史海躍+鄭娟+周黎明+等

[摘要] 目的 探討精子DNA 碎片率對男性不育及早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的影響。 方法 應(yīng)用病例對照研究方法，分別比較研究組A（原因不明的原發(fā)性不育癥男性）與對照組（近3個月內(nèi)配偶正常分娩的男性）間、研究組B（配偶有早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)史的男性）與對照組（近3個月內(nèi)配偶正常分娩的男性）間精子DNA 碎片率的差異。 結(jié)果 研究組A 126例，精子DNA碎片率為（11.95±4.89）%，研究組B 133 例，精子DNA碎片率為（13.93±4.60）%，對照組100 例，精子DNA碎片率為（10.07±3.56）%，研究組A、B與對照組間精子DNA 碎片率均存在顯著性差異。 結(jié)論 精子DNA碎片率與男性不育及早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)間存在相關(guān)性。

[關(guān)鍵詞] 精子DNA 碎片率；男性不育；早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)

[中圖分類號] R714.8 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2015）26-0072-04

Effect of Sperm DNA fragmentation on male infertility and early recurrent miscarriage

SHI Haiyue ZHENG Juan ZHOU Liming CAI Jie RONG Chunhao

Reproductive Medical Center，Ningbo Women and Children Hospital，Ningbo 315012，China

[Abstract] Objective To explore the effect of sperm DNA fragmentation on male infertility and early recurrent miscarriage. Methods Case-control study method was used. Sperm DNA fragmentation rates were compared between the study group A（the primary infertile males for unknown reasons），as well as the study group B（the males whose spouses undergoing early recurrent miscarriage）and the cross reference group（the males whose spouses undergoing delivery in three months），respectively. Results The sperm DNA fragmentation rate of the study group A（n=126） was（11.95±4.89）%，whereas that of the study group B（n=133） was （13.93±4.60）%. The sperm DNA fragmentation rate of the cross reference group（n=100） was （10.07±3.56）%. The sperm DNA fragmentation rates were significant different between the study groups A and B with the cross reference group. Conclusion Sperm DNA fragmentation rate has effect on male infertility and early recurrent miscarriage.

[Key words] Sperm DNA fragmentation rate； Male infertility； Early recurrent miscarriage

在生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，目前尚存在許多令醫(yī)務(wù)工作者困擾的難題，大部分都是因為缺乏有效的檢測手段而使人一籌莫展。其中，男性原因不明性不育及早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)就很典型。兩者目前的檢測手段均很有限且具有局限性，無法切實有效地指導(dǎo)臨床診治。近年來的研究顯示，精子染色體的完整性或許能為解決上述兩個難題打開突破口。精子染色體承載著將父輩的遺傳信息傳遞給后代的作用，通?？煞譃槿N結(jié)構(gòu)，分別是環(huán)狀結(jié)構(gòu)、螺線管結(jié)構(gòu)及核基質(zhì)結(jié)合域，各自具有不同的生理功能[1]。這些結(jié)構(gòu)的完整性影響生殖的多個方面，包括受精、卵裂、流產(chǎn)等。本文采用病例對照的方法，對原因不明的原發(fā)性不育癥男性、配偶有早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)史的男性以及近3個月內(nèi)配偶正常分娩的男性精子進行DNA碎片率檢測并分別進行比較，探討精子DNA碎片對男性不育及早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的影響，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2013年8月～2014年7月間在我院男科門診就診的原因不明的原發(fā)性不育男性作為研究組A，共126例。納入標準：婚后同居至少1年、性生活正常、未避孕未育的男性，排除引起不育的因素，如先天性異常、精索靜脈曲張、附屬性腺感染等，配偶檢查正常。收集2013年8月～2014年7月間在我院門診就診的配偶有早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)史的男性作為研究組B，共133 例。收集2013年8月～2014年7月間在我院產(chǎn)科成功分娩的男性配偶作為對照組，共100例。三組研究對象中夫婦任意一方存在解剖學(xué)異常、內(nèi)分泌異常、染色體異?；蛎庖咭蛩厮戮患{入研究范圍。三組男性精液常規(guī)及精子形態(tài)按照世界衛(wèi)生組織（WHO）《人類精液檢查與處理實驗室手冊》（2011年，第5版）[2]檢測均正常。

