李勝忠， 程先友， 董亞菲， 周桂珍， 張娟利， 張玉嬌

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院， 新疆 烏魯木齊 830052； 2.新疆水產(chǎn)科學(xué)研究所， 新疆 烏魯木齊 830000)

江鱈精子的形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)觀察

李勝忠1， 程先友2， 董亞菲1， 周桂珍1， 張娟利1， 張玉嬌1

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院， 新疆 烏魯木齊 830052； 2.新疆水產(chǎn)科學(xué)研究所， 新疆 烏魯木齊 830000)

為江鱈精子活力及人工繁殖受精率的提高提供參考，應(yīng)用掃描電鏡和透射電鏡觀察了江鱈精子的外部形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明:江鱈精子由頭部、頸部和尾部3部分構(gòu)成，沒有植入窩。頭部呈橢球形，長(1.6±0.3)μm；頸部前寬后窄，長(0.6±0.2)μm；尾部細(xì)長，長(16.1±4.3)μm。江鱈精子頭部有背腹之分，背部有少量細(xì)胞質(zhì)；腹部主要是細(xì)胞核，其中染色質(zhì)的電子密度呈均勻、致密分布，沒有網(wǎng)絡(luò)狀間隙，細(xì)胞核前端無頂體。江鱈精子頸部由中心粒復(fù)合體和袖套構(gòu)成。中心粒復(fù)合體分為近端中心粒和遠(yuǎn)端中心粒(基體)，近端中心粒由9組三聯(lián)微管組成，沒有中央微管，近端中心粒的長軸與細(xì)胞核的長軸呈垂直關(guān)系。江鱈精子尾部的核心結(jié)構(gòu)是軸絲，由9組外周二聯(lián)微管和1對中央微管組成，是典型的“9+2”微管結(jié)構(gòu)，尾部外表面有由質(zhì)膜向兩側(cè)突出而成的側(cè)鰭，左右側(cè)鰭大小不同。

江鱈； 精子； 形態(tài)； 超微結(jié)構(gòu)

江鱈(Lotalota)隸屬鱈形目(Gadiformes)、鱈科(Gadidae)、江鱈屬(Lota)，是分布于北極淡水區(qū)系類群的冷水性魚類，多見于北緯45°以北的歐洲、亞洲和北美洲的內(nèi)陸河湖和海灣處。在我國主要分布于黑龍江、鴨綠江、烏蘇里江、松花江和新疆額爾齊斯河水系[1]。近年來，由于環(huán)境污染、氣候變暖和人為過度捕撈等因素，導(dǎo)致新疆額爾齊斯河水系江鱈自然種群數(shù)量急劇下降，捕撈種群出現(xiàn)低齡化和小型化現(xiàn)象，種群生存受到威脅。因此，開展江鱈的相關(guān)研究意義重大。楊雨壯等[2]對鏡泊湖水域江鱈性腺發(fā)育演替規(guī)律研究表明，江鱈第二性征與生殖洄游期間的成熟系數(shù)、肝指數(shù)和攝食指數(shù)間存在階段性同步變化。錢龍等[3]對江鱈受精卵的孵化條件研究表明，1℃無光條件下，江鱈的出苗率最高，光照和孵化溫度升高均會降低孵化率、提高畸形率。高曉田等[4]研究表明，江鱈仔魚體長的緩慢增長具有階段性，體長的生長期與停止期交替出現(xiàn)。田永勝等[5]研究了額爾齊斯河江鱈精子冷凍保存的條件。但到目前為止，未見江鱈精子形態(tài)結(jié)構(gòu)的研究報道。為此，筆者應(yīng)用掃描電鏡和透射電鏡，觀察江鱈精子的外部形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)，以期為江鱈精子活力及人工繁殖受精率的提高提供參考。

