張阿娜

作者單位:117000 遼寧省本溪市中心醫(yī)院

?

乳腺癌組織中VEGF-D、MMP-2及MMP-9的表達及其臨床意義

張阿娜

作者單位:117000 遼寧省本溪市中心醫(yī)院

【摘要】目的探討乳腺癌組織中基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)和血管內皮生長因子D(VEGF-D)表達的臨床意義。方法采用免疫組化法，對60例乳腺癌組織及60例正常組織中MMP-2、MMP-9及VEGF-D表達情況進行檢測。結果60例乳腺癌組織中，MMP-2、MMP-9陽性表達率分別為61.67%、56.67%，VEGF-D陽性表達率為61.67%。MMP-2、MMP-9及VEGF-D陽性表達率Ⅲ~Ⅳ期者顯著高于Ⅰ~Ⅱ期者；低分化者顯著高于高、中分化者；有淋巴結轉移者顯著高于無淋巴結轉移者；且MMP-2與VEGF-D表達，MMP-9與VEGF-D表達均呈正相關性。結論低分化、Ⅲ~Ⅳ期乳腺癌患者高表達MMP-2、MMP-9與VEGF-D，MMPs與VEGF-D表達呈正相關性，可通過阻斷VEGF-D及MMPs活性控制、治療乳腺癌。

【關鍵詞】乳腺癌；基質金屬蛋白酶-2；基質金屬蛋白酶-9；血管內皮生長因子D

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:198～201)

乳腺癌是嚴重威脅女性生命健康的惡性腫瘤，發(fā)病率約為每年46/10萬~52/10萬，近年來其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢，有效控制乳腺癌腫瘤的侵襲和轉移，可以改善乳腺癌患者的預后[1]。血管內皮生長因子(VEGF)可以促進血管內皮細胞的分裂及增生能力，增加血管的通透性，促進子宮內膜細胞外的信息分子雌激素，并激活激素受體，調控基因表達[2-3]。基質金屬蛋白酶(MMPs)家族是一類結構相似的蛋白酶，能降解細胞外基質，此降解其增強腫瘤細胞浸潤中突破屏障的能力有關[4-5]。本研究通過對乳腺癌患者組織中VEGF-D、MMP-2、MMP-9 的表達檢測，及三者與乳腺癌侵襲、轉移相關性的分析，探討 VEGF-D、MMP-2、MMP-9 在腫瘤發(fā)展中的關系，其對于指導乳腺癌臨床治療及預后評估有重要意義。

1材料與方法

1.1　研究對象

乳腺癌組為2013年10月-2014年10月我院收治的60例乳腺癌患者外科手術切除標本，所有患者均經(jīng)病理學檢查確診，納入標準：所有患者均未進行手術、化療、放療治療。對照組取自我院乳腺手術正常組織標本。所有標本均經(jīng)常規(guī)石蠟包埋，5 μm厚連續(xù)切片。

1.2　試劑及儀器

羊抗人MMP-2一抗，兔抗羊MMP-2二抗；羊抗人MMP-9一抗，羊抗人VEGF-D一抗，兔抗羊VEGF-D二抗及兔抗羊 MMP-9二抗；DAB顯色試劑盒與HIGH-SABC免疫組化試劑盒購自北京中杉生物技術有限公司。其他相關試劑包括無水乙醇、二甲苯及3%H2O2等。文中主要涉及的儀器為倒置顯微鏡及顯微鏡照相系統(tǒng)，病理組織包埋機，免疫組化專用濕盒，免疫組化專用抗原修復架及修復盒。

1.3　方法

1.3.1免疫組化方法MMP-2和MMP-9采用HIGH-SABC免疫組化法染色，使用DAB顯色及蘇木精進行復染細胞核。采用石蠟切片常規(guī)脫蠟至水后，室溫下浸于含3%H2O2的甲醇溶液中30 min，以滅活內源性H2O2酶活性，滅活后使用蒸餾水及PBS沖洗。將切片放入PH為8.00的0.5 mol/L EDAT緩沖液中，保持溫度在95 ℃維持10 min。之后取出容器，室溫下自然冷卻至少15～20 min。正常兔血清室溫封閉切片10～20 min，甩去多余液體，不進行沖洗。在切片中滴加羊抗人VEGF抗體，置于濕盒中，于4 ℃下孵育過夜，之后使用PBS緩沖液洗滌3次。滴加生物素化兔抗羊二抗，在37 ℃下孵育20 min，使用PBS緩沖液洗滌3次。滴加HIGH-SABC后于37 ℃下放置20 min，使用PBS緩沖液洗滌4次。使用顯微鏡控制顯色反應時間，時長大約為5 min，之后使用蒸餾水沖洗，來終止顯色。使用蘇木精進行細胞核復染，復染后用自來水沖洗。脫水、透明、中性樹膠封固。在顯微鏡下進行觀察、拍照。VEGF-D免疫組化染色同上。

