楊映華，魏用林，刀建華，鄭向前，畢學(xué)瑞，曾 濤

（西雙版納州質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測(cè)中心，云南 景洪 666100）

干膠含量是天然膠乳重要的質(zhì)量指標(biāo)。近年來(lái)云南、廣東等產(chǎn)膠區(qū)出現(xiàn)了在膠乳中摻入蔗糖、尿素、淀粉、膩?zhàn)臃酆突鄣任镔|(zhì)的現(xiàn)象，其目的是提高干膠含量測(cè)定值，從中謀取暴利。

蔗糖是由一分子葡萄糖和一分子果糖結(jié)合而成的二糖，是基本的食品添加劑之一。蔗糖溶解度大、價(jià)格便宜，是最常見(jiàn)的膠乳摻雜物質(zhì)之一，危害性較大。在生物凝固天然膠乳工藝中，加入一定量蔗糖，可為微生物提供碳源并參與反應(yīng)生成有機(jī)酸[1-3]。但對(duì)其他生產(chǎn)工藝而言，摻加蔗糖對(duì)膠乳保存和加工是不利的。為降低成本，摻假者通常摻加雜質(zhì)含量較大的工業(yè)糖或糖蜜，以摻雜膠乳加工而得的天然橡膠可能出現(xiàn)夾生、發(fā)脹、發(fā)粘、雜質(zhì)和灰分含量高、塑性值和塑性保持率偏低以及機(jī)械強(qiáng)度差等問(wèn)題，給生產(chǎn)企業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響下游橡膠制品的質(zhì)量、增大加工難度。因此有必要建立針對(duì)鮮膠乳或氨保存膠乳中蔗糖的快速檢測(cè)方法，在膠乳驗(yàn)收環(huán)節(jié)有效識(shí)別摻雜膠乳。

蔗糖的快速檢測(cè)主要為顯色法，包括蒽酮-硫酸法、苯酚法、Molisch法（α-萘酚法）、Seliwanoff法（間苯二酚法）等[4-6]，這些方法基于蔗糖在濃無(wú)機(jī)酸催化下生成的糠醛類物質(zhì)與蒽酮或酚類縮合，生成有色物質(zhì)。由于苯酚和α-萘酚易被氧化為醌類物質(zhì)，因此使用前須重蒸或重結(jié)晶，操作繁瑣。

本工作以較穩(wěn)定的蒽酮、麝香草酚、間苯二酚為顯色劑，對(duì)3種顯色方法的影響因素進(jìn)行考察，優(yōu)選操作條件，以建立簡(jiǎn)便、靈敏的天然膠乳中蔗糖的快速檢測(cè)方法。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 原料及試劑

鮮膠乳及測(cè)試樣品由橡膠加工企業(yè)提供；蔗糖、蒽酮、麝香草酚、間苯二酚、肌醇、硫酸、鹽酸、層析用纖維素粉和可溶性淀粉均為分析純，市售；試驗(yàn)用水為去離子水。

蒽酮-硫酸試劑：稱取0.1 g蒽酮，用硫酸溶液（硫酸/水體積比為3∶1）溶解并定容至100 mL，蒽酮質(zhì)量濃度為1 g·L-1。

麝香草酚試劑：稱取麝香草酚5 g，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.95的乙醇溶解并定容至100 mL，麝香草酚質(zhì)量濃度為50 g·L-1，置于棕色瓶中。

間苯二酚試劑：稱取間二苯酚50 mg，溶于100 mL鹽酸溶液（鹽酸/水體積比為1∶2）中，間苯二酚質(zhì)量濃度為0.5 g·L-1。

1.2 原理

蔗糖在酸性條件下水解生成葡萄糖和果糖，兩者進(jìn)一步脫水生成5-羥甲基糠醛[7]；5-羥甲基糠醛與蒽酮反應(yīng)生成藍(lán)色物質(zhì)，與麝香草酚或間苯二酚反應(yīng)生成紅色或紫色物質(zhì)。以空白膠乳為參照，根據(jù)膠乳樣品的變色情況，判定是否摻加蔗糖。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

