謝宇鋒，陳赟，馮軍，楊宗保，王曙輝，彭志華

1.深圳福田區(qū)中醫(yī)院針灸推拿科，廣東 深圳 518000；2.廈門大學醫(yī)學院，福建 廈門 361005

◆實驗研究◆

御寒暖胃膏穴位貼敷對慢性萎縮性胃炎大鼠胃腸激素的影響

謝宇鋒1，陳赟1，馮軍1，楊宗保2，王曙輝1，彭志華1

1.深圳福田區(qū)中醫(yī)院針灸推拿科，廣東 深圳 518000；2.廈門大學醫(yī)學院，福建 廈門 361005

目的：研究御寒暖胃膏貼敷胃經(jīng)穴對慢性萎縮性胃炎（CAG）大鼠胃腸激素P物質（substance P，SP）、饑餓素（Ghrelin）、膽囊收縮素（CCK）水平的調節(jié)，探討御寒暖胃膏貼敷胃經(jīng)穴對CAG大鼠胃黏膜損傷修復的作用機制。方法：大鼠隨機分為正常組、模型組、御寒暖胃膏貼敷胃經(jīng)穴組、藥物對照組，采用綜合干預方法復制CAG大鼠模型，光鏡下觀察胃黏膜組織的病理變化，采用酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）測定胃黏膜胃腸激素SP、Ghrelin、CKK的水平。結果：與正常組比較，模型組大鼠的胃黏膜組織病理學檢查提示存在腺體的萎縮和一定程度的細胞異型增生，大鼠胃黏膜SP、Ghrelin水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），CCK水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與模型組比較，御寒暖胃膏貼敷胃經(jīng)穴組和藥物對照組大鼠胃黏膜組織的病理損傷得到明顯修復，御寒暖胃膏貼敷組SP、Ghrelin水平較模型組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），CCK水平較模型組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論：御寒暖胃膏貼敷胃經(jīng)穴可以促進CAG大鼠胃黏膜損傷的修復，該作用可能是通過調節(jié)胃黏膜SP、Ghrelin、CKK的水平來實現(xiàn)的。

慢性萎縮性胃炎；穴位貼敷；御寒暖胃膏；胃腸激素；P物質；膽囊收縮素；饑餓素；動物實驗

慢性萎縮性胃炎(CAG)作為胃癌的癌前病變，是慢性胃炎向胃癌發(fā)展的必經(jīng)階段，也是防治胃癌的關鍵節(jié)點。本研究運用中醫(yī)外治法經(jīng)典著作《理瀹駢文》所記載的“御寒暖胃膏”貼敷胃經(jīng)穴足三里、中脘干預CAG患者，能夠較好地改善患者的臨床癥狀，并在一定程度上促進CAG胃黏膜腺體萎縮、細胞型增生的逆轉，為進一步明確御寒暖胃膏貼敷胃經(jīng)穴對CAG的作用，并闡述其可能的作用機制，為臨床開展御寒暖胃膏貼胃經(jīng)穴治療CAG提供科學的實驗依據(jù)，本研究開展了以下實驗，具體介紹如下。

1 材料

1.1 實驗動物 合格SD(Sprague-Dawley Rat)大鼠28只，雄性，清潔級，8周齡，體重200～250 g，購于江西中醫(yī)藥大學實驗動物中心(JZDWNO：2013-1056)。大鼠飼養(yǎng)于墊鋸木屑的飼料籠中，每籠10只，控制室溫22℃，相對濕度50%，采用自然光暗周期，自由飲水，檢疫3周后分組實驗。

1.2 試劑與藥品 御寒暖胃膏，組成：生姜160 g，凡士林48 g，乳香、沒藥各3 g，川椒6 g，所有中藥均購自深圳市福田區(qū)中醫(yī)院中藥房，并于深圳市福田區(qū)中醫(yī)院中藥煎藥房制成膏藥；維酶素片(河北環(huán)海藥業(yè)有限公司，批號：20120214)；N-甲基-N`-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)(日本東京化成株式會社)。