1.3.2結果判定MMP-2、MMP-9、VEGF判定標準相同。采用半定量積分方法[6]，并根據(jù)腫瘤細胞染色強度及陽性細胞數(shù)進行判定。隨機選取×400的高倍鏡5個，對陽性細胞數(shù)及腫瘤細胞總數(shù)進行計數(shù)，計數(shù)后計算陽性細胞百分率，0分：陽性細胞百分率<5%，1分：5%～25%，2分：26%～50%，3分：51%～75%，4分：75%以上；再按多數(shù)陽性細胞呈現(xiàn)的染色強度進行記分：1分：淡棕黃色，2分：棕黃色，3分：棕褐色。總分為兩者相乘。陰性表達：積分不超過2分，陽性表達：積分>2分。由3名臨床病理醫(yī)師進行閱片，根據(jù)平均值判定結果。

1.4　統(tǒng)計分析

應用SPSS 19.0軟件對比分析本文數(shù)據(jù)，采用χ2檢驗進行組間比較，采用χ2檢驗相關性并計算列聯(lián)系數(shù)，P<0.05表明差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1　臨床特征

對照組共入組60例，年齡29～69歲，平均年齡(52.3±10.2)歲。乳腺癌組共入組60例，年齡28-65歲，平均(53.5±11.3)歲；其中13例為高分化型，32例為中分化型，15例為低分化型；按照2009年國際抗癌聯(lián)盟(UICC)TNM分期標準，Ⅰ～Ⅱ期33例，Ⅲ～Ⅳ期27例。對照組與乳腺癌組年齡方面無顯著性差異(P>0.05)，見表1。

表1　對照組與乳腺癌組臨床特征比較/例

2.2　乳腺癌組織中MMP-2、MMP-9的表達

60例正常乳腺組織中MMP-2、MMP-9陽性表達率分別為8.33%(5/60)、6.67%(4/60)，乳腺癌組織中MMP-2、MMP-9陽性表達率分別為61.67%(37/45)、56.67%(34/45)，乳腺癌組MMP-2、MMP-9陽性表達率均顯著高于正常對照組(P<0.01)；高中分化和低分化乳腺癌組織中MMP-2陽性表達率分別為53.33%(24/45)和86.67%(13/15)，MMP-9陽性表達率分別為46.67%(21/45)和86.67(13/15)，低分化患者MMP-2、MMP-9陽性表達率顯著高于高中分化患者(P<0.01)；Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期患者MMP-2陽性表達率分別為48.48%(16/33)和77.78%(21/27)，MMP-9陽性表達率分別為48.48%(14/33)和66.67%(20/27)，Ⅲ～Ⅳ期患者MMP-2、MMP-9陽性表達率顯著高于Ⅰ～Ⅱ期患者(P<0.05)；有淋巴結轉移患者和無淋巴結轉移患者MMP-2陽性表達率分別為75.00%(27/36)和41.67%(10/24)，MMP-9陽性表達率分別為72.22%(26/36)和33.33%(8/24)，有淋巴結轉移患者MMP-2、MMP-9陽性表達率顯著高于無淋巴結轉移患者(P<0.05)，見表2。

表2　MMP-2、MMP-9表達與乳腺癌其臨床病理特征的相關性(例，%)

2.3　乳腺癌組織中VEGF的表達

60例正常乳腺組織中無VEGF-D表達。乳腺癌組織中VEGF-D陽性表達率為61.67%(37/60)。在高中分化和低分化乳腺癌組織中VEGF-D陽性表達率分別為55.56%(25/45)和80.00%(12/15)，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期患者VEGF-D陽性表達率分別為42.42%(14/33)和85.19%(23/27)，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。有淋巴結轉移組和無淋巴結轉移組VEGF-D陽性表達率分別為77.78%(28/36)和37.50%(9/24)，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表3。

表3　乳腺癌組織VEGF表達與其臨床病理特征

2.4　乳腺癌組織中MMP-2、MMP-9與VEGF-D表達的關系

60例乳腺癌組織中30例MMP-2和VEGF同時表達，其余8例僅表達VEGF，7例僅表達MMP-2，其他15例癌組織中兩者均未表達。MMP-9、VEGF-D表達呈正相關(C=0.537，P=0.0014)。

