陳 慧， 王會芳， 陳綿才*

(1.海南省農(nóng)業(yè)科學院 植物保護研究所， 海南省病蟲害防控重點實驗室， 海南 海口 571100； 2.海南大學 環(huán)境與植物保護學院， 海南 ?？?571101)

象耳豆根結(jié)線蟲的研究進展

陳 慧1,2， 王會芳1， 陳綿才1*

(1.海南省農(nóng)業(yè)科學院 植物保護研究所， 海南省病蟲害防控重點實驗室， 海南 ?？?571100； 2.海南大學 環(huán)境與植物保護學院， 海南 ?？?571101)

象耳豆根結(jié)線蟲(Meloidogyneenterolobii)致病力強、寄主范圍廣，種群擴散迅速，給農(nóng)作物造成毀滅性危害，尤其在熱帶及亞熱帶地區(qū)根結(jié)線蟲常年危害嚴重，逐漸成為熱帶和亞熱帶地區(qū)最重要的根結(jié)線蟲之一。隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展，設(shè)施大棚和溫室在生產(chǎn)上的應(yīng)用不斷增多，導致土壤溫度上升，象耳豆根結(jié)線蟲向內(nèi)地蔓延速度不斷加快，已受到國內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注。從象耳豆根結(jié)線蟲的分布、鑒定、防治和進化樹構(gòu)建等方面進行綜述，旨在為同類研究與應(yīng)用提供參考。

根結(jié)線蟲； 鑒定； 防治； 象耳豆根結(jié)線蟲

根結(jié)線蟲(Meloidogynespp)作為世界性危害的線蟲種群之一，分布于世界各地，目前已有100余種，寄主植物達3 000多種，侵染危害經(jīng)濟作物達100種以上。根結(jié)線蟲自身可攜帶并傳播真菌、細菌和病毒等病原物，加重土傳病害的發(fā)生，引起并發(fā)癥和復合癥，造成更嚴重的經(jīng)濟損失，也給病害的診斷帶來困難[1]。

象耳豆根結(jié)線蟲(Meloidogyneenterolobii)具有強致病力、寄主范圍廣、能克服線蟲Mi抗性基因[2-5]，對農(nóng)作物造成毀滅性的危害。尤其在熱帶、亞熱帶地區(qū)，根結(jié)線蟲無越冬現(xiàn)象，常年危害較為嚴重[6]，逐漸變?yōu)闊釒Ш蛠啛釒У貐^(qū)最重要的根結(jié)線蟲之一。象耳豆根結(jié)線蟲是優(yōu)勢種，種群擴散快速，已成為華南地區(qū)重要根結(jié)線蟲種群。象耳豆根結(jié)線蟲于1983年由楊寶君等[7]在我國海南省儋州市象耳豆樹上發(fā)現(xiàn)并鑒定和命名，在我國海南省和廣東省分布較為廣泛。2013年，首次報道福建省象耳豆根結(jié)線蟲對福建番石榴果樹的危害[8]，可見象耳豆根結(jié)線蟲正在向內(nèi)地擴散。隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展，設(shè)施大棚、溫室不斷增加導致土壤溫度的上升，象耳豆根結(jié)線蟲入侵北方地區(qū)成為可能。2015年胡先奇[9]首次在云南元謀發(fā)現(xiàn)被象耳豆根結(jié)線蟲侵染的辣椒植株，這也是首次在云南發(fā)現(xiàn)象耳豆根結(jié)線蟲。象耳豆根結(jié)線蟲的蔓延速度不斷加快，如果不能及時控制，將會給我國農(nóng)業(yè)帶來巨大損失。