1.2 精子DNA碎片檢測

受試者禁欲3～5 d，手淫法收集精液，置于37℃培養(yǎng)箱中液化后進行檢測。DNA碎片檢測試劑為安徽安科生物工程公司生產(chǎn)的精子DNA碎片染色試劑盒，采用精子染色質(zhì)擴散試驗（SCD）檢測DNA碎片率，推薦的參考范圍為<10%。具體檢測步驟如下：①取精液待檢樣本用PBS調(diào)整濃度至（500～1 000）萬/mL；②取溶液A溶解（沸水90℃～100℃，5 min）后，37℃ 5 min，加入30 μL標本，混勻；③取預(yù)處理玻片一張（事先置于4℃冰箱），將瓊脂糖精液20 μL加到玻片上并標記位置，蓋上蓋玻片，加入4℃冰箱5 min；④將溶液B加入9 mL蒸餾水中，平皿中混勻；小心劃拉取開蓋玻片，水平置入溶液B中室溫7 min；⑤取出玻片，水平置入10 mL溶液C平皿中室溫25 min后，置入裝有蒸餾水平皿中5 min，然后分別置入70%、90%、100%乙醇中2 min，取出自然晾干；⑥染色：加溶液D，1 min；加溶液E用洗耳球吹勻，染色10～15 min；⑦應(yīng)用純凈水洗滌玻片，封片劑封片；⑧應(yīng)用光學(xué)顯微鏡，于400倍鏡下計數(shù)500個精子，觀察精子光暈大小[3]。根據(jù)光暈與精子頭部直徑的比例，分為大、中、小和無光暈4個等級，大和中光暈表示精子DNA完整無碎片，小和無光暈表示精子DNA斷裂為碎片。小光暈以精子頭直徑≤1/4為判斷標準；中光暈精子頭直徑>1/4，而精子頭直徑≤2/3；大光暈精子頭直徑>2/3。精子DNA碎片率（%）=存在DNA碎片精子數(shù)/計數(shù)精子總數(shù)×100%。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 精子DNA碎片率比較

研究組A共126例，精子DNA碎片率為5%～25.5%。研究組B共133 例，精子DNA碎片率為7%～28%。對照組共100例，精子DNA碎片率為4.5%～18.5%。見表1。

2.2 男性不育率比較

按照試劑盒推薦的參考范圍10%將研究組A 126例、對照組100 例共226例男性分組，比較DNA碎片率<10%組（C組）與DNA碎片率≥10%組（D組）男性不育率。其中C組130例，平均年齡（32.39±5.41）歲，不育癥發(fā)生率50.0%（65例），D組96例，平均年齡（32.82±5.43）歲，不育癥發(fā)生率61.62%（61例）。兩組間不育癥發(fā)生率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

表2 男性不育率比較

2.3 早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)率比較

按照試劑盒推薦的參考范圍10%，將研究組B 133 例、對照組100 例共233例男性分組，比較DNA碎片率<10%組（E組）與DNA碎片率≥10%組（F組）早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生率。其中E組98例，平均年齡（32.73±5.55）歲，流產(chǎn)率36.73%（36例），F(xiàn)組135例，平均年齡（33.19±5.63）歲，流產(chǎn)率71.85%（97例）。兩組間早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)率差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。

表3 早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)率比較

3 討論

在生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，男性原因不明性不育及早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)一直困擾著廣大醫(yī)務(wù)工作者。不育癥是指已婚夫婦有規(guī)律的性生活超過1年，雙方?jīng)]有采取避孕措施未能獲得自然受孕。發(fā)病率大約占生育年齡婦女的8%～17%，平均為10%，其中男性因素約占50%。但是男性生育能力的檢測手段相對缺乏，目前通常通過檢測精液常規(guī)參數(shù)，如精子濃度、活力、形態(tài)等來評估男性生育能力。但研究表明，上述常規(guī)參數(shù)對男性不育的診斷存在一定的局限性，無法做出準確評估[4]。同時約有15%的男性不育患者因精液常規(guī)檢查結(jié)果分析正常[5]而被診斷為不明原因性不育。

早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)是指連續(xù)遭受2次或2次以上發(fā)生于妊娠12周之前的胎兒丟失者，發(fā)生率約為0.4%～0.8%[6]，且有逐年增加的趨勢。治療手段主要是根據(jù)病因采取針對性治療，但目前病因篩查主要針對女性，男性因素主要針對遺傳學(xué)異常，相關(guān)檢測手段卻極其有限，這一現(xiàn)狀導(dǎo)致原因不明者占比近50%。這些患者缺乏有效的治療手段，已經(jīng)成為生殖醫(yī)學(xué)急需解決的難題。