在60例乳腺癌組織中，26例MMP-9和VEGF同時表達，其余12例僅表達VEGF-D，8例僅表達MMP-9，其他 14例癌組織中兩者均未表達。MMP-9和VEGF-D表達呈正相關(C=0.674，P=0.0029)。

3討論

MMP-2主要通過特異性降解基膜的主要成分Ⅳ、Ⅴ型膠原，對腫瘤的侵襲轉移有重要作用[7]。正常穩(wěn)態(tài)組織中MMPs表達極少，在激素、炎性細胞因子及生長因子刺激下，其表達量上升[8]。其中MMP-9可降解多種基質成分，破壞基膜，從而導致癌細胞向人體其他部位進行浸潤轉移[9-10]。本研究結果表明，乳腺癌組MMP-2、MMP-9的陽性表達率均顯著高于正常對照組；低分化患者MMP-2、MMP-9陽性表達率顯著高于高中分化患者；Ⅲ～Ⅳ期患者MMP-2、MMP-9陽性表達率顯著高于Ⅰ～Ⅱ期患者；有淋巴結轉移患者MMP-2、MMP-9陽性表達率顯著高于無淋巴結轉移患者患者(P<0.05)。提示MMP-2、MMP-9高表達者，乳腺癌細胞的浸潤性和轉移性均增高。

VEGF-D是VEGF家族中的新成員，大多數(shù)人類組織中可檢測到VEGF-D mRNA[11]。有研究表明，VEGF-D可結合并激活內皮細胞受體VEGFR-2，VEGFR-3的酪氨酸磷酸化[12]。體外實驗均表明，VEGF-D可促進血管內皮細胞分裂、增殖，具有較強的促血管生長的作用[13]。Scoditti等[14]以腺病毒為載體，發(fā)現(xiàn)VEGF-D對血管生成的刺激作用超過VEGF-A，血管增生更加彌散。本研究結果提示，在60例乳腺癌組織檢測中，VEGF-D陽性表達率為61.67%，而60例正常組織未見陽性表達。VEGF-D陽性表達率在Ⅲ～Ⅳ期顯著高于Ⅰ～Ⅱ期；低分化顯著高于高中分化者；有淋巴結轉移組顯著高于無淋巴結轉移組。提示VEGF-D高表達者，乳腺癌細胞的浸潤性和轉移性均增高。

目前認為，MMP-2、MMP-9具有調節(jié)血管生長及微環(huán)境的作用。其與VEGF-D在腫瘤的進展中可能發(fā)揮協(xié)調作用。VEGF-D的上調表達刺激MMP-2及MMP-9的過度分泌，同時促進其mRNA的轉錄。本研究結果顯示，高中分化、Ⅲ～Ⅳ期及淋巴結轉移乳腺癌患者高表達MMP-2、MMP-9與VEGF-D，且MMP-2與VEGF-D表達呈正相關性，MMP-9與VEGF-D的表達呈正相關性，提示MMPS與VEGF-D間可能存在協(xié)同作用，并可預示通過阻斷MMPS與VEGF-D的活性，可以抑制腫瘤新生血管的形成，從而達到控制、治療腫瘤。

參考文獻

[1]鄭瑩,吳春曉,張敏璐,等.乳腺癌在中國的流行狀況和疾病特征〔J〕.中國癌癥雜志,2013,23(8):561-569.

[2]李寶江,朱志華,王軍業(yè),等.Ki67、P53、VEGF和C-erbB-2在乳腺癌組織中表達的相關性研究及其臨床意義〔J〕.癌癥,2004,23(10):1176-1179.

[3]Jia H,Bagherzadeh A,Bicknell R,et al.Vascular endothelial growth factor(VEGF)-D and VEGF-A differentially regulate KDR-mediated signaling and biological function in vascular endothelial cells〔J〕.J Biol Chem,2004,279(34):36148-36157.

[4]Ukaszewicz-Zajac,Mroczko,Kornhuber,et al.Matrix metalloproteinases(MMPs) and their tissue inhibitors(TIMPs) in the tumors of central nervous system(CNS)〔J〕.J Neural Transm(Vienna),2014,121(5):469-477.

[5]De Jong PT,Tigchelaar W,Van Noorden CJ,et al.Polyethylene wear particles do not induce inflammation or gelatinase(MMP-2 and MMP-9) activity in fibrous tissue interfaces of loosening total hip arthroplasties〔J〕.Acta Histochem,2011,113(5):556-563.