1 分布

根結(jié)線蟲屬線蟲分布于世界各地[10]，在非洲、美洲、歐洲均發(fā)現(xiàn)象耳豆根結(jié)線蟲的分布。法國是歐洲最早發(fā)現(xiàn)象耳豆根結(jié)線蟲的國家，瑞士在2008年也遭遇象耳豆根結(jié)線蟲的入侵，使瑞士的西紅柿和黃瓜減產(chǎn)；非洲報道象耳豆根結(jié)線蟲入侵的國家有布基納法索、科特迪瓦、馬拉維、塞內(nèi)加爾和南非；北美洲的美國和墨西哥均報道有象耳豆根結(jié)線蟲的入侵，且美國多個州都報道有象耳豆根結(jié)線蟲的入侵；中北美及加勒比海地區(qū)有哥斯達黎加、馬提尼克島、古巴、波多黎各、特立尼達和多巴哥報道有象耳豆根結(jié)線蟲的入侵；巴西和委內(nèi)瑞拉是目前報道有象耳豆根結(jié)線蟲入侵的2個南美洲國家；而在亞洲，中國和越南報道有象耳豆根結(jié)線蟲的入侵，我國的海南、廣東、福建、云南、遼寧均報道有象耳豆根結(jié)線蟲的分布，其中云南是最近才發(fā)現(xiàn)有象耳豆根結(jié)線蟲入侵的省份。

2 生物學特性

2.1 生活習性

象耳豆根結(jié)線蟲的完整生活史包括經(jīng)卵、幼蟲、成蟲3個階段[11]。成雌蟲具特征性的會陰花紋，常將卵產(chǎn)在尾部體外的膠質(zhì)卵囊內(nèi)。大田中以卵或其他蟲態(tài)在土壤中越冬，多在土層5～30 cm處活動，無寄主植物條件下可存活3 a。土溫在10～40℃適于根結(jié)線蟲生活，侵染活力最強的溫度因不同種群而定，基本為15～30℃。

象耳豆根結(jié)線蟲與其他常見四大根結(jié)線蟲比較，50條/500 cm3初始接種密度就能侵染寄主植物，具有很強的致病力。最適侵染溫度為28～30℃，在熱帶、亞熱帶地區(qū)分布比較廣，象耳豆根結(jié)線蟲無越冬現(xiàn)象，這樣就加重了對該地區(qū)寄主植物的危害程度。44℃半致死時間也較長，說明其對高溫的抗逆性相對較強，這也導致象耳豆根結(jié)線蟲更容易傳播。有報道象耳豆根結(jié)線蟲已經(jīng)在向云南[9]、福建[12]等內(nèi)陸地區(qū)蔓延，北方大量采用溫室種植使象耳豆根結(jié)線蟲蔓延到北方成為可能。

2.2 致病機理

植株根系被象耳豆根結(jié)線蟲侵染后，會對植株生長特性、營養(yǎng)元素吸收和分配、水分代謝及其相關(guān)生理特性、保護酶系統(tǒng)、內(nèi)源激素水平和呼吸作用產(chǎn)生影響[13]，從而導致植株發(fā)病。

侵染植株后，植株根部形成根結(jié)，根結(jié)線蟲用相關(guān)水解酶、口針的機械壓力對根尖進行降解、穿刺侵染造成的機械損傷，并且造成根部導管、表皮和皮層組織破裂，導致植株發(fā)生土傳病害的幾率上升。機械損傷誘發(fā)枯萎病菌、根腐病菌等土傳病原物侵染危害[14]。植株營養(yǎng)元素吸收和分配發(fā)生改變，致使植株生長緩慢和早衰；植株水分代謝出現(xiàn)異常，降低水分在體內(nèi)的運輸，嚴重時會導致葉子枯黃，甚至植株死亡；導致一些植株光合色素含量發(fā)生變化，影響光合速率，對植株生長產(chǎn)生影響；使植株自身保護酶的活性發(fā)生嚴重變化，破壞保護系統(tǒng)，提高植株被侵染的概率；對植株內(nèi)源激素和呼吸作用同樣會有影響，內(nèi)源激素紊亂導致植株生理上發(fā)生一些病變，呼吸速率改變使植株生長受到很大影響。根結(jié)線蟲表皮、側(cè)器、食道腺可降解寄主細胞壁，中膠層等，食道腺誘導巨型細胞形成[14]。這一系列的變化可導致被侵染的植株出現(xiàn)病變、減產(chǎn)、甚至死亡的現(xiàn)象[15]。

3 鑒定方法

目前，根結(jié)線蟲的鑒定方法主要利用形態(tài)學比較、同工酶分析、分子生物學技術(shù)等手段。分子生物學技術(shù)的優(yōu)勢日益凸顯，成為目前應(yīng)用最廣的一種鑒定手段。傳統(tǒng)寄主鑒別實驗和細胞遺傳學方法一般用于初步鑒定，準確鑒定需要進一步采用分子生物學技術(shù)。