2 方法

2.1 實驗分組 將28只大鼠按體重排序，然后按隨機數(shù)字表法隨機分為4組，每組7只，分別為：正常組、模型組、御寒暖胃膏貼敷胃經(jīng)穴組、藥物對照組。

2.2 藥品制備

2.2.1 御寒暖胃膏的制備 膏藥的組成：生姜800 g，凡士林240 g，乳香、沒藥各15 g，川椒30 g。膏藥的制備方法：①研磨藥粉：將乳香、沒藥、川椒分別研碎成粉末(100目篩)，按份量稱好以備用。②制備姜汁：將生姜榨成汁，并將生姜汁倒入燒懷中，用酒精燈加熱至沸騰。③溶化藥物：首先加熱融化凡士林，然后加入乳香、沒藥，并不斷用玻棒攪拌至乳香、沒藥融化為止，然后與煮沸后的姜汁混勻，再加熱至滴水不化。④冷卻撒藥：熄火待膏藥溫度降至60℃時，將備好的藥粉往膏中撒布并繼續(xù)攪拌，冷卻備用。

2.2.2 維酶素灌胃液的制備 將維酶素藥片整片放入玻璃研磨皿中研磨成粉，按比例加入純凈水，將藥物配成21.6 mg/mL的溶液(人的維酶素給藥劑量是2.4 g/天，人與大鼠的換算系數(shù)0.018，則大鼠的劑量為216 mg/kg，根據(jù)大鼠體重換算灌胃量)，然后按照大鼠的體重，按1 mL/100 g的用量予以灌胃，每天1次。

2.2.3 MNNG溶液的制備 MNNG溶液每周先用純凈水配成1 g/L濃度的儲存液，避光4℃保存，用時將其配成150 μg/mL的飲用液，并置于光屏蔽瓶中讓大鼠自由飲用。

2.2.4 2%水楊酸鈉溶液的制備 使用天秤稱取水楊酸鈉和純凈水，按1∶48的比例配成2%的水楊酸鈉溶液，以備造模使用。

2.2.5 30%乙醇溶液的制備 使用天秤稱取無水乙醇和純凈水，按3∶7的比例配成30%的乙醇溶液，以備造模使用。

2.3 模型復制方法 按照嚴茂祥[2]報道的綜合造模方法，將SD大鼠分組后，除正常對照組外，其余3組大鼠采取嚴茂祥的綜合方法復制CAG癌前病變動物模型，為期20周。①在飲水中加入MNNG溶液進行造模，讓大鼠自由飲用，正常組自由飲用自來水；②2%水楊酸鈉溶液灌胃：單日1次，按10 mL/kg的劑量給大鼠灌胃，灌胃前后禁食禁水1 h；③30%酒精溶液灌胃，每2天1次，按10 mL/kg的劑量給大鼠灌胃，灌胃前后禁食禁水1 h；④對造模動物每日均用專用夾子夾尾一次，使其保持激怒、爭斗狀態(tài)，持續(xù)1 h；⑤饑飽失常法：2天足量喂食，1天停食，循環(huán)實施。

2.4 干預方法

2.4.1 正常組 喂飼標準飼料，不予任何處理。

2.4.2 模型組 第21周開始，每天捆綁1 h，并予膠布貼敷肚子及雙下肢，每只每天按1 mL/100 g的用量經(jīng)口灌服純凈水。

2.4.3 御寒暖胃膏貼敷胃經(jīng)穴 ①選取穴位：胃經(jīng)穴分別選取足三里與梁門。②貼敷方法：從第21周開始，每天將各組大鼠捆縛于鼠板，將膏藥涂于所選部位上，直徑為0.3 cm，厚度為0.2 cm，外用醫(yī)用膠布固定，每天1 h。③每只每天按1 mL/100 g的用量經(jīng)口灌服純凈水。