1 材料與方法

1.1 江鱈親魚及精液采集

江鱈親魚采集于新疆額爾齊斯河，體長60～92 cm，體重0.86～2.1 kg，暫養(yǎng)于烏魯木齊市米東區(qū)新疆盛匯生態(tài)漁業(yè)有限公司。選擇活躍健壯、體表鮮亮完好的成熟期雄魚個體，擦干體表水分，用手輕壓魚腹部使精液流出滴入干燥冰浴玻璃瓶中，精液為乳白、黏稠，無血、尿、黏液等污染。采精時注意避免高溫和陽光直射。

1.2 精液預(yù)處理

固定：取新鮮精液0.5 mL，加2.5%戊二醛(0.2 mol/L，pH 7.4，磷酸緩沖液配制)溶液1.0 mL，固定0.5～24 h。清洗：吸取樣品1 mL，加0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)5 mL離心清洗(1 000 r/min，10 min)3次，緩慢倒出上清液，每次管底應(yīng)留有不少于0.5 mL。脫水：使用30%、50%、70%、80%、90%和100%濃度乙醇進行梯度脫水，每梯度脫水15 min，1 000 r/min離心10 min。置換：使用無水乙醇/丙酮(1∶1)、無水乙醇/丙酮(1∶4)、純丙酮進行置換，每次置換30 min，1 000 r/min離心10 min，去除上清液，留存管底白色絮狀物。

1.3 精子掃描電鏡觀察

用滴管吸取預(yù)處理后的白色絮狀物至載物臺上，自然干燥，然后進行噴金導(dǎo)電處理：HITCH-1010離子濺射儀，時間80 s，電流15 mA，真空7～10 pa。噴金處理后的樣品在電鏡(日立S-570型)下觀察，電鏡參數(shù)遵照默認(rèn)設(shè)定。選取結(jié)構(gòu)清晰、分界明顯的圖片拍照進行分析。

1.4 精子透射電鏡觀察

白色絮狀物使用EPon812包埋劑/丙酮(4∶1)、純EPon812包埋劑對細(xì)胞進行滲透，最后用EPon812包埋劑對細(xì)胞進行包埋，分別在37℃、42℃和60℃溫度下聚合72 h，然后進行超薄切片(厚度100 nm)，并用銅網(wǎng)撈取切片，用醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色后清洗多余染料，在電鏡(日立H-600型)下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 江鱈精子的外部形態(tài)

江鱈精子主要由頭部、頸部(中段)和尾部3部分構(gòu)成(圖1-A)，沒有植入窩。頭部呈橢球形，表面光滑，長(1.6±0.3)μm；頸部即精子中段較短(圖1-B)，前寬后窄，長(0.6±0.2)μm；尾部細(xì)長，長(16.1±4.3)μm。

2.2 江鱈精子超微結(jié)構(gòu)

2.2.1 頭部 江鱈精子頭部呈橄欖球形(圖2-A)，長軸為(1.6±0.3)μm，短軸為(1.0±0.2)μm；精子頭部有背腹之分，背部有少量細(xì)胞質(zhì)，其中可見電子密度較小、大小不一的囊泡；腹部幾乎全由細(xì)胞核占據(jù)，細(xì)胞核中染色質(zhì)的電子密度呈均勻、致密分布，沒有明顯的網(wǎng)絡(luò)狀間隙，細(xì)胞核前端無頂體，細(xì)胞核后端沒有植入窩。

注：A為完整精子，B為精子頸部,H示精子頭部，MP示精子中段，T示精子尾部。

Note:A is intact sperm，B is sperm neck，C is sperm head，D is sperm tail.

圖1 江鱈精子的外部形態(tài)

Fig.1 Morphology of the spermatozoon ofL.lota

2.2.2 頸部 江鱈精子頸部即中段較短，長(0.6±0.2)μm，主要結(jié)構(gòu)由中心粒復(fù)合體和袖套構(gòu)成。中心粒復(fù)合體位于精子細(xì)胞核之后，精子中段的中間分為近端中心粒和遠(yuǎn)端中心粒(基體)，近端中心粒由9組三聯(lián)微管組成，沒有中央微管，近端中心粒的長軸與細(xì)胞核的長軸呈垂直關(guān)系(圖2-A，B)。