3.1 形態(tài)學比較

成熟雄蟲的形態(tài)呈線形，成熟雌蟲的形態(tài)呈梨形(圖示a)。雌蟲主要通過蟲體長度與寬度、會陰花紋形狀、口針形態(tài)與長度、排泄孔口位置來鑒定。雄蟲(圖示b)主要通過體型的頭部形態(tài)、側(cè)線數(shù)量、口針長度與形態(tài)、口針基部至背食道腺開口距離等來鑒定。二齡幼蟲主要通過頭部、尾部的形態(tài)鑒定。

分子生物學鑒定方法未出現(xiàn)之前，會陰花紋形態(tài)學鑒定一直是根結(jié)線蟲鑒定的主要方式[1]。會陰花紋基本特征長時間不會顯著改變，是一種相對可靠的鑒定方法。但經(jīng)過長時間的進化，會陰花紋可能會產(chǎn)生一定變異，從而使鑒定結(jié)果產(chǎn)生差錯，導致結(jié)果不準確。象耳豆根結(jié)線蟲雌蟲會陰花紋通常呈卵圓形,線紋平滑到粗糙(圖示c)，無明顯側(cè)線，陰門周圍通常無線紋。象耳豆根結(jié)線蟲部分會陰花紋形態(tài)與花生根結(jié)線蟲相似，與南方根結(jié)線蟲會陰花紋(圖示d)比較相似，有些看起來幾乎完全一致。因此，在象耳豆根結(jié)線蟲純化鑒定中，通常形態(tài)學鑒定與分子生物學手段結(jié)合進行綜合鑒定。

圖示 根結(jié)線蟲雌蟲(a)、雄蟲(b)、象耳豆根結(jié)線蟲會陰花紋(c)與南方根結(jié)線蟲會陰花紋(d)[16]

Fig.Meloidogynesppfemales (a) ,Meloidogynesppmales (b) ,female perineal patterns ofM.enterolobii(c) , female perineal patterns ofM.incognita

3.2 同工酶分析

根結(jié)線蟲間種類變異非常小，同工酶分析酶譜變異小。根結(jié)線蟲雌成蟲酶譜是鑒定根結(jié)線蟲種的可靠標記。酯酶和蘋果酸脫氫酶同工酶酶譜最為穩(wěn)定，具有種的特異性，對四大根結(jié)線蟲的鑒定十分有效。同工酶方法快速、準確，而有的種會產(chǎn)生多種酶譜類型，給鑒定帶來干擾。同工酶分析適用于雌成蟲，不適用幼蟲或卵的檢測[17]。根結(jié)線蟲寄主小種的同工酶表型存在多態(tài)性,但其穩(wěn)定性和適用性受到質(zhì)疑[18]。目前同工酶分析僅可以鑒定到根結(jié)線蟲的種,尚不能區(qū)分寄主小種[19]。

3.3 PCR鑒定

植物根結(jié)線蟲DNA的差異通過PCR技術(shù)的診斷，不受基因的表達產(chǎn)物、環(huán)境和線蟲發(fā)育階段的影響，因此得到廣泛應(yīng)用。與形態(tài)學、同工酶鑒定法比較，PCR診斷法的突出優(yōu)勢是結(jié)果更加可靠、快捷、靈敏，適用于各階段蟲態(tài)。PCR鑒定技術(shù)主要基于植物根結(jié)線蟲之間IGS序列、mtDNA序列以及rDNA-ITS序列的不同進行鑒定。

何旭峰[20]等在環(huán)介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技術(shù)的基礎(chǔ)上研究出從植物罹病組織中直接檢測象耳豆根結(jié)線蟲的快速檢測方法，該方法以rDNA-ITS序列為靶基因，在特定反應(yīng)條件下，45 min完成擴增，擴增效率極高，特異性強，靈敏度為1/200 000頭線蟲DNA，比其他PCR方法靈敏度高約100倍。該方法讓快速檢測方法的研究邁進了一大步。楊意伯等[12]利用形態(tài)學觀察結(jié)合rDNA-ITS序列分析、RAPD等分子生物學技術(shù)，研究了福建省象耳豆根結(jié)線蟲的形態(tài)學變異和遺傳多樣性。

