婁江濤+魏任雄+余亮亮+等

[摘要] 目的 研究游離MicroRNA 34-b（miR-34b）在特發(fā)性少精子癥和特發(fā)性無精子癥患者精漿中的表達及診斷價值。 方法 收集特發(fā)性少精子癥、特發(fā)性無精子癥和同期因女方因素不孕前來檢查的生育力評估正常的健康男性精液各20份，采用實時熒光定量PCR檢測精漿游離miR-34b的相對含量，通過方差分析統(tǒng)計各組間的差異，并對精漿游離miR-34b在特發(fā)性少精子癥和特發(fā)性無精子癥中的診斷價值進行ROC曲線分析。 結(jié)果 正常對照組、特發(fā)性少精子癥組和特發(fā)性無精子癥組三組間精漿miR-34b表達量差異有高度統(tǒng)計學意義（F=21.44，P<0.01），與正常對照組相比，特發(fā)性少精子癥組和特發(fā)性無精子癥組精漿miR-34b表達量顯著降低，差異有高度統(tǒng)計學意義（P均<0.01），但特發(fā)性少精子癥組與特發(fā)性無精子癥組間精漿miR-34b相對含量差異無統(tǒng)計學意義（P=0.31）。ROC曲線顯示miR-34能夠較好的區(qū)分特發(fā)性少精子癥組與健康對照組以及特發(fā)性無精子癥組與健康對照組曲線下面積分別為（AUC）為0.85（95%CI，0.73～0.97）、0.90（95%CI，0.80～0.99）。 結(jié)論 miR-34b在特發(fā)性少精子癥和特發(fā)性無精子癥患者精漿中明顯降低，并對特發(fā)性少精子癥和特發(fā)性無精癥子癥顯示出一定的診斷價值。

[關鍵詞] 特發(fā)性少精子癥；特發(fā)性無精子癥；miR-34b；精漿

[中圖分類號] R698.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）25-0004-04

The expression and clinical role of seminal plasma free MicroRNA 34-b in patients with idiopathic oligospermia and azoospermia

LOU Jiangtao WEI Renxiong YU Liangliang SHI Bo CUI Yun

Male Division Laboratory， Ningbo Traditional Chinese Medicine Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medicine University， Ningbo 315012， China

[Abstract] Objective To quantify the expression of seminal plasma free miR-34b in patients with idiopathic oligospermia and azoospermia and to analyze the diagnostic value of it. Methods 20 cases semen of Idiopathic oligospermia and azoospermia were collected， respectively. At the same time， 20 cases semen of healthy male with fertility evaluation which because of the woman factor lead to infertility were collected as control group. the relative expression of seminal plasma free miR-34b was detected by real-time fluorescent quantitative PCR， the dates were analyzed by variance analysis， the diagnostic value of seminal plasma free miR-34b in diseases of oligospermia and azoospermia were analyzed by ROC curve. Results The relative expression of seminal plasma free miR-34b in oligospermia group and azoospermia group were decreased compared with normal controls（P<0.01）， while there were not change between oligospermia group and azoospermia group（P=0.31）. ROC curve showed that miR-34b could distinguish between oligospermia disease and healthy control， the azoospermia and healthy control， the area under the curve were 0.85（95%CI，0.73-0.97） and 0.90（95%CI，0.80-0.99）， respectively. Conclusion The expression of miR-34b was decreased obviously in patients with oligospermia and azoospermia，and shows certain diagnostic value.

[Key words] Idiopathic oligospermia； Idiopathic azoospermia； MiR-34b； Seminal plasma

特發(fā)性少精子癥和特發(fā)性無精子癥在特發(fā)性男性不育中占有較大比重，目前對該疾病的發(fā)病機制尚不清楚。microRNA（miRNA）的發(fā)現(xiàn)為我們認識疾病開辟了一條新途徑，多項研究表明miRNA 與男（雄）性生殖系統(tǒng)密切相關。其中MicroRNA 34-b（miR-34）基因家族參與細胞周期、凋亡的調(diào)控，與精子的發(fā)生、凋亡關系密切[1，2]。本文旨在研究miR-34b在特發(fā)性少精子癥及無精子癥精漿中的表達，探討其在該疾病中的可能作用機制，并初步分析其在特發(fā)性少精子癥和特發(fā)性無精子癥中的診斷價值。

1 材料與方法

1.1 病例選擇

選取2012年8月～2014年11月來我院男科就診的特發(fā)性少精子癥20例，年齡分別為25～39歲，平均（32.1±4.4）歲和特發(fā)性無精子癥患者20例，年齡26～42歲，平均（31.5±4.5）歲。精液常規(guī)分析3次以上且均為少精或3000 r/min離心15 min后顯微鏡觀察均為無精，每次精液檢測間隔2個月，排除精液量異常、血精、液化不良、畸形精子癥、精液白細胞數(shù)≥1×106/mL以及高熱病史、自身免疫性疾病和接觸化學及放射性物質(zhì)的相關職業(yè)者。另外選擇同期因女方因素造成不孕，生育能力評估正常的健康男性20例為正常對照組，年齡25～39歲，平均（29.6±3.4）歲。各組在年齡結(jié)構(gòu)、婚齡等基線資料方面經(jīng)齊同性檢驗差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性，所有對象均簽署知情同意。

