張 超， 朱三榮， 田 峰， 戴林建， 陳 武2,*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院， 湖南 長沙 410128； 2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物與微生物分子互作實(shí)驗(yàn)室， 湖南 長沙 410128； 3.湖南省煙草公司 湘西自治州公司， 湖南 湘西 416000； 4.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院， 湖南 長沙 410128)

不同綠肥對湘西煙田土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性的影響

張 超1,2， 朱三榮3， 田 峰3， 戴林建4， 陳 武2,4*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院， 湖南 長沙 410128； 2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物與微生物分子互作實(shí)驗(yàn)室， 湖南 長沙 410128； 3.湖南省煙草公司 湘西自治州公司， 湖南 湘西 416000； 4.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院， 湖南 長沙 410128)

為了解施用不同綠肥煙田土壤細(xì)菌群落的物種多樣性，從湖南省湘西州煙區(qū)采集4塊煙田(不施綠肥，單施黑麥草綠肥，豌豆綠肥，油菜綠肥)的土壤樣本，提取土壤總DNA，PCR擴(kuò)增其16S rRNA的V4高變區(qū)，陽性樣品測序，序列比對鑒定，并利用生物信息學(xué)軟件分析測序數(shù)據(jù)。結(jié)果表明：1) 施用綠肥對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和組成具有顯著影響。在細(xì)菌域有4個(gè)主要的細(xì)菌種群，占所有有效序列的55.79%～65.39%，分別為變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)，4個(gè)細(xì)菌種群相對豐度在各組均具有顯著差異。2) 經(jīng)綠肥處理后的煙田土壤細(xì)菌群落多樣性高于未施用綠肥的對照組。香農(nóng)多樣性指數(shù)和群落均一度指數(shù)對照組(6.637, 0.833)和油菜組(6.658, 0.833)均低于黑麥草組(6.923, 0.854)和豌豆組(6.992, 0.861)，且差異均達(dá)顯著水平。3) 施用綠肥尤其是黑麥草綠肥的煙田中，煙草青枯病的發(fā)病率下降與土壤細(xì)菌群落多樣性增加有關(guān)。

綠肥； 細(xì)菌群落； 結(jié)構(gòu)與組成； 微生物多樣性

煙草是我國主要的經(jīng)濟(jì)作物之一，長期以來煙草產(chǎn)業(yè)對國家財(cái)政收入貢獻(xiàn)巨大。湘西自治州是湖南省主要的煙草產(chǎn)區(qū)，目前湘西州煙區(qū)煙田連作障礙發(fā)生頻繁，土傳病害較為嚴(yán)重，急需建立綜合防治技術(shù)體系。連作障礙是在同一地塊連續(xù)兩茬以上種植同一種作物導(dǎo)致的作物長勢變?nèi)?，品質(zhì)劣化，作物病蟲害頻發(fā)最終導(dǎo)致產(chǎn)量下降的現(xiàn)象[1]。作為連作障礙現(xiàn)象的一種，煙草作物土傳病害(包括煙草青枯病)在我國發(fā)生普遍。煙草青枯病由茄科雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起，是一種典型的土傳性病害[2]。研究表明，作物土傳病害的發(fā)生與根際土壤微生物的數(shù)量、組成和群落結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[3-5]。很多學(xué)者認(rèn)為[6-8]，土壤微生物群體可一定程度上抑制作物的土傳病害，微生物群落結(jié)構(gòu)越豐富，多樣性越高，對抗病原菌的綜合能力越強(qiáng)。

綠肥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中扮演著土壤改良劑的角色，在抑制作物病蟲害和提高作物產(chǎn)量等方面具有極其重要的意義。有研究指出[9]，施用綠肥對于作物土傳病原菌可起到抑制作用。但不同綠肥對于不同土壤中微生物的影響不盡相同。

16S rRNA是原核生物核糖體RNA，其高度的保守性使之成為分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[10]。16S rRNA高通量測序技術(shù)能同時(shí)對樣品中的優(yōu)勢物種、稀有物種和一些未知的物種進(jìn)行檢測，獲得樣品中微生物群落組成及其相對豐度。研究表明[11-13]，相較于一些傳統(tǒng)微生物研究方法，高通量測序技術(shù)具有通量高、成本低、流程自動(dòng)化且能獲取更豐富微生物信息的優(yōu)勢，Illumina MiSeq是高通量測序技術(shù)的一種。故筆者采用Illumina MiSeq測序平臺進(jìn)行樣品的測序，通過生物信息學(xué)統(tǒng)計(jì)分析測序結(jié)果，研究4塊煙田土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成的差異，并試圖從土壤微生物的生態(tài)角度解釋不同綠肥處理后土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化與煙草青枯病發(fā)病率之間的聯(lián)系，以期為湖南省湘西州煙草產(chǎn)區(qū)土傳病害的綜合防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