這些方法各有優(yōu)缺點，只有選擇合適的方法才能準確有效鑒定出象耳豆根結(jié)線蟲。Blok等[21]發(fā)現(xiàn)，象耳豆根結(jié)線蟲的IGS序列和四大根結(jié)線蟲有明顯差異，可用于象耳豆根結(jié)線蟲單條線蟲的直接鑒定、混合線蟲群體中象耳豆根結(jié)線蟲的檢測[22]。Blok V C等[23]根據(jù)根結(jié)線蟲mtDNA差異，開發(fā)出象耳豆根結(jié)線蟲的PCR檢測方法，是迄今己報道較為可靠的根結(jié)線蟲檢測方法，靈敏度可達單條二齡幼蟲。

4 系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

為確定生物體間正確的生物進化關(guān)系，選擇合適的基因片段用于序列分析是必要的。根結(jié)線蟲的進化關(guān)系通過同工酶分析、DNA雜交、SSU rDNA測序、rDNA-ITS序列和mtDNA等數(shù)據(jù)中推斷而來。利用DNA star軟件的MegAlign分析SSU rRNA基因的序列數(shù)據(jù)相似性和分化度，揭示了根結(jié)線蟲屬內(nèi)種間的相互關(guān)系。研究者利用從南方根結(jié)線蟲隨機分離pMi9的探針，針對南方根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲和瓜哇根結(jié)線蟲之間的進化關(guān)系進行構(gòu)建[24]。

5 防治

5.1 化學藥劑防治

雖然化學農(nóng)藥會帶來諸多環(huán)境問題，但是化學防治手段依然是現(xiàn)在最主要的防治手段，其作用暫時是其他類型防治方法無法比擬的，防效最為顯著，價格也相對便宜?；瘜W農(nóng)藥防治根結(jié)線蟲具有快速、高效、通用性強和經(jīng)濟效益高等優(yōu)點。隨著高毒化學藥劑被逐漸禁用，市場上只有很少一部分控制根結(jié)線蟲的高效、低毒、低污染藥劑?，F(xiàn)在市場上流行的主要有無線美、海綠素、阿維菌素[25]以及康綠功臣[26]等生物藥劑。因此，生物農(nóng)藥的發(fā)展勢在必行，生物農(nóng)藥具有生產(chǎn)原料來源廣泛，對靶標生物定向性好、作用持久、對其他生物毒副作用小和環(huán)境兼容性好等優(yōu)點，逐漸成為未來農(nóng)藥發(fā)展的新趨勢[27]。

5.2 生物防治

抗根結(jié)線蟲的微生物拮抗菌株主要有假單胞菌屬(Pseudomonas)[28]、擬青霉屬(Paecilomyces)[29]、巴斯德菌屬(Pasteurella)[30]、木霉屬(Trichoderma)[31]、芽孢桿菌(Bacillus)[32]和鏈霉菌屬(Streptomyces)[33]等，在大田中微生物拮抗根結(jié)線蟲菌株防治效果不穩(wěn)定，難以達到防治目的。陳芳等[34]研究表明，生物有機肥能有效抑制甜瓜土壤根結(jié)線蟲對大田的危害。筆者常使用空心菜培養(yǎng)象耳豆根結(jié)線蟲，種植空心菜的土壤中施用有機肥的作物明顯漲勢好，根結(jié)少，而未施用有機肥的空心菜能夠產(chǎn)生大量根結(jié)。象耳豆根結(jié)線蟲可克服Mi抗原基因的抗性，也不會被穿刺巴氏桿菌(Pasteuriapenetrans)寄生[20]。因此，象耳豆根結(jié)線蟲在生物防治方面有亟待解決的問題，隨著基因工程的不斷發(fā)展，卓侃等[35]將象耳豆根結(jié)線蟲寄生基因ME-PL-1利用RNA干擾技術(shù)進行基因沉默，使ME-PL-1基因表達下調(diào)，從而降低象耳豆根結(jié)線蟲侵染力，為象耳豆根結(jié)線蟲防治提供了另一條途徑。