1.2 標本收集與處理

依WHO要求，禁欲3～7 d，洗手排小便后手淫法采集精液，并用干燥消毒的精液采集器收集全部精液，置37℃多維混勻恒溫箱，待充分液化后行精液常規(guī)檢查。3000 r/min離心15 min，取精漿即時測定精漿miR-34b，或置-80℃冰箱保存待用，用以批量測定。

1.3 主要試劑和儀器

WLJY-9000偉力彩色精子檢測系統(tǒng)（北京偉力公司），miR-34bTaqmanmiRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，TaqmanmiRNA qPCR試劑盒，TaqMan small RNA引物（5×），Taq Man small RNA引物（20×）均購自美國ABI有限公司。Trizol購自美國，高速冷凍離心機為美國Beckman Coulter公司Allegra 64R，反轉(zhuǎn)錄PCR儀為美國BIO-RAD公司S1000 Thermal Cycler，實時熒光定量PCR儀為美國BIO-RAD公司CFX96。

1.4 精液常規(guī)分析

按照WHO《人類精液檢查與處理實驗室手冊》（第5版）的要求進行精液分析[3]，待精液液化后應用北京偉力計算機輔助精子分析系統(tǒng)分析精子常規(guī)參數(shù)。液化時間通過肉眼和顯微鏡觀察相結(jié)合的方式進行識別判讀。

1.5 精子總RNA 的提取

（1）預處理，取200 μL精漿加入2 μL濃度為100 μg/mL蛋白酶K于37℃水浴箱1 h后，再加入140 μL醋酸鈉、60 μL β-巰基乙醇、50 μL PBS和0.024 PVP充分混勻于室溫下放置15 min，然后15000 rpm，4℃離心10 min，取上清液用于Trizol法提取RNA。（2）Trizol法提取RNA，取200 μL 預處理的精漿加入1 mL Trizol中充分均勻，將勻漿液倒入1.5 mL離心管中，再依次加入氯仿、異丙醇及95%乙醇，獲得總RNA。（3）提取效率評估：應用20 μL DEPC水溶解RNA沉淀，取2 μL總RNA加入98 μL DEPC水稀釋后用分光光度計測定A260/A280，比值在1.8～2.0用于后續(xù)實驗。

1.6 逆轉(zhuǎn)錄和Q-PCR

按照TapManmiRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑說明書將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，目的基因和內(nèi)參基因引物分別為Taq Manhsa-miR-34b引物（5×）或內(nèi)參TaqMan U6 sn RNA引物（5×）。合成cDNA后，按照TaqManmiRNA qPCR試劑說明書進行實時熒光定量PCR檢測，反應液為TaqMan Universal PCR混合試劑Ⅱ，分別加入Taq Manhsa-miR-34b引物（20×）或內(nèi)參TaqManU6snRNA引物（20×）進行擴增，以U6的量為內(nèi)參照，計算miR-34b的相對表達量為，計算公式[4]：△Ct為2Ct（U6）-Ct（miR-34b）。

1.7 統(tǒng)計學處理

采用SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。經(jīng)正態(tài)性檢驗，精液質(zhì)量參數(shù)和精漿miR-34b相對表達量符合正態(tài)分布，采用（x±s）表示；兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，多組間均數(shù)比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組病例的一般資料及精液常規(guī)參數(shù)

各組病例的一般精液常規(guī)參數(shù)比較見表1。

2.2 精漿miRNA-34b在特發(fā)性少精子癥和非梗阻性無精子癥精漿中含量比較

單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（F=36.41，P<0.01）。組間兩兩比較發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，在特發(fā)性少精子癥和特發(fā)性無精子癥精漿中miRNA-34b含量明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P均<0.01），但特發(fā)性少精子癥組與特發(fā)性無精子癥組間精漿miR-34b相對含量差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表2。

表2 精漿miRNA-34b在各組精漿中的表達分析（x±s）

注：方差齊性檢驗F=6.465，P=0.003；方差不齊，組間比較采用近似F檢驗Welch法，F(xiàn)=36.41，P<0.01；組間兩兩比較采用Dunnetts T3，*正常組與特發(fā)性少精子組比較，**正常組與特發(fā)性無精子組比較，***特發(fā)性無精子癥與特發(fā)性少精子癥組比較

2.3 精漿miRNA-34b對特發(fā)性少精子癥和特發(fā)性無精子證的診斷價值

通過ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，精漿miRNA-34b在評價特發(fā)性少精子癥組和正常對照組的曲線下面積為0.85（95%CI，0.73，0.97），當最佳臨界值為0.059，敏感度85.00%，特異度75.00%。見圖1。精漿miRNA-34b在評價非梗阻性無精子癥組和正常對照組的曲線下面積為0.90（95%CI，0.80，0.99），當最佳臨界值為0.056，敏感度90%，特異度80%。見圖2。

