伍世恒，金晶

1.廣東省中醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 廣州 510120；2.中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006

火炭母中黃酮提取工藝的優(yōu)選

伍世恒1，金晶2

1.廣東省中醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 廣州 510120；2.中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006

目的：優(yōu)選火炭母中黃酮的提取工藝。方法：以槲皮素、槲皮苷和總黃酮的得率為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法考察乙醇百分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間和提取次數(shù)4個(gè)影響因素，優(yōu)選火炭母中黃酮的超聲提取工藝。結(jié)果：超聲提取液中黃酮含量高于回流提取液，其最佳的提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)85%，料液比1∶15，提取時(shí)間為30 min，提取次數(shù)3次。結(jié)論：該工藝簡(jiǎn)單可行，成本低廉，安全可靠，為火炭母中黃酮成分工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

火炭母；槲皮素；槲皮苷；總黃酮；超聲提取法；正交設(shè)計(jì)

火炭母為蓼科植物火炭母(Polygonum chinense L.)或粗毛火炭母(Polygonum chinense L.var.hispidum Hook.f)的干燥全草[1]。在廣東地區(qū)應(yīng)用廣泛，具有清熱利濕、涼血解毒、平肝明目、活血舒筋等功效，為嶺南習(xí)用中藥?，F(xiàn)代藥理研究表明，火炭母具有抗炎，抗病毒、減壓及抑制中樞神經(jīng)的作用，治療腸炎有較好的療效[2]?；鹛磕钢饕瘜W(xué)成分為黃酮類(lèi)、鞣質(zhì)類(lèi)、甾醇類(lèi)，其中黃酮類(lèi)是其主要有效成分，主要包括槲皮素及其苷類(lèi)化合物[1]?；鹛磕傅馁Y源豐富，生長(zhǎng)周期短，產(chǎn)量較大，開(kāi)發(fā)為成藥或保健品具有一定的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，而目前尚無(wú)火炭母的提取工藝的文獻(xiàn)報(bào)道。超聲波提取技術(shù)是利用超聲波所產(chǎn)生的強(qiáng)烈機(jī)械振動(dòng)及空化效應(yīng)等作用，從而達(dá)到縮短提取時(shí)間，提高提取效率的目的。與傳統(tǒng)方法相比，超聲提取法溶劑用量較少，提取時(shí)間較短，并且有效物質(zhì)不被破壞[3]。本實(shí)驗(yàn)采用正交試驗(yàn)對(duì)其主要的影響因素進(jìn)行考察，多指標(biāo)評(píng)價(jià)火炭母中黃酮的超聲提取工藝，為其工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1．1 儀器 Agilent-1100高效液相色譜儀(DAD檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器、在線脫氣、四元泵)(美國(guó)安捷倫科技有限公司)、KQ-300VDB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)、BS210S型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

1．2 材料 槲皮素(批號(hào)：111893-200905)、槲皮苷(批號(hào)：110139-200903)、蘆丁(批號(hào)：100080-200906)等對(duì)照品均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所，火炭母(批號(hào)：201206232)藥材由康美藥業(yè)股份有限公司提供，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室鑒定為蓼科植物火炭母Polygonum chinense L.的干燥全草；乙腈、甲醇(美國(guó)Burdick﹠Jackson公司)為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取工藝的設(shè)計(jì) 超聲提取工藝：實(shí)驗(yàn)采用正交試驗(yàn)對(duì)火炭母中黃酮提取工藝中4個(gè)因素：乙醇百分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)進(jìn)行考察，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平。稱取干燥火炭母藥材粉末(過(guò)3號(hào)篩)10 g，加入到500 mL具塞的錐形瓶中，按照L9(34)正交表(表1)的試驗(yàn)順序進(jìn)行操作，超聲處理的功率為250 W，頻率為40 kHz，提取溫度為35℃。采用綜合加權(quán)評(píng)分法，以槲皮素、槲皮苷和總黃酮的含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，各指標(biāo)進(jìn)行“隸屬度”的計(jì)算，其指標(biāo)隸屬度= (測(cè)定值－最小測(cè)定值)／(最大測(cè)定值－最小測(cè)定值)，0≤指標(biāo)隸屬度≤1。其具體的權(quán)重為：總黃酮得率占50%，槲皮素得率占25%，槲皮苷得率占25%。綜合評(píng)分=總黃酮得率隸屬度×50%＋槲皮苷得率隸屬度×25%＋槲皮素得率隸屬度× 25%，滿分為1.00?；亓魈崛」に嚕壕芊Q定火炭母藥材粉末(過(guò)3號(hào)篩)10 g，置于500 mL回流裝置中，加入95%乙醇200 mL水浴回流2 h，濾過(guò)，濾渣再加入95%乙醇100 mL加熱回流1 h，濾過(guò)，合并2次濾液，95%乙醇定容至500 mL，搖勻，即得供試品溶液。

表1 L9(34)正交表

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 總黃酮的含量測(cè)定[4]

2.2.1.1 供試品溶液的制備 按照2.1項(xiàng)方法進(jìn)行提取，得到提取液，濾過(guò)，用少量95%乙醇洗滌濾渣，合并濾液，95%乙醇定容至500 mL，搖勻，即得供試品溶液。

