蔣 瑤， 陳文波， 周增麗

(凱里學院 環(huán)境與生命科學學院， 貴州 凱里 556011)

野生卷丹不定芽誘導及再生體系的建立

蔣 瑤， 陳文波， 周增麗

(凱里學院 環(huán)境與生命科學學院， 貴州 凱里 556011)

為野生卷丹種質資源的繁殖、保存與利用提供依據，采用隨機區(qū)組試驗方法探究NAA、6-BA和2,4-D不同配比對野生卷丹鱗莖不定芽誘導及再生植株形成的影響。結果表明：相同6-BA 濃度下，生長素對野生卷丹鱗莖不定芽的誘導作用依次為NAA>NNA+2,4-D>2,4-D，最佳不定芽誘導培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.3 mg/L，平均產芽6.21個；最佳增殖培養(yǎng)基為MS+NAA 0.5 mg/L+6-BA 1.0 mg/L，其增殖系數3.46；最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS+NAA 1.0 mg/L，平均生根6.20個。

野生卷丹； 不定芽誘導； 再生植株； 組織培養(yǎng)

百合屬(Lilium)是多年生草本鱗莖花卉植物，其栽培歷史悠久，是綠化美化及切花生產的重要花卉之一[1]。但我國野生百合的利用率較低，大多數未得到應有的關注與保護，仍有很多優(yōu)良的野生百合資源有待開發(fā)[2]。卷丹(Linliumlancifolium)又名虎皮百合、倒垂蓮，為百合科(Liliaceae)百合屬多年生草本花卉，花下垂呈橙紅色，內面有紫色斑點，具較高的觀賞、藥用和食用價值[3-4]。其分布廣泛，主要存在于我國河北、陜西、遼寧、吉林和貴州等17個省，在貴州黔東南州主要分布于黃平、施秉和雷山等地。卷丹的繁殖主要依靠常規(guī)的鱗片包埋、鱗片扦插、分株芽和分球等，長期的無性繁殖導致其品種退化，如病害嚴重、產量降低及品質下降等[5]。此外，由于市場的需求量增大，人為的濫采濫挖，野生卷丹群體受到嚴重的破壞，保護和擴大野生卷丹資源迫在眉睫。利用組培誘導不定芽建立再生體系可縮短生長周期，快速培育植株，有效解決其退化問題，保護其野生資源，滿足市場需求[6]。

卷丹組織培養(yǎng)始于20世紀80年代[7]，以鱗片的研究最早且最易成功，為國內卷丹組織培養(yǎng)研究奠定了基礎。目前，有關卷丹研究主要集中在遺傳多樣性[8]、核型分析[9]、功能基因克隆[10]、組織培養(yǎng)[11-17]、育種[5]以及種質資源保存[18]等方面。雷家軍等[8]利用AFLP技術對卷丹遺傳性狀標記，并成功構建遺傳圖譜，為其分子育種奠定了基礎。唐彪等[9]采用常規(guī)壓片法對5個不同種源產地卷丹進行染色體觀察發(fā)現，不同產地卷丹的染色體數目不同，為其有效保護和育種提供了背景資料。有研究[10]表明，利用RACE技術克隆的卷丹CCS基因已在其花瓣組織中表達。根據外植體的種類、采集季節(jié)和部位，其消毒試劑的選擇及時間略有不同[19]，陳貴華等[20-21]分別進行了卷丹消毒試劑的相關研究。張傳海等[22]研究發(fā)現，不同部位鱗片分化不定芽的效果總體上呈中層>外層>內層。蘇箐華等[23-24]研究發(fā)現，卷丹再生體系形成途徑主要有器官型、器官發(fā)生型和體細胞胚胎發(fā)生型等3種，器官發(fā)生型常用且形成再生植株的成功率較高。張鵬等[13]研究發(fā)現，以鱗片為外植體誘導不定芽形成再生植株的最適培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。謝杰等[25]用0.01～0.10 mg/L 2,4-D誘導宜興百合小鱗莖產生愈傷組織并獲得再生植株。體細胞胚胎發(fā)生型途徑較其他2種途徑復雜。翟彥[26]采用體細胞胚胎發(fā)生型途徑成功獲得“黃天霸”和“西伯利亞”花絲的胚性愈傷組織。沈琛[18]認為，玻璃化法超低溫保存的最佳材料為繼代2代卷丹組培苗莖尖，其液氮保存后存活率達93.3%，顯著高于其他繼代處理，達到保存種質資源的目的。