2.4.4 藥物對照組 維酶素溶液，按21.6 mg/kg的藥量給藥，每天1次，每天捆綁1 h，并予膠布貼敷肚皮及雙下肢。

2.4.5 從第21周開始，各組按照上述方案共干預8周。

2.5 動物處理及標本采集

2.5.1 動物處理 經(jīng)過8周干預結束后，大鼠處理前24 h禁食不禁水，稱量體重后，在超凈工作臺下，按照0.3 mL/100 g的劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉。麻醉后腹部朝上置于鼠板上，用手術刀迅速打開大鼠腹腔，取出胃部。用眼科剪刀沿胃大彎剪開胃并翻轉。用 1%焦碳酸二乙酯(diethy pyrocarbonate，DEPC)處理過的冰、0.9%氯化鈉溶液漂洗胃內容物，采用吸水紙將組織的水分吸干，取全小彎側(上至食管下至十二指腸)的胃組織以備病理切片用；鈍性分離胃竇黏膜，裝在凍存管中，并用液氮冷凍，后儲存于-80℃冰箱內以備用。

2.5.2 病理切片標本采集 從上述備用組織中取1 cm×0.5 cm大小的組織塊，0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈，然后將所取的標本放入10%的甲醛溶液內固定24～48 h，常規(guī)進行石蠟包埋，不同濃度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，切片厚4 μm。

2.5.3 ELISA標本采集 從上述備用組織中剪取胃腺部1 cm×1 cm大小的組織塊，稱重。用眼科剪將所取的組織塊盡量剪碎，用移液管加入0.1 M冰PBS緩沖液(按：組織塊重量：緩沖液體積＝1∶9)。將所獲得的組織混懸液使用勻漿機在冰上以10000 r/min研磨成10%的組織勻漿(勻漿時間10 s/次，間隔30 s，反復3～5次)。將所獲得的勻漿液移入干凈的離心管中，并使用冷凍離心機，以4℃、3000 rpm離心15 min。然后將離管內的上清轉移至新的潔凈EP管中，放入-80℃冰箱備用。

2.6 觀測指標與方法

2.6.1 胃黏膜的病理形態(tài)學 在上4組動物的胃體部切取5 mm×7 mm大小的胃組織，用10%福爾馬林固定液固定1周后，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下觀察。

2.6.2 按照大鼠P物質(SP)、饑餓素(Ghrelin)、膽囊收縮素(CKK)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒使用說明書中的操作步驟進行操作。

3 結果

3.1 各組胃黏膜組織病理學的變化情況 圖1-8光鏡顯示：正常組大鼠各層胃組織結構完整，上皮細胞、腺體大小形狀均勻、排列有序，腺上皮與腺管分界清楚，固有腺及黏膜無擴張淤血，黏膜肌層無增生，未見病理性核分裂象(圖1-2)。模型組可見腺體萎縮和胃黏膜細胞的異型增生，表現(xiàn)為大鼠黏膜層腺管形態(tài)及大小不規(guī)側，存囊狀擴張的腺管，腺管結構紊亂，細胞核大小不等，在高倍鏡下細胞核比例增大、濃染，細胞核呈桿狀或類圓形，排列參差不齊，可見核分裂象(圖3-4)；穴位貼敷組、藥物對照組大鼠胃黏膜生長較模型組有所好轉，其黏膜厚度與皺壁有所恢復，黏膜未見明顯水腫、萎縮、炎癥，腺體排列較整齊，腺體囊狀擴張較少，未見明顯萎縮，高倍鏡下細胞核大小較均勻，排列整齊，未見病理性核分裂象(圖5-8)。

圖1 正常組(×100)

圖2 正常組(×400)

圖3 模型組(×100)

圖4 模型組(×400)

圖5 胃經(jīng)穴組(×100)