袖套前端較發(fā)達(dá)，與細(xì)胞核后端相連，中央的空腔為袖套腔。袖套兩側(cè)不對稱，其中分布有豐富的電子密度較大的線粒體，排列無規(guī)則，部分線粒體彼此融合，形成復(fù)合線粒體。袖套中有大量大小不一、電子密度較小的囊泡分布(圖2-A，B)。

2.2.3 尾部 江鱈精子尾部即精子的鞭毛細(xì)長，長(16.1±4.3)μm，其核心結(jié)構(gòu)是軸絲，由基體生長而來，貫穿于整個鞭毛。軸絲的起始端與遠(yuǎn)端中心粒相連，軸絲由9組外周二聯(lián)微管和1對中央微管組成，是典型的“9+2”微管結(jié)構(gòu)(圖2-C，D)。軸絲與鞭毛的質(zhì)膜間空隙狹窄，細(xì)胞質(zhì)較少。尾部外表面有由質(zhì)膜向兩側(cè)突出而成的側(cè)鰭，左右側(cè)鰭的大小存在差異(圖2-D，E)。

注：A為精子頭部縱切，B為頭部后端與頸部前端的橫切，C為尾部末端橫切，D為尾部中段橫切，E為尾部中段縱切,N示細(xì)胞核，V示囊泡，PC示近端中心粒，BB示遠(yuǎn)端中心粒，S示袖套腔，AF示軸絲，M示線粒體，CM示中央微管，D示軸絲的外周二聯(lián)微管，F(xiàn)示側(cè)鰭。

Note:A is Sperm head slitting，B is the transverse of back-end of head and front end of neck, C is the transverse of tail end,D is the middle of the tail cross ，E is the middle of the tail slitter，N is nucleus， V is vesicles， PC is proximal centriole， BB is distal centrioles， S is cuff chamber， AF is axoneme， M is mitochondria， CM is the central microtubules， D is s the outer wire Tuesday microtubules， F is side fins.

圖2 江鱈精子的超微結(jié)構(gòu)

Fig.2 Ultrastructure of the spermatozoon ofL.lota

3 結(jié)論與討論

3.1 江鱈精子的外部形態(tài)特點

經(jīng)掃描電鏡觀察，江鱈精子的形態(tài)結(jié)構(gòu)較為簡單，由頭部、頸部(中段)和尾部3部分組成。與斑點叉尾鮰、革胡子鯰、白斑紅點鮭等多數(shù)硬骨魚類精子的外部形態(tài)相似[6-8]，不同之處在于江鱈精子的外形非常小且沒有植入窩。有研究表明，白斑紅點鮭精子的頭部長24.5 μm，中段+尾部長245.0～367.5 μm，有植入窩[8]；虹鱒精子的頭部長21.7～34.6 μm，尾部長336.0～504.5 μm，有植入窩[9]。江鱈精子的頭部長1.6 μm，尾部長16.1 μm，沒有植入窩，江鱈精子的長度小于白斑紅點鮭和虹鱒。江鱈精子外形小的原因：一是與江鱈卵子的卵徑非常小有關(guān)，與受精的完成相適應(yīng)；二是與江鱈的低溫繁殖習(xí)性有關(guān)，較小的精子更能適應(yīng)低溫的水體環(huán)境。江鱈精子沒有植入窩，是否與形態(tài)屬性或繁殖特性有關(guān)，有待于進一步研究證實。