目前卷丹的組培研究主要以栽培種鱗莖為主，未見貴州省野生種的相關報道。為此，筆者以黔東南野生卷丹鱗片為材料，以MS為基礎培養(yǎng)基，采用隨機區(qū)組試驗方法探究NAA、6-BA和2,4-D不同配比對不定芽誘導及再生植株形成的影響，以期篩選出各階段最佳培養(yǎng)基配方，進一步縮短生長周期，為野生卷丹種質資源的繁殖、保存與利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 植物 野生卷丹，采自凱里學院后山。選用無病蟲害，直徑8～10 cm的鱗莖避光存放備用。

1.1.2 試劑 70%乙醇(AR，重慶川東化工)，0.1% HgCl2，6-BA、NAA、2,4-D，MS基礎培養(yǎng)基(固體培養(yǎng)基，含蔗糖3.0%，瓊脂0.7%，pH5.8)，試劑均為分析純(AR)，其產地為天津科密歐(乙醇除外)。

1.1.3 儀器與設備 BSA124S電子天平(賽多利斯)，XQ-LS-75SⅡ高壓蒸汽滅菌鍋(上海博訊)，JH-1S超凈工作臺(北京科偉)。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體消毒 將野生卷丹鱗莖最外2層去除，然后取較外層無病斑、較厚實且顏色均勻的鱗片用流水沖洗1～2 h，洗凈并控干水分后放入超凈工作臺消毒：乙醇消毒30 s→無菌水清洗2～3次→HgCl2+1～2滴吐溫-80消毒10 min→無菌水清洗4～5次后備用。

1.2.2 試驗設計 該試驗均以MS為基礎培養(yǎng)基，并根據試驗設計(表1)要求分別添加不同濃度配比的6-BA、NAA以及2,4-D。培養(yǎng)條件：光照時間16 h/d，溫度25℃，相對濕度70%～75%。1)不定芽誘導培養(yǎng)。將已消毒的鱗莖切成0.8 cm×0.8 cm的小方塊，接種到誘導不定芽培養(yǎng)基中。試驗設9個處理，每個處理接種10瓶，每瓶接種外植體3個，3次重復。2)不定芽增殖培養(yǎng)。將初代培養(yǎng)誘導分化較健壯且無污染的叢生芽(芽高2～3 cm)分離成單株，接入不定芽增殖培養(yǎng)基中繼代增殖培養(yǎng)。試驗設9個處理，每個處理接種5瓶，每瓶接種不定芽3～5個。3)不定芽生根培養(yǎng)。將增殖培養(yǎng)的株高2 cm左右較強壯的叢生芽分離成單株，轉接入不同的生根培養(yǎng)基中。采用1/2 MS作為基礎培養(yǎng)基，試驗設9個處理，每個處理接種5瓶，3次重復。

表1 野生卷丹外植體不定芽誘導、增殖和生根培養(yǎng)基添加激素的組成與濃度

Table 1 Hormone composition and concentration of different media for induction, multiplication and rooting of L.lancifolium adventitious buds mg/L

注：-表示未添加。

Note:-no addition.

1.2.3 觀測指標 接種完成培養(yǎng)一段時間后，進行不定期觀察、拍照。 1) 不定芽誘導培養(yǎng)。待其生長60 d后統計外植體誘導率及單顆外植體誘導不定芽的個數，計算平均產芽數和不定芽誘導率。2) 不定芽增殖培養(yǎng)。待其生長30 d后觀察不定芽的增殖情況，觀察不定芽長勢并統計不定芽數量，計算不定芽增殖系數。3) 不定芽生根培養(yǎng)。待其生長40 d后統計其生根率、生根總數及單個鱗莖的生根數。

1.3 數據統計分析

數據采用Excel 2007軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 不同濃度激素配比對卷丹鱗莖不定芽誘導的影響

2.1.1 不定芽的形成 從圖1可見：將卷丹鱗莖接種在不同激素配比培養(yǎng)基中，4～5 d后小鱗莖由乳白色(圖1A)變?yōu)榍嗪稚?圖1B)，6～8 d后鱗莖的內面出現淺黃色的小凸起，不定芽即將形成(圖1C)；10～12 d后小凸起拔高形成不定芽，進一步形成叢生芽，且顏色轉變?yōu)榍嗑G色，而在小鱗莖的切口處出現不同程度的木質化(圖1D)；20 d后不定芽抽生葉片，且芽的長勢良好(圖1E)。

注：A，乳白色鱗莖；B，青褐色鱗莖；C，鱗莖內表面出現小凸起；D，鱗莖切口處木質化；E，不定芽形成。

Note: A, ivory bulbs; B, greenish brown bulbs; C, small uplift on bulbs; D, lignification on the incision of bulb; E, formation of adventitious buds.

