楊皓然++方凱++孫曉菲++解宇環(huán)

【摘要】 目的：觀察六君子湯對皮膚屏障功能障礙小鼠的影響。方法：采用膠帶法復(fù)制皮膚屏障功能障礙小鼠模型，觀察正常組、模型組和六君子湯給藥組小鼠經(jīng)皮水分丟失量（TEWL）和神經(jīng)酰胺含量的差異。結(jié)果：模型組小鼠TEWL值上升（P

【關(guān)鍵詞】 六君子湯；皮膚屏障功能障礙；經(jīng)皮水分丟失量；神經(jīng)酰胺

【中圖分類號】R285.5

【文獻標(biāo)志碼】A

【文章編號】1007-8517（2015）24-0012-02

皮膚屏障包括皮膚的機械屏障、免疫屏障、神經(jīng)屏障以及其他與皮膚功能相關(guān)方面，狹義的皮膚屏障常指表皮，尤其是角質(zhì)層的機械性屏障。機械屏障直接與外界接觸，是機體與外界環(huán)境之間的屏障。該屏障對外界物理性、化學(xué)性、細(xì)菌等微生物損傷具有防護作用，并有助于維持皮膚的完整性，防止體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)、水份等的丟失。皮膚屏障功能的障礙可誘發(fā)濕疹、特應(yīng)性皮炎、銀屑病等皮膚疾病。中醫(yī)臨床治療本類疾病過程中，無論哪一種證型，都應(yīng)兼顧脾胃，而健脾法是治療皮膚屏障障礙相關(guān)疾病的重要方法。本研究選用益氣健脾經(jīng)典方劑六君子湯，觀察其對模型小鼠皮膚機械屏障障礙的影響，以初步探討健脾方藥對皮膚機械屏障功能的作用。

l 儀器與材料

1.1 動物 SPF級ICR小鼠，雌雄各半，體重18-22g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。合格證號：SCXK（京）2014-0004。

1.2 藥品與試劑六君子湯：人參36g，茯苓36g，炒白術(shù)36g，炙甘草24g，陳皮12g，半夏18g，藥材購自昆明市“一心堂”連鎖藥店，均由中藥鑒定教研室張潔老師鑒定為正品。按方中比例水煎、過濾、濃縮制成浸膏，4℃保存；神經(jīng)酰胺標(biāo)準(zhǔn)品（美國sigma aldrich公司）；胰酶（Lot No：MR28175，法國）；其余試劑均為分析純。

1.3 儀器YLS-Q4耳腫打耳器（直徑為8mm，山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站）；HX086146薄層色譜硅膠板（德國Merck公司）；Vapo Meter測量儀（芬蘭Delfin Technologies公司）。

2 方法

2.1 動物分組及處理將健康ICR小鼠，根據(jù)體重分層隨機分為5組。即正常對照組、模型組、六君子湯高、中、低劑量組。除六君子湯各組分別灌胃給予不同濃度的的六君子湯水煎液外，其余各組灌胃給予等體積蒸餾水，每天1次，連續(xù)13d。除正常對照組外，其余各組從給藥第9天起，以膠帶法復(fù)制皮膚機械屏障障礙模型，連續(xù)5d。造模各組于造模前l(fā)天，剃去小鼠頸背部被毛。

2.2 表皮經(jīng)皮水分丟失量（TEWL）測定 造模第5天，用Vapo Meter測量儀測定小鼠頸背部皮膚TEWL值，室溫20-25℃，空氣相對濕度50%-60%。測量儀器與測量部位皮膚表面垂直接觸，每一測試部位測量3次，讀出數(shù)值并記錄，取其平均值。

2.3 表皮神經(jīng)酰胺含量的測定

2.3.1 表皮脂質(zhì)的提取造模第5天，檢測完TEWL值后將小鼠處死，取下頸背部皮膚，用打耳器打成面積約為50mm²大小的皮膚圓片共6片。將所取皮片浸泡于胰酶中，37℃水浴th，4℃冰箱放置過夜后取出，分離表皮，抽提表皮脂質(zhì)，氮氣吹干，-80℃冰箱保存。

2.3.2 對照品的制備稱取神經(jīng)酰胺對照品5.0mg，置5ml容量瓶中，加氯仿適量，振搖溶解，定容后從中精密吸取Iml溶液，加氯仿定容至5ml，即得0.2mg/ml對照品溶液。

2.3.3 線性關(guān)系考察 精密吸取2、4、6、8、10、12、14μl神經(jīng)酰胺對照品溶液點于薄層板上展開（展開劑為正己烷一乙酸乙酯=3：1），晾干后再于氯仿一甲醇一氨水（90：10：0.5）中展開；噴灑顯色劑于140℃下烘干顯色。顯色后采集圖片并用Image J軟件分析，測定灰度值。經(jīng)計算得到回歸方程），=5346.3x+4222.2，R²=0.9973，線性關(guān)系良好，線性范圍為0.4-2.8μg。

2.3.4 神經(jīng)酰胺含量測定 吸取對照品溶液、供試品溶液，按上述條件測定灰度值，最終換算出神經(jīng)酰胺含量。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法實驗數(shù)據(jù)用（x+s）表示，方差齊的組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），方差不齊的采用秩和檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對皮膚TEWL值的影響由表1可知，與正常對照組比較，皮膚屏障功能障礙小鼠TEWL值增加（P<0.01）；與模型對照組比較，六君子湯三個劑量組均能降低TFWL值（P<0.01）。

3.2 對神經(jīng)酰胺含量的影響 與正常對照組比較，皮膚屏障障礙小鼠神經(jīng)酰胺含量降低（P<0.05）；與模型對照組比較，六君子湯高、中劑量組均能增加神經(jīng)酰胺含量（P<0.05）。見表2。

4 討論

有學(xué)者將皮膚屏障比喻為“磚墻”結(jié)構(gòu)，角質(zhì)細(xì)胞好比“磚”，而細(xì)胞問脂質(zhì)好比“灰漿”，它將角質(zhì)細(xì)胞緊密地連接起來，使皮膚屏障功能正常。細(xì)胞間脂質(zhì)主要是由膽固醇、脂肪酸和神經(jīng)酰胺以適當(dāng)?shù)谋壤M成。研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)酰胺約占總脂質(zhì)的50%，是脂質(zhì)的主要組成成分，在皮膚屏障修復(fù)中起主要作用，若除去神經(jīng)酰胺就能使表皮層屏障功能幾近喪失。阻止水分經(jīng)皮擴散和丟失，這是皮膚最重要的屏障功能之一，TEWL反映的是水從皮膚表面蒸發(fā)量，所以是評價皮膚屏障功能的重要指標(biāo)，TFWL值越高，說明經(jīng)皮膚散失的水分越多，角質(zhì)層的屏障功能也越差。

研究采用膠帶法破壞小鼠皮膚屏障后，導(dǎo)致小鼠皮膚TEWL值上升的同時表皮神經(jīng)酰胺含量下降，表明小鼠皮膚機械屏障功能受損。而六君子湯給藥后，小鼠TEWL值下降，小鼠皮膚機械屏障功能得以恢復(fù)。說明六君子湯能改善小鼠皮膚機械屏障功能，其機制與增加表皮神經(jīng)酰胺含量有關(guān)。