取待檢測(cè)膠乳樣品和正常膠乳各10 mL，滴加適量硫酸溶液（硫酸/水體積比為1∶4）至膠乳完全凝固，待略澄清，移出乳清層供測(cè)試用。

1.3.2 顯色方法

（1）蒽酮-硫酸顯色法：移取乳清1 mL于試管中，加入蒽酮-硫酸試劑3 mL，充分振搖，觀察顯色情況。

（2）麝香草酚顯色法（紫環(huán)反應(yīng)法）：移取乳清1 mL于試管中，滴加麝香草酚試劑2滴，搖勻，傾斜試管，沿管壁緩慢加入濃硫酸1.5 mL，切勿振搖，觀察乳清層與硫酸層交界處有無(wú)紫環(huán)出現(xiàn)。

（3）間苯二酚顯色法：移取乳清1 mL于試管中，加入間苯二酚試劑3 mL，搖勻，置于沸水浴中加熱3 min，觀察顏色變化。

1.3.3 檢測(cè)下限測(cè)定

制備蔗糖質(zhì)量濃度為0.1～1 g·L-1的一系列膠乳，按試驗(yàn)方法進(jìn)行顯色，以出現(xiàn)陽(yáng)性現(xiàn)象的最小質(zhì)量濃度作為方法的檢測(cè)下限。

1.3.4 其他物質(zhì)的干擾

以加氨膠乳及摻加肌醇、可溶性淀粉、纖維素粉和甲酸的乳清為試驗(yàn)對(duì)象，分別按試驗(yàn)方法顯色，并與空白乳清和摻加蔗糖的乳清進(jìn)行對(duì)比。

2 結(jié)果與討論

2.1 蒽酮-硫酸顯色法

2.1.1 蒽酮-硫酸試劑配比對(duì)顯色的影響

取蔗糖質(zhì)量濃度為10 g·L-1的膠乳清液各1 mL于5支試管中，分別加入蒽酮質(zhì)量濃度為1 g·L-1、溶劑為硫酸溶液的顯色劑3 mL，硫酸溶液中硫酸/水體積比分別為2∶3，3∶2，3∶1，4∶1和5∶0，考察硫酸溶液濃度對(duì)顯色的影響。結(jié)果顯示后3種混合液均瞬間顯藍(lán)色，且顏色無(wú)明顯差別，前兩種顯色較慢，顏色為藍(lán)綠色，顏色稍淺。因此選擇硫酸/水體積比為3∶1的硫酸溶液為顯色劑溶劑。

以硫酸/水體積比為3∶1的硫酸溶液為顯色劑的溶劑，考察蒽酮質(zhì)量濃度為0.2，0.5，1.0，2.0和3.0 g·L-1的顯色劑對(duì)空白乳清及含蔗糖乳清（質(zhì)量濃度為10 g·L-1）的顯色情況。由于蒽酮顯色劑本身顯淺黃色，加至空白乳清后混合液均顯淺黃色，蒽酮質(zhì)量濃度達(dá)2.0 g·L-1的顯色劑滴加后有部分蒽酮析出，使混合液出現(xiàn)渾濁。含蔗糖乳清均顯藍(lán)色，質(zhì)量濃度為0.2和0.5 g·L-1的乳清顏色淺于其他3個(gè)質(zhì)量濃度的乳清。

高濃度硫酸有利于糖的水解和糠醛化合物的形成，硫酸與水混溶時(shí)可使混合液溫度升高，也有利于反應(yīng)快速進(jìn)行。傳統(tǒng)的蒽酮-硫酸法常直接用濃硫酸作溶劑，由于濃硫酸具有強(qiáng)氧化性和脫水性，蒽酮易被炭化，蒽酮-硫酸試劑不能長(zhǎng)期貯存，須使用時(shí)臨時(shí)配制，適當(dāng)降低硫酸濃度可延長(zhǎng)保存期。綜合考慮顯色劑背景顏色、蒽酮在混合液中溶解度和對(duì)含蔗糖樣品的顯色情況，選擇適合的顯色劑為：以硫酸/水體積比為3∶1的硫酸溶液為溶劑，蒽酮質(zhì)量濃度為1.0 g·L-1，此溶液兩周內(nèi)可正常使用。