3.2 江鱈精子的超微結(jié)構(gòu)特點

經(jīng)透射電鏡觀察，江鱈精子的頭部無頂體，頭部有背腹之分，細(xì)胞核中染色質(zhì)的電子密度呈均勻、致密分布，沒有網(wǎng)絡(luò)狀間隙。從國內(nèi)外已有報道來看，有些魚類的精子有頂體，有些沒有頂體。如，盲鰻、鱘魚和肺魚的精子有頂體[10-12]，鯉魚、黃顙魚和哲羅鮭沒有頂體[13-15]。江鱈精子沒有頂體，與鯉魚、黃顙魚和哲羅鮭精子的超微結(jié)構(gòu)一致。目前，魚類精子頂體存在與否同魚類受精過程的關(guān)系，有觀點認(rèn)為，魚類的精子無頂體是為了適應(yīng)水體環(huán)境的體外受精，頂體是魚類進化上逐漸退化丟失的結(jié)構(gòu)[16]；有頂體的魚類精子在精卵結(jié)合時會發(fā)生頂體效應(yīng)、后通過受精孔入卵，而無頂體的魚類精子則直接通過魚卵上的卵膜孔進入卵。因此，有頂體的魚類屬于較為原始的類群[17]。

魚類精子頭部細(xì)胞核中出現(xiàn)電子密度較低的網(wǎng)絡(luò)間隙，其相關(guān)研究結(jié)果不盡相同。如，白斑紅點鮭、裸鯉、虹鱒精子細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)密集呈團狀，分布較均勻，其中有相對疏松的網(wǎng)絡(luò)狀間隙，未見顆粒電子致密物質(zhì)[8-9，17]，哲羅魚、細(xì)鱗魚精子頭部也有類似的網(wǎng)絡(luò)狀間隙[15，18]，黃顙魚、平鯛和索氏六須鯰魚類精子頭部細(xì)胞核中出現(xiàn)較大的電子密度較低區(qū)域“核泡”[14，19-20]。江鱈精子頭部細(xì)胞核中染色質(zhì)的電子密度呈均勻、致密分布，沒有網(wǎng)絡(luò)狀間隙。表明，江鱈精子頭部細(xì)胞核中沒有網(wǎng)絡(luò)間隙，是由于江鱈精子細(xì)胞核中染色質(zhì)螺旋程度較低導(dǎo)致。與張永泉等[8]對白斑紅點鮭精子頭部細(xì)胞核中的網(wǎng)絡(luò)間隙是周圍染色質(zhì)濃縮密集而形成“空白區(qū)域”的研究結(jié)果一致。

[1] 張俊麗.江鱈群體的形態(tài)學(xué)和遺傳學(xué)研究[D].青島：中國海洋大學(xué)，2007：1-2.

[2] 楊雨壯，殷麗潔，秦大公，等.鏡泊湖江鱈的性狀變異和分類地位[J].北京大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2002，38(6):850-854.

[3] 錢 龍，范鎮(zhèn)明，胡伯林，等.江鱈孵化條件的研究[J].淡水漁業(yè)，2006，36(5):57-58.

[4] 高曉田，肖國華，陳 力，等.江鱈胚胎發(fā)育的研究[J].淡水漁業(yè)，2011，41(6):85-90.

[5] 田永勝，姜 靜，馬 允，等.額爾齊斯河江鱈精子冷凍保存研究[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2014，22(9):1149-1156.

[6] Poirier G R，Nicholson N.Fine structure of the testicular spermatozoa from the channel catfish，Ietalurul punctatus[J].Journal of Ultrastructure Research，1980，80(1):104-110.

[7] Mansou N，Lahnsteiner F，Patzner r A.The spermatozoon of the African catfish:fine structure，modity，viability and its behaviour in seminal vesicle secretion[J].Journal of Fish Biology，2002，60(3):545-560.

[8] 張永泉，尹家勝，劉 奕，等.白斑紅點鮭精子形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的研究[J].上海海洋大學(xué)學(xué)報，2011，20(6):820-825.

[9] 谷 偉，張永泉，戶 國，等.虹鱒精子的掃描和透射電鏡觀察[J].水產(chǎn)學(xué)雜志，2014，27(5):24-27.

[10] Sachiko M.Fine Structure of Spermatozoa of the Hagfish Eptatretus burger Agnatha)[J].The Biological Bulletin，1995，189:6-12.

[11] Martin N D，Wayne S K，Rosemary A W.Sperm-cell ultrastructure of North American sturgeons.Ⅲ.The lake sturgeon(AcipenserfulvescensRafinesque，1817)[J].Canadian Journal of Zoology，2000，78:438-447.