圖 1 不同濃度激素配比處理卷丹鱗莖不定芽的形成過程

Fig.1 Formation process of adventitious buds cultured on media with different concentration and ratio of hormones

2.1.2 產芽數及誘導率 從圖2可見： 1) 不同處理對鱗莖的誘導產芽數不同，除處理7～9外，其余處理產芽數均高于3個。其中：濃度一定，不同低濃度2,4-D和NAA能夠促進不定芽誘導；處理7～9的誘導效果最差，處理4的誘導產芽數最多，為6.21個，且芽粗壯，長勢良好，分布集中；其次為處理1，產生不定芽4.21個，數目相對較多且分布較稀疏。表明，相同NAA濃度下，6-BA濃度為1.0～1.5 mg/L均有利于誘導不定芽。處理2、處理3、處理5和處理6平均產芽3.38個，產芽數較少，長勢一般。表明，6-BA表明，高濃度6-BA(2.0 mg/L)對不定芽的誘導有一定的抑制作用，導致出芽率低，且鱗莖褐化嚴重。2) 不同處理對鱗莖的誘導率不同，各處理誘導率均高于26%，平均達47.04%。其中，處理6的誘導率最高，達63.33%，處理8最低，為26.67%，處理1、處理2、處理4和處理5均高于45.00%，其余處理低于41.00%。表明，較低濃度NAA或2,4-D(0.5 mg/L)可促進卷丹鱗莖產芽；6-BA濃度為1.0～1.5 mg/L時可促進不定芽的誘導，6-BA濃度繼續(xù)升高則導致誘導率降低，表明，高濃度6-BA抑制不定芽的生長，誘導效果不佳。從不定芽出芽數及生長狀況看，處理4(MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.3 mg/L)培養(yǎng)基為最佳誘導不定芽培養(yǎng)基。

圖 2 不同濃度激素配比處理卷丹鱗莖的產芽數與誘導率

Fig.2 Inducted buds number and induction rate ofL.lancifoliumbuibs cultured on media with different concentration and ratio of hormones

2.1.3 6-BA對不定芽的誘導 當NAA濃度為0.5 mg/L時，隨6-BA濃度的升高，鱗片產生的不定芽數量增多且芽壯、蔥綠。其中，6-BA濃度為1.0 mg/L時，不定芽長勢較好，但數量相對較少，生長較慢(圖3A)；當6-BA濃度達1.5 mg/L時，不定芽生長密集且長勢良好(圖3B)；當6-BA濃度達2.0 mg/L時，不定芽數量增多且粗壯，但分化芽的能力較慢(圖3C)。表明，同一NAA濃度下，低濃度6-BA可促進不定芽的誘導，但超過一定濃度后，其誘導效果降低，分化能力減弱。

經方差分析，相同6-BA濃度下，不同生長素(NAA、2,4-D和NAA+2,4-D)均能誘導形成不定芽，其誘導效果依次為NAA>NAA+2,4-D>2,4-D。說明，低濃度生長素誘導不定芽具有促進作用，尤其是NAA效果最佳。

注：A～C中NAA濃度為0.5 mg/L，6-BA濃度依次為1.0 mg/L、1.5 mg/L和2.0 mg/L。

Note: A, Medium with 0.5 mg/L NAA + 1.0 mg/L 6-BA; B, Medium with 0.5 mg/L NAA + 1.5 mg/L 6-BA; C, Medium with 0.5 mg/L NAA + 2.0 mg/L 6-BA.

圖 3 不同濃度6-BA 處理卷丹鱗莖的不定芽生長

Fig.3 Growth of adventitious buds cultured on media with different 6-BA concentration

2.2 不同濃度激素配比對卷丹不定芽增殖培養(yǎng)的影響

2.2.1 增殖生長 從圖4可知，將生長健壯的不定芽轉接入增殖培養(yǎng)基中，20 d后單芽大部分出現膨大，顏色轉綠的現象；培養(yǎng)30 d左右，叢生芽的數目明顯增多，大部分單芽能夠分化出多個不定芽，且芽體更為粗壯。

注：A，不定芽開始增殖；B，不定芽膨大。

Note: A, Multiplication of adventitious buds; B, Expansion of adventitious buds.