[6]李丹.RECK、MMP-2、TIMP-2和P21ras在喉癌中的表達及其意義〔D〕.河北醫(yī)科大學,2010.

[7]Cao WH,Liu HM,Liu X,et al.Relaxin enhances in-vitro invasiveness of breast cancer cell lines by upregulation of S100A4/MMPs signaling〔J〕.Eur Rev Med Pharmacol Sci,2013,17(5):609-617.

[8]Roomi MW,Kalinovsky T,Rath M,et al.Modulation of u-PA,MMPs and their inhibitors by a novel nutrient mixture in human female cancer cell lines〔J〕.Oncol Rep,2012,28(3):768-776.

[9]Rolli M,Fransvea E,Pilch J,et al.Activated integrin alpha v beta 3 cooperates with metalloproteinase MMP-9 in regulating migration of metastatic breast cancer cells〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,2003,100(16):9482-9487.

[10]Farina AR,Cappabianca L,DeSantis G,et al.Thioredoxin stimulates MMP-9 expression,de-regulates the MMP-9/TIMP-1 equilibrium and promotes MMP-9 dependent invasion in human MDA-MB-231 breast cancer cells〔J〕.FEBS Lett,2011,585(20):3328-3336.

[11]常超,王平,張利斌,等.PC5、PC7、VEGF-C、D及其受體VEGFR-3 mRNA在非小細胞肺癌淋巴轉移中的表達及意義〔J〕.中國癌癥雜志,2009,19(10):742-748.

[12]Jauhiainen S,Hakkinen SK,Toivanen PI,et al.Vascular endothelial growth factor(VEGF)-D stimulates VEGF-A,stanniocalcin-1,and neuropilin-2 and has potent angiogenic effects〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol,2011,31(7):1617-1624.

[13]Liu ZY,Qiu HO,Yuan XJ,et al.Suppression of lymphangiogenesis in human lymphatic endothelial cells by simultaneously blocking VEGF-C and VEGF-D/VEGFR-3 with norcantharidin〔J〕.Int J Oncol,2012,41(5):1762-1772.

[14]Scoditti E,Calabriso N,Massaro M,et al.Mediterranean diet polyphenols reduce inflammatory angiogenesis through MMP-9 and COX-2 inhibition in human vascular endothelial cells:A potentially protective mechanism in atherosclerotic vascular disease and cancer〔J〕.Arch Biochem Biophys,2012,527(2):81-89.

(編輯：吳小紅)

The Expressions and Clinical Significance of Matrix Metalloproteinases 2(MMP-2),Matrix Metalloproteinases 9(MMP-9) and Vascular Endothelial Growth Factor-D(VEGF-D)in Breast Cancer

ZHANGA'na.TheCenterHospitalofBenxi,Benxi,117000

【Abstract】ObjectiveTo explore the expressions of matrix metalloproteinases 2(MMP-2),matrix metalloproteinases 9(MMP-9) and vascular endothelial growth factor-D(VEGF-D)and their significance in breast cancer tissues.MethodsThe expressions of MMP-2,MMP-9 and VEGF-D in 60 cases of breast cancer tissues and 60 cases of normal esophageal tissues were detected by immunohistochemistry.ResultsThe expression rates of MMP-2,MMP-9 and VEGF-D in breast cancer tissues were 61.67%,56.67% and 61.67%.The expression rates of MMP-2,MMP-9 and VEGF-D in grade Ⅲ-Ⅳ were significantly higher than that of grade Ⅰ-Ⅱ.The expression rates of MMP-2,MMP-9 and VEGF-D in patients with poor differentiation were significantly higher than that with well-mediate differentiation.The expression rates of MMP-2,MMP-9 and VEGF-D in patients with lymph node metastasis were significantly higher than that without lymph node metastasis.MMP-2 and VEGF-D expression were positively correlated.MMP-9 and VEGF-D expression were also positively correlated.ConclusionThe expression rates of MMP-2,MMP-9 and VEGF-D are closely related to poor differentiation,grade Ⅲ-Ⅳ in the breast cancer.Their expressions appear to be well-characterized indicators of tumor prognosis and metastasis.

【Key words】Breast cancer;Matrix metalloproteinases 2(MMP-2);Matrix metalloproteinases 9(MMP-9);Vascular endothelial growth factor-D(VEGF-D)

(收稿日期2015-07-31修回日期 2015-12-21)

中圖分類號：R737.9

文獻標識碼：A

文章編號：1001-5930(2016)02-0198-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.02.007