[12] 劉雪珠，楊萬喜.硬骨魚類精子超微結(jié)構(gòu)及其研究前景[J].東海海洋，2002，20(3):32-37.

[13] 尤永隆，林丹軍.鯉魚精子超微結(jié)構(gòu)的研究[J].動物學(xué)研究，1996，17(4):377-383.

[14] 尤永隆，林丹軍.黃顙魚精子的超微結(jié)構(gòu)[J].實驗生物學(xué)報，1996，29(3):235-239.

[15] 尹洪濱，尹家勝，孫中武，等.哲羅魚精子的超微結(jié)構(gòu)[J].水產(chǎn)學(xué)報，2008，32(1):27-31.

[16] 胡家會，張永忠，付崇羅，等.玫瑰無須鲃精子的超微結(jié)構(gòu)[J].動物學(xué)報，2005，51(5):892-897.

[17] 梁 健，李長忠，史建全，等.青海湖裸鯉精子形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的研究[J].上海海洋大學(xué)學(xué)報，2013，22(1):42-46.

[18] 張旭晨，王所安.細(xì)鱗魚精巢超微結(jié)構(gòu)和精子發(fā)生[J].動物學(xué)報，1992，38(4):355-358.

[19] 劉雪珠，楊萬喜.平鯛精子的超顯微結(jié)構(gòu)[J].東海海洋，2004，22(4):43-48.

[20] 尹洪濱，孫中武，劉玉堂，等.索氏六須鯰精子的超微結(jié)構(gòu)[J].水產(chǎn)學(xué)報，2000，24(4):302-305.

(責(zé)任編輯： 馮 衛(wèi))

Observation of Morphous and Ultrastructure of the spermatozoon ofLotalota

LI Shengzhong1， CHENG Xianyou2， DONG Yafei1， ZHOU Guizhen1， ZHANG Juanli1， ZHANG Yujiao1

(1.CollegeofAnimalScience，XinjiangAgricultureUniversity，Urumqi,Xinjiang830052； 2.XinjiangFisheriesResearchInstitute，Urumqi,Xinjiang830000,China)

The morphous and ultrastructural organization ofL.lotaspermatozoon was observed by scanning and transmission electron microscopes to provide the reference for enhancing the sperm motility and fertilizing rate of artificial breeding aboutL.lota. Results: The spermatozoon with no acrosome consists of the head，the neck and the tail. The head of the spermatozoon is oval shape and 1.6±0.3 μm long，the front of the sperm neck is wide，the rear of the sperm neck is narrow，the length of the sperm neck is (0.6±0.2)μm，the sperm tail is thin，long and (16.1±4.3) μm long，there is no implantation fossa in the spermatozoon. The sperm head can be divided into the back and the abdomen，the back has little cytoplasm，the abdomen consists of the nucleus mainly，the nucleus without netlike gaps and acrosome consists of electron dense chromatin materials. The sperm neck consists of centriolar complex and sleeve，the proximal centriole，which is made up of nine triplets of peripheral microtubules without central microtubules，is perpendicular to the distal centriole. The core structure of the sperm tail is axoneme, which is made up of nine peripheral duplex microtubules and a pair of central microtubules，whose structure is the typical model of“9 + 2”. The plasma membrane of the sperm tail is prominent symmetrically up and down to form two lateral fins with different sizes.

Lotalota; spermatozoon; morphous; ultrastructure

2015-11-20； 2016-02-19修回

科技部國家科技支撐計劃項目“淡水養(yǎng)殖品種選育及規(guī)模化繁育技術(shù)研究與示范”(2012BAD26B00); 新疆大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目“江鱈精子顯微及超微結(jié)構(gòu)研究”(201510758069)

李勝忠(1964-)，男，副教授，碩士，從事水產(chǎn)動物增養(yǎng)殖與繁殖生理學(xué)研究。E-mail：xndlishengzhong@sina.cn

1001-3601(2016)05-0211-0093-04

S965.199

A