供試土壤取于湖南省湘西州花垣縣煙田。采樣農(nóng)田分為4個(gè)處理組：對照組(Control)、黑麥草組(Ryegrass)、豌豆組(Pea)和油菜組(Rape)，對照組不施綠肥。采樣方法：土鉆垂直打下20 cm深度取土，每塊煙田按照棋盤式采樣法選擇10個(gè)點(diǎn)進(jìn)行采集。采樣范圍為E 109°34′13″～34′41″，N 28°22′8″～22′12″。采樣時(shí)間為2014年7月28日(煙草成熟期或發(fā)病盛期)。土壤樣品采集后低溫保存帶回并置于-80℃冰箱備用。

1.2 樣品總 DNA提取和16S r RNA 片段的 PCR擴(kuò)增

1.2.1 樣品總DNA提取 樣品總DNA采用MOBIO PowerSoil DNA Isolation Kit試劑盒提取，提取步驟依照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.2 16S rRNA片段的PCR擴(kuò)增 根據(jù)Miseq測序平臺的要求設(shè)計(jì)引物，序列為515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R (5′- GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。PCR反應(yīng)體系：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min，4℃保存。

1.3 PCR產(chǎn)物的Miseq 高通量測序

測序由中南大學(xué)資源生物與生物工程學(xué)院生物冶金重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.4 數(shù)據(jù)處理

通過UCULT軟件對每個(gè)樣品的16S rRNA有效序列比對結(jié)果進(jìn)行聚類，相似度>97%的歸為同一個(gè)OTU(operational taxonomic units，操作分類單位)。后續(xù)分析基于軟件R語言、SPSS和在線分析網(wǎng)站(http://ieg.ou.edu/)完成。各組指標(biāo)數(shù)據(jù)差異的顯著性水平通過基于最小顯著性差異法(Least Significant Difference test，LSD)的單因素方差分析(one-way analysis of variance，ANOVA)進(jìn)行判斷。采用除趨勢對應(yīng)分析法研究研究土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異，采用香農(nóng)多樣性指數(shù)(Shannon diversity)和群落物種均一度指數(shù)(Pielou evenness)評價(jià)煙田細(xì)菌的群落多樣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S rRNA序列 PCR擴(kuò)增

由圖1可見，通過515F/806R引物PCR擴(kuò)增40個(gè)土壤樣品的總DNA，目的片段約為500 bp。

2.2 不同綠肥處理煙田土壤細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)與組成

每個(gè)樣品中均得到約18 000條高質(zhì)量的16S rRNA有效序列，在OTU聚類完成后鑒定得到14 629個(gè)OTUs。其中，有127個(gè)OTUs被分類為古菌，其余為細(xì)菌。根據(jù)對OTUs統(tǒng)計(jì)得出，在古菌域中，62.28%的序列被鑒定為嗜熱的厭氧有機(jī)營養(yǎng)古菌(Fervidicoccus)[14]，還有26.21%的序列為廣古菌門(Euryarchaeota)中未被鑒定的屬。由圖2可見，細(xì)菌域中，在門的水平上有4個(gè)主要的細(xì)菌種群占所有序列的多數(shù)(55.79%～65.39%)，其中，變形菌門(Proteobacteria)占21.69%～41.44%，酸桿菌門(Acidobacteria)占13.05%～23.62%，放線菌門(Actinobacteria)占4.13%～8.13%，綠彎菌門(Chloroflexi)占2.78% ～ 16.24%，這與前人的研究相印證[15-17]。同時(shí)，還有11.78%～22.65%的序列鑒定結(jié)果與已知菌門不相匹配。

注：1～10代表對照組樣品，11～20號代表黑麥草組樣品，21～30號代表豌豆組樣品，31～40號代表油菜組樣品。

Note: 1～10, control ;11～20, ryegrass; 21～30, pea; 31～40, rape.

圖1 40個(gè)樣品 515F/806R引物的擴(kuò)增圖譜

Fig.1 PCR results of 40 strains with primer 515F/806R

圖2 4個(gè)處理組中土壤細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)與組成

Fig.2 Composition and structure of soil bacteria communities in four group

注：A，門水平；B，屬水平；同一組別不同小寫字母表示差異達(dá)顯著性水平(P< 0.05) 。

Note: a， phylum level, b, genus level; Significant differences (P< 0.05) among four groups are labeled with alphabet.

圖3 供試煙田中主要細(xì)菌種群在門和屬水平上的相對豐度

Fig.3 Relative abundances of major bacterial populations in four groups

2.3 不同綠肥處理下煙田優(yōu)勢細(xì)菌群落的相對豐度

從圖3A可見，在門的水平上，對照組中變形菌和放線菌(Proteobacteria,Actinobacteria)的相對豐度更高，而泉古菌(Crenarchaeota)的豐度在油菜組中更高；酸桿菌(Acidobacteria)的豐度在豌豆組中最高，在對照組中最低；浮霉菌(Planctomycetes)和綠彎菌(Chloroflexi)在黑麥草組中的豐度更高。綠肥的施用對土壤細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)和組成有顯著影響。由圖3B可見，在屬的水平上，酸桿菌門的3個(gè)分屬Acidobacteria_Gp6，Acidobacteria_Gp4和Gp16在豌豆組中豐度更高。疣微菌門的分屬Spartobacteria_genera_incertae_sedis，芽單孢菌屬Gemmatimonas，黃色單胞菌科的分屬Dokdonella和Rhodanobacter4個(gè)屬在對照組豐度更高。

