10g，加入50%乙醇150ml，在70℃水浴加熱提取30min，過(guò)濾，蒸發(fā)乙醇，用50%乙醇定容到100ml，稀釋取5ml定容到50ml的容量瓶中，取1ml于試管中，測(cè)定吸光值，計(jì)算總黃酮含量，選擇最佳提取原材料。

黃酮化合物是植物生理過(guò)程中的次生代謝產(chǎn)物，這些物質(zhì)的往往受到植物發(fā)育階段酶的調(diào)節(jié)和遺傳機(jī)制的控制。不同發(fā)育階段黃酮化合物含量不同。由圖2可知，5月份日照時(shí)間長(zhǎng)，植物正處在生長(zhǎng)的旺盛階段，故5月份黃酮含量高；隨后植物生長(zhǎng)變緩，合成量減少或轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)，故含量下降。但西北地區(qū)5月份葉子處于發(fā)芽階段，產(chǎn)量低，不宜選用。7月葉子已經(jīng)長(zhǎng)成，也未結(jié)果，又出現(xiàn)了黃酮含量的高峰，不宜用7月份葉作為實(shí)驗(yàn)原材料。

2.2.3 多因素正交試驗(yàn) 在單因素篩選的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)多因素試驗(yàn)表，見(jiàn)表1。取7月份葉粉碎樣品1g，按照下列正交試驗(yàn)條件進(jìn)行提取、過(guò)濾，用70%乙醇統(tǒng)一定容至30ml。各取1ml于試管中，測(cè)定吸光值，計(jì)算總黃酮含量，確定優(yōu)化后的提取條件。

多因素正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，直觀分析得出：葉中提取總黃酮的影響因素的順序是：C>B>A>D，即提取溫度>固液比>乙醇濃度>提取時(shí)間，優(yōu)化組合后的提取因素的選擇為A2B2C3D1。方差分析的結(jié)果見(jiàn)表2，影響提取沙棘總黃酮各因素均為極顯著因子（P<0.01）。綜合考慮最佳的提取條件為A2B2C3D1，即取7月份葉，用60%的乙醇作溶劑，固液比為1∶20，在80℃提取30min，提取效果較好。

2.3 沙棘總黃酮的得率和含量測(cè)定 準(zhǔn)確稱(chēng)量沙棘7月份葉粉碎物100g，按上述確定的優(yōu)化提取條件進(jìn)行浸提，將浸提液在60℃減壓濃縮回收乙醇，將濃縮液在60℃的干燥箱干燥，稱(chēng)量干燥粗制品的質(zhì)量，得到粗黃酮產(chǎn)品得率。從中取1g用70%的乙醇溶液溶解，稀釋一定倍數(shù)，取1ml測(cè)定粗制品總黃酮含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表4可知，100g葉粉碎樣品經(jīng)此提取條件提取，可得到8.71g粗黃酮產(chǎn)品，葉粗制品黃酮含量達(dá)0.14%，并且RSD為0.68%，純化后總黃酮含量達(dá)到14.89%，表明該工藝重復(fù)性強(qiáng)，穩(wěn)定可靠，精密度高。

3 討論

內(nèi)蒙古沙棘資源具有分布廣、種植面積大、果實(shí)質(zhì)量高等特點(diǎn)，對(duì)沙棘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展十分有利[8]。且沙棘作為防護(hù)林發(fā)揮著巨大作用，種植面積也逐年增加。有研究發(fā)現(xiàn)沙棘所含總黃酮為葉子（876mg/100g）>果渣（502mg/100g）>鮮果汁（365mg/100g）>鮮漿果（354mg/100g），說(shuō)明從葉中提取黃酮具有重要意義[9]。對(duì)于從沙棘中提取總黃酮的方法，目前有超臨界CO2流體提取、微波法提取、超聲波法提取、有機(jī)溶劑提取、水浸提取等。超臨界CO2萃取適用于非極性化合物的分離；微波法和超聲波法提取僅限于少量提取實(shí)驗(yàn)，工業(yè)化大生產(chǎn)不宜應(yīng)用。水浸提取沙棘總黃酮提取率偏低；有機(jī)溶劑提取中甲醇和丙酮含有毒成分，因此用乙醇提取沙棘黃酮是適合工業(yè)化生產(chǎn)的適宜方法[10]。該方法經(jīng)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，60%乙醇作為提取溶劑，提取30min，既節(jié)約時(shí)間，且乙醇還可以重復(fù)利用，無(wú)毒害無(wú)殘留，適合工業(yè)化擴(kuò)大生產(chǎn)。經(jīng)優(yōu)化工藝提取后所得葉黃酮得率為8.71%，相對(duì)較高，但黃酮含量（0.14%）較呂敏[11]采用正交試驗(yàn)法優(yōu)選提取山西沙棘Hippophe rhamnoids L.葉總黃酮含量（4.82%）較低，這可能與不同品種的沙棘黃酮含量不同有關(guān)。王亞輝等[12]對(duì)內(nèi)蒙古不同產(chǎn)區(qū)同一品種沙棘黃酮含量研究發(fā)現(xiàn)：內(nèi)蒙古和林格爾縣（2.5±0.07）%>內(nèi)蒙古涼城縣（2.3±0.02）%>內(nèi)蒙古東勝區(qū)（2.2±0.08）%>內(nèi)蒙古翁牛特旗（1.8±0.01）%>內(nèi)蒙古敖漢旗（1.7±0.09）%>內(nèi)蒙古集寧區(qū)（1.4±0.01）%。除集寧外，5個(gè)產(chǎn)區(qū)的總黃酮含量均達(dá)到《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)（1.5%）。實(shí)驗(yàn)選用沙棘品種恰好來(lái)自集寧區(qū)卓資山縣，提取原材料并非5月份含量最高季節(jié)采收，而是產(chǎn)量較高的7月份采收，原料只提取1次，而呂敏實(shí)驗(yàn)提取三次，所以該實(shí)驗(yàn)黃酮含量相對(duì)較低。與其他研究結(jié)果比較[13-15]，產(chǎn)品得率較高，并且該提取工藝操作簡(jiǎn)單、乙醇無(wú)殘留可重復(fù)利用，適合于沙棘總黃酮的提取，可進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)。

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（收稿日期：2015.09.23）