5.3 農(nóng)業(yè)防治

曹志平等[41]通過引入小麥秸稈抑制線蟲病的發(fā)生，添加適量的小麥秸稈對根結(jié)線蟲抑制率達94%，效果明顯。秸稈焚燒造成嚴重空氣污染，并且還殺死了土壤中的有益微生物。小麥秸稈還田模式生態(tài)環(huán)保，植食性線蟲種類大幅度下降，食線蟲微生物比列上升近1倍。

根結(jié)線蟲的農(nóng)業(yè)防治措施主要包括深翻土壤、輪作、高(低)溫抑蟲、無病土育苗、土壤處理和集中處理病根等傳統(tǒng)處理根結(jié)線蟲的方法。郭玉蓮[36]和房華[37]分別利用雞糞和茶樹菇的菌渣防治根結(jié)線蟲病發(fā)生的研究，雞糞水和茶樹菇的菌渣都能夠抑制根結(jié)線蟲種群生長。馬駿[38]利用有機溶劑萃取芝麻渣有效成分，作用于根結(jié)線蟲，有良好的抑制效果。此外施用生物有機肥，不僅能促進植物的生長，而且對土壤根結(jié)線蟲的抑制有明顯作用[34]。很多農(nóng)業(yè)防治研究對象耳豆根結(jié)線蟲種群生長抑制也是通用的。因此，有機物不僅可以有效降低象耳豆根結(jié)線蟲的數(shù)量，還可以促進作物生長，改良品質(zhì)，提高作物抗性，現(xiàn)在很多病害都可以用農(nóng)業(yè)防治來輔助防治。

5.4 物理防治

物理防治是一個重要的防治手段，越來越受到廣大研究者的重視，與化學防治相比，物理防治的優(yōu)點較多，如具有環(huán)保、污染小、無殘留、不會產(chǎn)生抗性等優(yōu)點。順應(yīng)了當今有機農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需求，因而物理方法是一種較理想的無公害防治方法[39-40]，可在象耳豆根結(jié)線蟲的防治上加以應(yīng)用。

5.5 抗性品種

抗病育種工作在中國起步晚，相比歐美國家研究還有很大差距。需與國外該領(lǐng)域領(lǐng)先地位的國家加強進行技術(shù)合作和交流，提高中國抗根結(jié)線蟲病育種的水平。國外早已培育出了抗根結(jié)線蟲Mi基因的辣椒、番茄等抗性品種。由于象耳豆根結(jié)線蟲具有強致病力，能侵染Mi抗性基因的植物，目前，還未見抗象耳豆根結(jié)線蟲的抗性品種在生產(chǎn)上應(yīng)用。

5.6 植物檢疫

建立植物檢疫站，嚴格執(zhí)行植物檢疫法，嚴格做好檢疫工作，充分認識植物檢疫的重要意義，加強檢查監(jiān)督，從源頭抓起，準確鑒定病原類型[42]。然而，象耳豆根結(jié)線蟲在福建省也有報道，其種群為海南種群和哥斯達黎加種群2種不同的基因型，中國內(nèi)地一些溫室里也發(fā)現(xiàn)了象耳豆根結(jié)線蟲。說明我國植物檢疫工作還很薄弱。荷蘭、德國和英國等國家從進口的植物中攔截到象耳豆根結(jié)線蟲，從而避免了象耳豆根結(jié)線蟲對這些國家的危害。由此看出，檢驗檢疫在象耳豆根結(jié)線蟲防治工作中具有重要作用。應(yīng)做好象耳豆根結(jié)線蟲種群的植物檢疫工作，嚴格控制其種群的進一步擴散[12]。