如圖4可見，除對照組和油菜組中有部分點(diǎn)距離很近外，4個(gè)組的細(xì)菌群落能明顯區(qū)分開。表明，除油菜組和對照組部分樣品中群落結(jié)構(gòu)相似之外，各組土壤之間細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)均具有顯著差異。

圖4 各組樣品中16 S rRNA序列的除趨勢

Fig.4 Detrended correspondence analysis (DCA) of 16r RNA gene sequencing data

2.4 不同綠肥處理下煙田土壤細(xì)菌的多樣性

由表可知：香農(nóng)多樣性指數(shù)和群落均一度指數(shù)對照組(6.637, 0.833)和油菜組(6.658, 0.833)均低于黑麥草組(6.923, 0.854)和豌豆組(6.992, 0.861)，且差異均達(dá)顯著水平。說明，施用不同綠肥的煙田土壤細(xì)菌群落的物種豐富度和多樣性都高于對照組；而另一個(gè)用于評價(jià)多樣性的指數(shù)chao值也呈現(xiàn)此規(guī)律。

表 不同綠肥處理對煙田土壤細(xì)菌的多樣性

注：同行不同小寫字母表示差異達(dá)顯著性水平。

Note: Different lowercase letters in the same column indicated 5% significant level.

3 結(jié)論與討論

通過煙田調(diào)查統(tǒng)計(jì)得出4塊煙田的煙草青枯病發(fā)病率，分別為對照組80.45%，黑麥草組3.38%，豌豆組8.78%，油菜組22.97%。綜合對4塊煙田細(xì)菌群落組成和結(jié)構(gòu)及其多樣性變化：相比對照組，3種綠肥處理后能提高煙田土壤細(xì)菌群落的多樣性并降低煙草青枯病的發(fā)病率，黑麥草組尤為明顯。這可能是由于不同綠肥的成分不同，在土壤中對于細(xì)菌群落的影響也不相同。

由于土壤微生物和植物之間的聯(lián)系十分復(fù)雜，僅僅測定微生物群落結(jié)構(gòu)并不能完全說明施用綠肥對土壤質(zhì)量的提高[18]。土壤微生物同時(shí)還受到土壤性質(zhì)和綠肥中功能成分的影響，因此，還需要將土壤性質(zhì)、細(xì)菌群落和綠肥三者綜合并對煙田土壤細(xì)菌群落的功能多樣性和有益菌、有害菌與病原菌之間的相互作用進(jìn)行深入的研究，為煙田綠肥的合理選擇和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)系統(tǒng)的優(yōu)化提供科學(xué)依據(jù)。

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(責(zé)任編輯： 劉忠麗)

Effects of Different Green Manure on Bacterial Community Structure and Diversity in Tobacco-planting Field in Xiangxi

ZHANG Chao1,2, ZHU Sanrong3, TIAN Feng3, DAI Linjian4, CHEN Wu2,4*

(1.CollegeofPlantProtection,HunanAgriculturalUniversity,Changsha,Hunan410128; 2.MolecularInteractionLaboratoryofPlantandMicroorganism,Changsha,Hunan410128; 3.XiangxiBranchCompany,HunanTobaccoCompany,Xiangxi,Hunan416000; 4.AgriculturalCollege,HunanAgriculturalUniversity,Changsha,Hunan410128,China)

In order to explore the species diversity of bacterial community in tobacco-planting field applied with different green manure, soil samples were collected in four tobacco-planting fields in Xiangxi, Hunan Province, which were treated with different green manure(control, ryegrass, pea and rape), after extracting total DNA from soil, PCR amplification of V4 hypervariable region of 16S rRNA, positive sample sequencing and alignment, and then sequence data were analyzed by using bioinformatics software. Results: Applying green manure had positive influence on soil bacteria community structure and composition. Within the bacterial domain, four major bacterial phyla accounted for 55.79% to 65.39% of all reads, and they were Proteobacteria, Acidobacteria, Actinobacteria and Chloroflexi. Soil community diversity was significantly higher in groups treated with green manure.Shannon diversity index and Pielou evenness index were significantly (P<0.05) lower in Control (6.637, 0.833) and Rape (6.658, 0.833), but higher in Ryegrass (6.923, 0.854) and Pea (6.992, 0.861) . Green manure especially ryegrass, decreased tobacco disease (bacterial wilt) rate dramatically, which correlated with the increasing of soil bacteria community diversity.

green manure; bacterial communities; structure and composition; microbial diversity

2016-03-31； 2016-05-04修回

國家煙草專賣局重點(diǎn)項(xiàng)目(110201302014)；湖南省煙草公司湘西自治州分公司科技項(xiàng)目(XX14-16Aa05)

張 超(1991-)，男，在讀碩士，研究方向：植物病理學(xué)。E-mail:zhangchaom200@163.com

*通訊作者：陳 武(1977-)，男，副教授，從事植物病理學(xué)研究。E-mail: chenwuwarrior@163.com

1001-3601(2016)05-0198-0043-04

S435.5

A