3 討論

特發(fā)性少精子癥及特發(fā)性無精子癥是導致男性不育的臨床難題，其發(fā)病原因復雜，機制尚不清楚。目前用于診斷和評估特發(fā)性少精癥及特發(fā)性無精癥的主要手段仍然是精液常規(guī)分析，此方法學受多種因素影響，很難準確的反應和全面的評估男性生育能力，而且精液常規(guī)參數(shù)僅能從表觀層面反應精液質(zhì)量，不能從根本上闡述男性不育癥發(fā)生發(fā)展的機制。miRNA是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70～90個堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后生成的一類非編碼單鏈小分子RNA，大小為22 nt左右，主要通過與靶基因不完全互補結(jié)合，進而抑制翻譯或促進mRNA聚腺苷酸尾巴的去除等方式調(diào)控靶基因的表達。大量研究表明，miRNA在胚胎干細胞和多種成體干細胞的發(fā)育、胚胎后期發(fā)育、細胞生長和凋亡、血細胞分化、神經(jīng)元的極性、胰島素分泌、大腦形態(tài)形成、心臟發(fā)生及免疫系統(tǒng)的調(diào)控等過程中發(fā)揮著重要。同時它可游離于體液中，血液、唾液、尿液中miRNA已在多種疾病的診斷和預后中顯示了獨特的價值[5-7]，被認為是一種潛在的很有前途的組織特異性的無創(chuàng)生物標記物。

MicroRNA與男性生殖系統(tǒng)關系密切[8]。精漿中游離RNA含量豐富，明顯高于血漿和唾液，并且與精子的發(fā)生密切相關[9]。最近研究發(fā)現(xiàn)miRNA相關的Dicer酶在精子分化中起重要作用，在睪丸支持細胞中選擇性切除Dicer，可導致睪丸功能退化，精子數(shù)目減少，并可導致不育。以上說明miRNA可能在精子發(fā)生中起到重要的調(diào)控作用。

miR-34是一個保守的miRNA家族，在脊椎動物中，由miR-34a，miR-34b和miR-34c 3個同源miRNA分子組成。成熟mir-34b和mir-34c序列分別位于同一主基因原初轉(zhuǎn)錄本的內(nèi)含子1 和外顯子2 內(nèi)[10]。多種研究表明miR-34基因家族與精子發(fā)生密切相關，如miR-34c能通過Nanos2提高小鼠精原干細胞的分化[11]，并能通過ATF1基因調(diào)控精原細胞的凋亡[12]。另外miR-34家族成員受p53直接調(diào)控，同時其還能夠通過對某些p53活性調(diào)節(jié)基因的調(diào)控，進而參與p53通路的反饋調(diào)節(jié)[13-15]，而p53在睪丸組織高度表達，并與精母細胞的分裂和生精細胞的凋亡關系密切[2]，提示miR-34可能通過對p53的調(diào)節(jié)而影響精子的生成和凋亡。mir-34b和mir-34c前體位于同一主基因內(nèi)，但目前有關mir-34b與精子發(fā)生及發(fā)育之間的研究還鮮有報道，本課題研究發(fā)現(xiàn)在特發(fā)性少精子癥患者及特發(fā)性無精子癥者精漿中miR-34b表達均明顯下調(diào)（P均<0.01），提示其與精子的發(fā)生發(fā)育存在緊密聯(lián)系，但其作用機制以及是否與P53基因存在聯(lián)系還有待進一步研究。另外通過ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，miR-34b表達量可較好區(qū)分精子濃度正常組與特發(fā)性少精和特發(fā)性無精組。而在特發(fā)性少精子癥組與特發(fā)性無精子癥組間的表達差異無統(tǒng)計學意義，提示精漿miR-34b在區(qū)分特發(fā)性少精子癥和特發(fā)性無精子癥方面的可能作用較為有限。

人類miRNAs約占據(jù)整個基因組數(shù)量的1%，但它們控制并影響人類約1/3的基因表達，使機體內(nèi)各種蛋白質(zhì)處在一個恰當?shù)乃剑Ｕ蠙C體各器官的正常功能。特發(fā)性少精及特發(fā)性無精癥是導致男性不育的重要原因之一，致病原因復雜，至今對其發(fā)病機制尚不清楚。本研究實驗數(shù)據(jù)證實miR-34b與精子密度存在密切聯(lián)系，提示我們可以miR-34b為切入點，進一步研究其在男性生殖系統(tǒng)內(nèi)的聯(lián)系網(wǎng)絡和機制，為我們進一步認識特發(fā)性少精子癥及特發(fā)性無精子癥癥提供思路和基礎。

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（收稿日期：2015-03-30）