2.1.2 蒽酮-硫酸試劑用量

取蔗糖質(zhì)量濃度為10 g·L-1的膠乳清液各1 mL于6支試管中，分別加入0.5，1，2，3，4和5 mL蒽酮-硫酸試劑。前兩管顯色緩慢，顏色較其他4管淺；前3管出現(xiàn)蒽酮析出的現(xiàn)象。因此確定蒽酮-硫酸試劑用量為3 mL。

2.1.3 檢測(cè)下限

以空白乳清和蔗糖質(zhì)量濃度為0.1，0.2，0.5，0.8和1.0 g·L-1的乳清為試驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行顯色，質(zhì)量濃度為0.2 g·L-1的含蔗糖膠乳呈現(xiàn)可區(qū)別于空白乳清的陽(yáng)性現(xiàn)象，因此確定蔗糖質(zhì)量濃度0.2 g·L-1為方法檢測(cè)下限。

2.1.4 干擾物質(zhì)的影響

2.1.4.1 氨

膠乳采收后為防止自然凝固，通常需加氨保鮮。以氨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0，0.001，0.002，0.005，0.008，0.01和0.015的空白膠乳和摻蔗糖膠乳（蔗糖質(zhì)量濃度為1和10 g·L-1）為試驗(yàn)對(duì)象，考察膠乳氨含量對(duì)顯色的影響。結(jié)果表明，氨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0～0.015時(shí)空白膠乳未顯色，摻蔗糖膠乳正常顯色。

2.1.4.2 甲酸

甲酸是使用最廣泛的橡膠凝固劑，甲酸分子中存在活潑醛基，可能與顯色劑發(fā)生類似糠醛的反應(yīng)。以甲酸含量（體積分?jǐn)?shù)）為0，0.02，0.05，0.1和0.15的空白膠乳和摻蔗糖膠乳（蔗糖質(zhì)量濃度為1和10 g·L-1）為試驗(yàn)對(duì)象，考察甲酸含量對(duì)顯色的影響。結(jié)果顯示，甲酸體積分?jǐn)?shù)在0.15以下時(shí)對(duì)顯色試驗(yàn)無(wú)干擾。

2.1.4.3 淀粉

淀粉是常見(jiàn)的膠乳摻雜物質(zhì)之一。淀粉是由葡萄糖縮合成的鏈狀大分子多糖，在一定條件下可發(fā)生水解斷鏈，生成多元糖和寡糖，甚至完全水解為葡萄糖，可能干擾本研究的顯色。取淀粉質(zhì)量濃度為10和40 g·L-1的摻淀粉乳清進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果均未顯色，表明淀粉對(duì)顯色試驗(yàn)無(wú)干擾。

2.1.4.4 纖維素

一些摻雜膠乳中摻入含有纖維素粉和纖維素衍生物的膩?zhàn)臃?，纖維素是由葡萄糖縮合成的多糖，一定條件下纖維素亦可發(fā)生水解?？疾烊榍逯欣w維素粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05時(shí)對(duì)顯色的影響，結(jié)果表明纖維素對(duì)顯色試驗(yàn)無(wú)干擾。

2.1.4.5 肌醇

肌醇類物質(zhì)是天然橡膠乳清中含量最多的碳水化合物，其中白堅(jiān)木皮醇含量最高，其在膠乳中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01～0.015[8-9]。肌醇是一種多羥基環(huán)醇，結(jié)構(gòu)與單糖相似。配制肌醇溶液和一系列肌醇-蔗糖混合溶液，其中肌醇質(zhì)量濃度均為20 g·L-1，蔗糖質(zhì)量濃度分別為0，0.5，1，5，10和20 g·L-1。結(jié)果顯示含蔗糖混合溶液均正常顯色，肌醇溶液未顯色，表明肌醇對(duì)顯色試驗(yàn)無(wú)干擾。

2.2 麝香草酚顯色法

2.2.1 顯色劑的選擇

麝香草酚顯色法通常加入Molisch試劑。由于α-萘酚容易被氧化，須在苯中重結(jié)晶后才能使用，試劑須使用前臨時(shí)配制，操作繁瑣。因此本研究采用麝香草酚的乙醇溶液替代Molisch試劑，麝香草酚質(zhì)量濃度為50 g·L-1、硫酸用量為1.5 mL時(shí)顯色效果良好。