圖 4 不同濃度激素配比處理卷丹不定芽的增殖生長

Fig.4 Multiplication of adventitious buds cultured on media with different concentration and ratio of hormones

2.2.2 增殖系數和增殖率 從圖5可知： 1) 增殖系數。處理4～6的增殖芽數最多，鱗莖粗壯且分化能力強，增殖系數>3，最大達3.46。其中，當6-BA濃度為1.0 mg/L時，隨NAA濃度的增加，增殖系數呈先升后降的趨勢。NAA濃度以0.3～0.5 mg/L較為適宜，高濃度NAA(1.0 mg/L)對鱗莖增殖無明顯促進作用。當6-BA濃度為0.5 mg/L時，處理1～3的增殖芽數較多，3個處理以處理2的增殖系數最高，為2.88。當6-BA濃度達2.0 mg/L(處理7～9)時，增殖芽數相對減少，其鱗莖較為粗壯，但對不定芽的增殖作用較小。表明，較高濃度的6-BA對不定芽壯苗有一定的促進作用，但對叢生芽分化的促進效果較差，其增殖系數較低。2) 增殖率。各處理的增殖率均高于49.00%，且處理間存在差異。其中，處理1和處理4的增殖率達56.67%，且其不定芽的長勢良好；其余處理的增殖率均低于54%，且其不定芽數量相對較少，長勢較弱。表明，6-BA濃度為0.5～1.0 mg/L時，隨6-BA濃度的增加，分化芽的數量依次增加，6-BA濃度繼續(xù)升高，出芽個數則相對減少。

經方差分析，相同濃度6-BA條件下，不同濃度NAA對不定芽增殖的促進作用依次為0.5 mg/L>0.2 mg/L>1.0 mg/L，但處理間影響效果的差異不顯著。其中，NAA 0.5 mg/L為不定芽增殖最佳濃度，較低濃度NAA對不定芽增殖效果相對較差，高濃度NAA對不定芽增殖有抑制作用。同時，在NAA濃度相同條件下，隨6-BA濃度的升高，各處理之間誘導不定芽增殖的差異顯著。其中，0.5～2.0 mg/L 6-BA對不定芽增殖生長具有促進作用。根據叢生芽的質量、增殖系數及長勢等判斷，處理5叢生芽的增殖系數最大，叢生芽較粗壯，長勢良好，不定芽增殖的最佳培養(yǎng)基為MS+NAA 0.5 mg/L+6-BA 1.0 mg/L。

圖5 不同培養(yǎng)基處理卷丹不定芽的增殖系數與增殖率

Fig.5 Multiplication coefficient and rate of adventitious buds cultured on different media

2.3 不同濃度激素配比對卷丹不定芽生根培養(yǎng)的影響

2.3.1 生根生長 從圖6可知，經增殖后的茁壯不定芽移入1/2 MS基礎培養(yǎng)基培養(yǎng)30 d后分化出褐色不定根，上有細小白色根毛，根系發(fā)達且粗壯；某些不定芽的芽體膨大，但根為白色且細小，無明顯根毛。

2.3.2 生根量與生根率 由圖7可知： 1) 生根量。無論是不定根的數量還是根系的發(fā)達程度，處理7(1/2 MS+NAA 1.0 mg/L)均優(yōu)于其他處理，其平均生根數最高，達6.20個，根系相對發(fā)達且粗壯；其次為處理4，平均生根4.2個，根系發(fā)達程度一般；處理3、處理6和處理9在觀察期內未發(fā)現不定根。由此表明，隨NAA濃度升高，平均生根數逐漸減少；添加低濃度的6-BA對生根有抑制作用，6-BA濃度為0.1 mg/L時，處理3、處理6和處理9未產生不定根；不同濃度NAA對生根有促進作用。2)生根率。處理4、處理5和處理7的生根率均高于75%，其中，處理7的生根率最高，達93.75%；處理1、處理2和處理8的生根率為58%～75%，且生根較慢，不定根細小而少，生長一般；處理3、處理6和處理9的生根率為0，無不定根的生成。由此表明，隨NAA濃度的升高，生根率呈下降趨勢；6-BA濃度過高對生根不利。

經方差分析：相同濃度 NAA條件下，不同濃度6-BA對不定芽生根的促進作用依次為0 mg/L>0.05 mg/L>0.1 mg/L，且處理間差異顯著。同時，相同濃度6-BA條件下，不同濃度NAA濃度對不定芽生根的促進作用依次為0.1 mg/L>0.5 mg/L>1.0 mg/L，且處理間差異明顯。說明，不同濃度的NAA與6-BA配比對不定芽的生根有較大影響。根據叢生芽生根數及生根狀況初步判定，處理7叢生芽的生根數最多，不定根粗壯，1/2 MS+NAA 1.0 mg/L為最佳不定芽生根培養(yǎng)基。