近期研究表明，以精子DNA損傷作為特征的精子染色體結(jié)構(gòu)異?？赡軐δ行陨芰霸缙趶?fù)發(fā)性流產(chǎn)存在一定的預(yù)測價值[7-10]。本實驗采用精子染色質(zhì)擴散法（SCD）對原因不明的原發(fā)性不育癥男性、配偶有早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)史的男性及近3個月內(nèi)配偶正常分娩的男性的精子DNA 碎片率進行檢測，發(fā)現(xiàn)前兩組的DNA碎片率均顯著高于配偶正常分娩的男性。

同時，按照試劑盒推薦的參考范圍10%將原發(fā)性不育癥男性 126例、配偶正常分娩男性100 例共226例男性分組，比較DNA碎片率<10%組與DNA碎片率≥10%組男性不育率，發(fā)現(xiàn)DNA碎片率≥10%組男性不育率明顯高于DNA碎片率<10%組。

按照試劑盒推薦的參考范圍10%將配偶有早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)史的男性133例、配偶正常分娩男性100 例共233例男性分組，比較DNA碎片率<10%組與DNA碎片率≥10%組早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生率。發(fā)現(xiàn)DNA碎片率≥10%組男性早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)率明顯高于DNA碎片率<10%組。

研究結(jié)果提示：男性精子DNA碎片率對于男性生育能力及早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)具有一定的評估及預(yù)測價值。人精子染色體具備特殊的結(jié)構(gòu)，不同的結(jié)構(gòu)各自具有不同的生理功能，這些結(jié)構(gòu)的完整性在受精與胚胎發(fā)育過程中占據(jù)了非常重要的地位[1，11-13]。精子DNA碎片化的發(fā)生機制尚不清楚。一般認為可能與精子發(fā)生過程中出現(xiàn)的凋亡異常、氧壓脅迫、異常染色質(zhì)包裝有關(guān)[14-16]。

精子DNA碎片率的檢測手段可以分為兩大類[1]。第一種是用探針來檢測DNA斷裂的位點，通過收集探針信號來評估精子DNA的損傷程度，如原位缺口平移法（ISNT）和末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP 末端標記法（TUNEL）等；第二種是根據(jù)雙鏈DNA比受損的DNA不容易變性的原理，如精子染色質(zhì)擴散試驗（SCD）、精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析試驗（SCSA）、吖啶橙試驗（AOT）和彗星實驗（COMET assay）。相比于其他方法，精子染色質(zhì)擴散試驗（SCD）操作簡便、費用低、敏感度高，無需昂貴的儀器，適合基層單位開展。Rybar等[17]研究表明，在不育癥患者中，精子DNA受損程度較正常人嚴重。而Giwercman等[18]研究發(fā)現(xiàn)男性發(fā)生不育的危險性隨著碎片率的升高而增加。本研究結(jié)果顯示常規(guī)精液參數(shù)均正常的不育男性及正常生育男性中，研究組的DNA碎片率明顯高于對照組，支持上述研究結(jié)果，表明精子DNA碎片率的檢測能對男性生育能力進行較好的評估和預(yù)測。Robinson等[19]發(fā)現(xiàn)DNA損傷較嚴重的人群比無明顯DNA損傷的人群自然流產(chǎn)幾率大幅度增加。Zini等[20]認為DNA損傷的精子可能是導(dǎo)致男性不育的重要因素，即使有時可以使配偶受孕，但大多數(shù)都在早期發(fā)生自然流產(chǎn)。本研究結(jié)果同樣證明了這些觀點。配偶有早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)史的男性的DNA碎片率明顯高于正常生育男性。表明精子DNA碎片率的檢測同樣能對早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)具有一定的評估和預(yù)測作用。

綜上所述，男性不育及早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)與男性精子DNA碎片率升高有關(guān)。但是精子DNA碎片化的發(fā)生機制尚未完全清楚，臨床醫(yī)務(wù)人員還不能“尋找”出一種特別有效的能夠預(yù)防精子DNA碎片產(chǎn)生以及精子DNA碎片產(chǎn)生后如何治療等一系列針對性措施[21-23]。并且上述兩大類檢測方法對精子均有損傷，檢測后的精子不能用于輔助生殖。因此，迫切需要尋找有效的治療手段及無創(chuàng)的檢測技術(shù)。期待進一步的探討和研究能解決這兩方面問題。

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（收稿日期：2015-01-27）