2.2.2 反應(yīng)時(shí)間

取空白乳清及蔗糖質(zhì)量濃度為0.5，1，5，10，20，50和100 g·L-1的橡膠乳清各1 mL盛于8支試管中，進(jìn)行麝香草酚顯色反應(yīng)試驗(yàn)，加入硫酸后開(kāi)始計(jì)時(shí)。結(jié)果表明：后5管在數(shù)秒內(nèi)即出現(xiàn)色環(huán)；2 min時(shí)所有含蔗糖管均出現(xiàn)色環(huán)，隨蔗糖濃度增大，色環(huán)由淺紅加深至紅褐色；至10 min時(shí)含蔗糖管色環(huán)顏色繼續(xù)加深，空白乳清未出現(xiàn)色環(huán)。因此認(rèn)為適宜觀察時(shí)間為加入硫酸2 min后。

2.2.3 檢測(cè)下限

以空白乳清和蔗糖質(zhì)量濃度為0.1，0.2，0.5，0.8和1.0 g·L-1的乳清為試驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行顯色，質(zhì)量濃度為0.2 g·L-1的含蔗糖膠乳均呈現(xiàn)可區(qū)別于空白乳清的陽(yáng)性現(xiàn)象，因此確定蔗糖質(zhì)量濃度0.2 g·L-1為方法檢測(cè)下限。

2.2.4 干擾物質(zhì)的影響

參照2.1.4進(jìn)行干擾物質(zhì)的影響試驗(yàn)，考察氨、甲酸、淀粉、纖維素和肌醇對(duì)顯色反應(yīng)的影響。試驗(yàn)結(jié)果如下。

（1）氨、纖維素和肌醇對(duì)顯色試驗(yàn)無(wú)干擾。

（2）含淀粉膠乳出現(xiàn)淺黃色環(huán)，顏色與蔗糖質(zhì)量濃度為0.5 g·L-1的乳清形成的色環(huán)接近，表明淀粉對(duì)低濃度蔗糖（質(zhì)量濃度低于0.5 g·L-1）的檢測(cè)構(gòu)成干擾，對(duì)較高濃度蔗糖（質(zhì)量濃度高于0.5 g·L-1）則干擾不明顯。

（3）含甲酸樣品加入硫酸后，兩相交界處產(chǎn)生大量氣泡，會(huì)使含蔗糖的樣品色環(huán)變寬，不含蔗糖的樣品不出現(xiàn)色環(huán)，可認(rèn)為甲酸對(duì)顯色試驗(yàn)無(wú)干擾。

2.3 間苯二酚顯色法

2.3.1 顯色條件確定

取空白乳清及蔗糖質(zhì)量濃度為0.5，1，5，10，20，50和100 g·L-1的乳清各1 mL盛于8支試管中，進(jìn)行間苯二酚顯色法試驗(yàn)，置沸水浴中開(kāi)始計(jì)時(shí)，考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)顯色情況的影響。結(jié)果表明：加熱2 min后含蔗糖管均顯色，隨蔗糖濃度增大顏色由淺橙紅色加深至深紅色；加熱3 min后含蔗糖管顏色繼續(xù)加深（橙紅色到深紅褐色），空白管為淡黃色；3～10 min含糖管顏色仍有所加深，空白管仍為淡黃色。因此確定沸水浴反應(yīng)時(shí)間至少為3 min。

2.3.2 檢測(cè)下限

以空白乳清和蔗糖質(zhì)量濃度為0.1，0.2，0.5，0.8和1.0 g·L-1的乳清為試驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行顯色，蔗糖質(zhì)量濃度為0.1 g·L-1的膠乳均呈現(xiàn)可區(qū)別于空白乳清的陽(yáng)性現(xiàn)象，因此確定蔗糖質(zhì)量濃度0.1 g·L-1為方法檢測(cè)下限。

2.3.3 干擾物質(zhì)的影響

參照2.1.4進(jìn)行干擾物質(zhì)的影響試驗(yàn)，考察氨、甲酸、淀粉、纖維素和肌醇對(duì)顯色反應(yīng)的影響。試驗(yàn)結(jié)果如下。