注：A，粗壯不定根；B，細小不定根。

Note: A, sturdy adventitious roots; B, tiny adventitious roots

圖6 卷丹不定芽在1/2 MS基礎培養(yǎng)基上的不定根生長

Fig.6 Growth of adventitious roots of adventitious buds cultured on 1/2 MS

圖7 不同濃度激素配比處理卷丹的生根量和生根率

Fig.7 Rooting number and rate of adventitious buds cultured on different concentraticn of hormone

3 結論與討論

1) 在6-BA濃度一定的情況下，NAA對野生卷丹鱗莖不定芽的誘導效果明顯高于2,4-D和NAA+6-BA組合；最佳不定芽誘導培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.3 mg/L。與潘理云等[13，22，27]的結論一致。說明，該試驗篩選的誘導培養(yǎng)基適合誘導貴州野生卷丹。

2) 野生卷丹鱗片誘導不定芽的最佳6-BA濃度為1.5 mg/L，其平均芽個數最多且不定芽生長情況良好，與石印等[15-16]的研究結論一致，但與鐘燦等[17]的結果不同，可能與后者pH的調節(jié)及培養(yǎng)條件不同有關。

3) 6-BA濃度為0.2～1.5 mg/L時，適當的高濃度可以有效地提高卷丹繼代增殖培養(yǎng)的增殖系數，但濃度過高則可能出現抑制作用。該試驗繼代增殖培養(yǎng)最適6-BA和NAA濃度分別為1.0 mg/L和0.2～0.5 mg/L，最佳生根培養(yǎng)基為6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L，與郭海濱等[4, 28-29]的結果一致；不定芽增殖培養(yǎng)最適6-BA濃度為0.5～2.0 mg/L。

4) NAA在一定濃度下能夠促進生根，且生根效果較好。該試驗最適不定芽生根培養(yǎng)基為1/2 MS+NAA 1.0 mg/L，與何薇等[3,11,30]的研究結果一致。但路森[31]研究發(fā)現，最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS+NAA 0.3 mg/L，生根率為94%，較低濃度的NAA更有利于不定根的產生，與該試驗的結果不一致，可能與百合品種有關。

5) 有關野生百合組培外植體的選擇與消毒方法、激素的選擇與配比、再生途徑等方面的研究均已有相關文獻報道[14]，但存在差異。該試驗使用70%乙醇消毒30 s，再用0.1% HgCl2+1～2滴吐溫-80消毒10 min的處理方法能夠大幅度地降低初代不定芽誘導時的污染，這與王昱淇[32]的結果一致。黃敏等[33]研究發(fā)現，外層鱗片用75%乙醇處理30 s，再用0.1% HgCl2浸泡18～20 min最佳；中層和內層鱗片用75%乙醇處理30 s，再用0.1% HgCl2浸泡14～16 min最佳。該試驗僅選用中外層鱗莖進行研究，存在一定的局限性，今后將在外植體選擇等方面進一步進行試驗。

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(責任編輯： 王 海)

Adventitious Buds Induction and Plantlet Regeneration of WildLiliumlancifolium

JIANG Yao, CHEN Wenbo, ZHOU Zengli

(CollegeofEnvironmentandLifeScience,KailiUniversity,Kaili,Guizhou556011,China)

The induction and plantlet regeneration of wildL.lancifoliumadventitious buds cultured on media with different concentration and ratio of NAA, 6-BA and 2,4D were studied by a randomized block test to provide the scientific basis for reproduction, conservation and utilization of wildL.lancifoliumresources. Results:under the same 6-BA concentration,the induction ofL.lancifoliumadventitious buds is NAA >NNA+2,4-D>2,4-D.The optimum medium for induction ofL.lancifoliumadventitious buds is MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.3 mg/L and average 6.21 buds can be inducted. The optimum medium for multiplication ofL.lancifoliumadventitious buds is MS+NAA 0.5 mg/L+6-BA 1.0 mg/L and its multiplication coefficient is up to 3.46. The optimum medium for rooting ofL.lancifoliumadventitious buds is 1/2 MS+NAA 1.0 mg/L and average 6.20 roots are produced.

WildLiliumlancifolium; adventitious buds Induction; regeneration plantlet; tissue culture

2015-09-11； 2016-05-05修回

貴州省科技廳自然科學研究項目“黔東南州野生百合耐熱基因的克隆及其耐熱性研究” [黔科合J字 (2014) 2153]；凱里學院博士專項基金項目“黔東南州野生百合高效離體培養(yǎng)及理化分析”(BS201332)

蔣 瑤(1982-)，女，副教授，博士，從事植物生物技術研究。E-mail: jiangyao0221@163.com

1001-3601(2016)05-0212-0097-06

S682.2

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