6 展望

根結(jié)線蟲各種形態(tài)十分相似，鑒定難度大。鑒定方法可能存在諸多問題，需要形態(tài)學與生物化學、分子生物學和DNA條形碼等鑒定方法相結(jié)合，才能更加準確地鑒定出根結(jié)線蟲種類[42]?？焖贆z測已經(jīng)成為根結(jié)線蟲鑒定的大趨勢，基因工程技術(shù)的應(yīng)用為根結(jié)線蟲快速檢測發(fā)展打下了堅實的基礎(chǔ)。何旭峰等[20]在環(huán)介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技術(shù)的基礎(chǔ)上研究表明，從植物罹病組織中直接檢測象耳豆根結(jié)線蟲的快速檢測方法，使快速檢測方法的研發(fā)向前邁進一大步。楊意伯等[11]利用形態(tài)學觀察結(jié)合rDNA-ITS序列分析、RAPD等分子生物學技術(shù)，研究了福建省象耳豆根結(jié)線蟲的形態(tài)學變異和遺傳多樣性。準確的種群鑒定需要建立在形態(tài)學、同工酶表型、mtDNA-PCR-RFLP分析綜合運用的基礎(chǔ)之上[43]。利用綜合鑒定檢測技術(shù)手段，嚴密監(jiān)控象耳豆根結(jié)線蟲最新發(fā)病動向。

目前，對根結(jié)線蟲的防治還較困難，要很好地控制根結(jié)線蟲的危害，必須嚴格貫徹“預防為主、綜合防治”的植保方針。現(xiàn)用于防治象耳豆根結(jié)線蟲的主要方法還是化學防治，而殺線劑價格相對較高，導致防治成本居高不下?，F(xiàn)在市面上使用的殺線劑對環(huán)境造成污染，在今后研究中，應(yīng)該加強對農(nóng)業(yè)防治、物理防治和生態(tài)防治等措施的研究，提高其防治效果。配合化學防治，綜合防治根結(jié)線蟲病害，控制象耳豆根結(jié)線蟲種群的進一步擴散，讓防治成本下降的同時提升防效?？共∮N是很多病害防治的主要方法，但是近年來抗根結(jié)線蟲病害育種進展并不順利，很多技術(shù)難題未能攻克，導致防治線蟲的效果一直不好。象耳豆根結(jié)線蟲給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了極大的損失，應(yīng)該加大對防治象耳豆根結(jié)線蟲的研究力度，突破抗病育種方法防治象耳豆根結(jié)線蟲病害的技術(shù)難題。

象耳豆根結(jié)線蟲的相關(guān)研究表明，象耳豆根結(jié)線蟲種群擴散趨勢的加快，已經(jīng)成為亞熱帶地區(qū)、內(nèi)陸溫室大棚一種優(yōu)勢種群。因此，隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)的發(fā)展，象耳豆根結(jié)線蟲的準確鑒定工作、防治研究仍然是未來科研工作的熱點。鑒于對根結(jié)線蟲的鑒定、系統(tǒng)進化、防治的研究不斷的深入，對其了解也不斷加深，為象耳豆根結(jié)線蟲的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

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(責任編輯： 劉 海)

Research Progress ofMeloidogyneenterolobii

CHEN Hui1,2， WANG Huifang1， CHEN Miancai1*

(1.InstituteofEnvironment&PlantProtection,HainanAcademyofAgriculturalSciences,HainanKeyLaboratoryforControlofPlantDiseasesandInsectPests,Haikou,Hainan571100; 2.EnvironmentandPlantProtectionCollege,HainanUniversity,Haikou,Hainan571101,China)

With the characteristics of highly pathogenic, widely host range and rapidly diffusion,M.enterolobiimay cause serious devastation to crops, especially in tropical and subtropical regions. The increasing application of greenhouses and greenhouse facilities, as the development of modern agriculture, lead to the rising soil temperature, which accelerating the diffusion ofM.enterolobiiworms that has got extensive attention of the scholars in domestic and abroad. The authors describes theM.enterolobiiin the view of identification, distribution and the construction of evolutionary tree in order to provide a theoretical reference for related studies.

Meloidogynespp；identification；prevention and control；Meloidogyneenterolobii

2015-11-16; 2016-05-08修回

國家自然科學基金項目(31360432，31260424)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201103018)

陳 慧(1991-)，男，在讀碩士，研究方向：植物病原線蟲。E-mail：535880491@qq.com

*通訊作者：陳綿才(1959-)，男，研究員，碩士，從事植物病理學研究。E-mail：miancaichen@163.com

1001-3601(2016)05-0200-0051-05

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