（1）氨、纖維素、肌醇和甲酸對(duì)顯色試驗(yàn)沒(méi)有干擾。

（2）含淀粉乳清顯淺黃色，顏色明顯淺于蔗糖質(zhì)量濃度0.1 g·L-1的乳清樣品，表明含淀粉樣品雖能出現(xiàn)顯色反應(yīng)，但顏色較淺，對(duì)蔗糖檢驗(yàn)干擾不明顯。

2.4 方法實(shí)用性試驗(yàn)

2.4.1 錯(cuò)檢率及漏檢率

分別以3種顯色方法測(cè)試不同品系、不同采收時(shí)期的空白鮮膠乳樣品和蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.005～0.15的膠乳樣品。結(jié)果顯示：50個(gè)空白膠乳樣品均未出現(xiàn)陽(yáng)性現(xiàn)象，無(wú)錯(cuò)檢；50個(gè)添加蔗糖膠乳樣品均出現(xiàn)陽(yáng)性現(xiàn)象，該濃度水平的蔗糖無(wú)漏檢。

2.4.2 樣品檢測(cè)

取83個(gè)樣品分別用3種顯色方法測(cè)試，樣品均來(lái)自西雙版納和紅河地區(qū)，包括46個(gè)鮮膠乳樣品（氨質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于0.001 5）、7個(gè)濃縮天然膠乳樣品、24個(gè)凝固過(guò)程產(chǎn)生的乳清樣品、6個(gè)壓縐脫出乳清樣品。其中33個(gè)樣品檢出蔗糖，3種方法測(cè)試結(jié)果一致。

2.5 方法改進(jìn)

基于相同的試驗(yàn)原理，使用點(diǎn)滴板替代試管進(jìn)行顯色可加快操作速度、減少試劑消耗，適于大批量樣品的快速檢測(cè)。因點(diǎn)滴板無(wú)法加熱，故在間苯二酚顯色法中引入硫酸，以使蔗糖能快速水解和糠醛化。對(duì)試劑用量、試劑加入次序、反應(yīng)時(shí)間等因素進(jìn)行考察，優(yōu)選出下列操作條件。

（1）蒽酮-硫酸法：于白色陶瓷點(diǎn)滴板中加入蒽酮-硫酸試液5滴，滴加膠乳乳清1滴，同時(shí)以空白膠乳乳清作對(duì)照，觀察顯色情況。

（2）麝香草酚法：吸取空白膠乳乳清和樣品膠乳乳清各1滴于白色陶瓷點(diǎn)滴板中，分別加入濃硫酸3滴，30 s后滴加麝香草酚試劑1滴，觀察顯色情況。

（3）間苯二酚法：于白色陶瓷點(diǎn)滴板中加入濃硫酸2滴，滴加膠乳乳清1滴，1 min后滴加間苯二酚試劑3滴，以空白膠乳乳清作對(duì)照，3 min后觀察顯色情況。

3 結(jié)論

（1）建立了3種膠乳中蔗糖的快速檢測(cè)方法，并優(yōu)選操作條件。蒽酮-硫酸顯色法：顯色劑中蒽酮質(zhì)量濃度 1 g·L-1，介質(zhì) 硫酸/水體積比為3∶1的硫酸溶液、用量為3 mL，檢測(cè)下限 0.2 g·L-1；麝香草酚顯色法：顯色劑 質(zhì)量濃度為50 g·L-1的麝香草酚-乙醇溶液，反應(yīng)時(shí)間 2 min，檢測(cè)下限 0.2 g·L-1；間苯二酚顯色法：顯色劑

質(zhì)量濃度為0.5 g·L-1的間二苯酚-鹽酸溶液，沸水浴中加熱反應(yīng)3 min，檢測(cè)下限 0.1 g·L-1。

（2）考察了氨、甲酸、淀粉、纖維素和肌醇對(duì)顯色反應(yīng)的影響，其中淀粉對(duì)麝香草酚顯色法、間苯二酚顯色法呈弱陽(yáng)性反應(yīng)，其余物質(zhì)對(duì)檢測(cè)均無(wú)干擾。可通過(guò)碘顯色法確認(rèn)樣品中是否含淀粉。

（3）3種方法具有靈敏度高、檢測(cè)下限低、速度快和操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，可應(yīng)用于膠乳驗(yàn)收及加工過(guò)程中摻加蔗糖的快速檢測(cè)和實(shí)時(shí)監(jiān)控。