2.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定 精密稱定蘆丁對(duì)照品5.44 mg，置25 mL量瓶中，加95%乙醇至刻度，搖勻，即得0.2176 mg/mL的對(duì)照品溶液。取對(duì)照品溶液0、1、2、4、6、8 mL分別置25 mL容量瓶中，加95%乙醇至8 mL，再加入1 mL亞硝酸鈉溶液(50 g/L)，搖勻，放置5 min，加入1 mL硝酸鋁溶液(100 g/L)，搖勻，放置6 min，加入10 mL氫氧化鈉溶液(40 g/L)用蒸餾水定容至刻度，搖勻，放置15 min顯色，以0管為空白，在500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度A為縱坐標(biāo)、濃度C(mg/mL)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A=13.65C－0.0045(r=0.999 9)，對(duì)照品溶液在0.008704～0.069632 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.1.3 精密度的考察 精密移取蘆丁對(duì)照品1 mL，平行操作5次，按照2.2.1.2項(xiàng)下自“置25 mL容量瓶中”起進(jìn)行操作，測(cè)定其吸光度A，計(jì)算器RSD%(n=5)值。結(jié)果RSD%= 0.12%。

2.2.1.4 含量測(cè)定 按照2.2.1.1項(xiàng)供試品制備方法進(jìn)行提取，每份精密吸取2.0 mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線下步驟進(jìn)行操作，測(cè)定其吸收度，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.2 槲皮素與槲皮苷含量測(cè)定[5]

2.2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Extend C18(250 mm × 4.6 mm 5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-0.2%磷酸水溶液(38︰10︰52)；流速：1.0 mL/min；柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣量為10 μL。

2.2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取槲皮苷和槲皮素對(duì)照品適量，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得0.045 mg/mL槲皮苷和0.032 mg/mL槲皮苷的對(duì)照品混合溶液，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.2.2.3 供試品溶液制備 按照2.1項(xiàng)方法進(jìn)行提取，得到提取液，濾過(guò)，用少量95%乙醇洗滌濾渣，合并濾液，95%乙醇定容至500 mL，搖勻，精密移取該溶液10 mL，水浴揮干，殘?jiān)眉状既芙獠⒍ㄈ葜? mL，搖勻，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液1、5、10、15、20 μL，按照2.2.2.1項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定槲皮苷和槲皮素的峰面積，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到槲皮苷和槲皮素回歸方程分別為：Y=2710.17X-4.2126(R2=0.9996)和Y=3981.36X-1.4632(R2= 0.9997)；線性范圍分別為：0.045～0.9 μg和0.032～0.64 μg。2.2.2.5 含量測(cè)定 按照上述2.2.2項(xiàng)下的含量測(cè)定方法，測(cè)定火炭母不同提取液樣品中槲皮苷和槲皮素的含量。結(jié)果見(jiàn)表2、圖1。

結(jié)果表明，影響火炭母中黃酮提取工藝程度依次為：D(提取次數(shù))＞C(提取時(shí)間)＞B(料液比)＞A(乙醇百分?jǐn)?shù))，方差分析結(jié)果表明，D因素對(duì)火炭母提取工藝有明顯的影響(P＜0.05)，因素A、B、C均沒(méi)有明顯的差異，為了節(jié)省溶劑，經(jīng)綜合考慮，得出最佳的提取工藝為：A2B2C3D3：即乙醇體積分?jǐn)?shù)85%，料液比1︰15，提取時(shí)間為30 min，提取3次。

2.3 工藝驗(yàn)證與比較 見(jiàn)表3。采用上述含量測(cè)定方法測(cè)定火炭母最佳提取液和回流提取液中3種成分含量。表3結(jié)果表明，超聲提取液中總黃酮、槲皮苷和槲皮素等3種成分含量均高于回流提取液，說(shuō)明該工藝具有一定科學(xué)性，驗(yàn)證結(jié)果也表明，該工藝具有一定的穩(wěn)定性。

表2 火炭母提取工藝的正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1 火炭母提取工藝含量測(cè)定HPLC圖

表3 火炭母最佳提取工藝驗(yàn)證與比較的結(jié)果

3 討論

文獻(xiàn)報(bào)道表明，總黃酮、槲皮素和槲皮苷常作為其質(zhì)量控制的指標(biāo)。目前，同時(shí)測(cè)定火炭母中槲皮素和槲皮苷的高效液相含量測(cè)定方法尚未見(jiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)對(duì)色譜柱、流動(dòng)相、檢測(cè)波長(zhǎng)、流速等色譜條件進(jìn)行考察與優(yōu)化，建立了火炭母槲皮苷和槲皮素高效液相含量測(cè)方法，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立與提高提供一定方法學(xué)依據(jù)。

研究表明，溫度對(duì)超聲提取工藝具有一定的影響，合適的提取溫度能提高黃酮類(lèi)成分的溶解率，但不宜過(guò)高，避免提取溶劑揮發(fā)。實(shí)驗(yàn)對(duì)提取溫度進(jìn)行了單因素考察，比較25℃、30℃、35℃、40℃等4個(gè)溫度的黃酮提取率，結(jié)果表明，隨著溫度提高，黃酮類(lèi)成分的提取率逐漸升高，35℃與40℃提取率差別不大，因此選擇35℃進(jìn)行超聲提取。實(shí)驗(yàn)優(yōu)選出火炭母的黃酮超聲提取工藝，該工藝中總黃酮、槲皮素和槲皮苷等3種成分的提取率均高于回流提取工藝，且工藝操作簡(jiǎn)單、省時(shí)、成本低廉，穩(wěn)定性好，應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)將產(chǎn)生一定的經(jīng)濟(jì)效益，為該藥材綜合利用開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：馬力）

R284.2

A

0256-7415（2016）06-0276-03

10.13457/j.cnki.jncm.2016.06.121

2015-12-05

伍世恒（1980-），男，主管藥師，研究方向：醫(yī)院藥學(xué)與藥物制劑。

金晶，E-mail：ilpf99@163.com。