圖6 胃經(jīng)穴組(×400)

圖7 藥物對照組(×100)

圖8 藥物對照組(×400)

3.2 各組大鼠胃黏膜SP、Ghrelin水平的比較 見表1。與正常組相比較，模型組的大鼠胃黏膜SP、Ghrelin水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；與模型組比較，御寒暖胃膏貼敷胃經(jīng)穴組的大鼠胃黏膜SP、Ghrelin水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；與藥物對照組比較，御寒暖胃貼敷胃經(jīng)穴組的大鼠胃黏膜SP、Ghrelin水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

3.3 各組大鼠胃黏膜CCK水平比較 見表2。與正常組相比，模型組大鼠胃黏膜CCK水平增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；與模型組比較，御寒暖胃膏貼敷胃經(jīng)穴組大鼠胃黏膜CCK降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

表1 各組大鼠胃黏膜SP、Ghrelin水平的比較(±s)

表1 各組大鼠胃黏膜SP、Ghrelin水平的比較(±s)

SP、Ghrelin各組經(jīng)方差分析示：FSP=36.91，F(xiàn)Ghrelin=30.25，均P=0.000＜0.05；與正常組比較，①P=0.000＜0.05；與模型組比較，②P=0.000＜0.05；與御寒暖胃膏貼敷胃經(jīng)穴組比較，③P=0.000＜0.05

組別正常組模型組御寒暖胃膏貼敷胃經(jīng)穴組藥物對照組n7777 SP(ng/mL)Ghrelin(ng/L) 164.66±15.882464.46±272.80 106.29±13.65①180.91±15.36②123.92±13.13②③1499.69±245.27①2264.65±157.63②1894.37±196.18②③

4 討論

御寒暖胃膏來源于清代中草藥外治專家吳師機所著的《理瀹駢文》一書，該書大力推崇和發(fā)展膏藥穴位貼敷這一外治法，記載“御寒暖胃膏，主治：胃傷，不思飲食，胸腹脹痛，嘔噦惡心，噫氣吞酸，怠惰嗜臥，并治腰背冷痛。用法：糝花椒貼中脘處，藥物：生姜汁熬牛膠化開，以乳香、沒藥、黃丹收。”結合本方的配伍，不難看出本方具有溫中和胃、活血祛瘀之效，且其所描述的癥狀與CAG的臨床表現(xiàn)極為相似，雖然在中醫(yī)學中并無CAG癌前病變這一病名，《靈樞·經(jīng)脈》載：“足陽明之脈，是動則病，食則嘔，胃脘痛?！北静〔∫蛑饕c飲食不節(jié)、情志失司、素體虛弱、用藥不當?shù)纫蛩赜嘘P。其病機為本虛標實、虛實夾雜，本虛為脾胃虛弱，邪實重在氣滯血瘀，病位在胃，涉及脾、腎、肝；血瘀是本病發(fā)生的重要致病因素；因此，本病的中醫(yī)治療應在溫中健脾、益氣和胃的基礎上佐以活血化瘀。正與本方的攻效甚為相符。因此，本研究團隊進行了大膽嘗試，取得了較為理想的效果，并開展了御寒暖胃膏對CAG大鼠胃腸激素調控的研究，以探索其作用途徑。

表2 各組大鼠胃黏膜CCK水平比較(±s) ng/L

表2 各組大鼠胃黏膜CCK水平比較(±s) ng/L

CCK各組經(jīng)方差分析示：F=36.19，P=0.000＜0.05；與正常組比較，①P=0.000＜0.05；與模型組比較，②P=0.000＜0.05

組別正常組模型組御寒暖胃膏貼敷胃經(jīng)穴組藥物對照組n7777 CCK 380.01±45.92 649.30±57.94①446.36±55.30②484.84±38.19

胃腸激素是指在胃腸道中廣泛存在的多肽類物質，在正常的消化系統(tǒng)中起著重要的調節(jié)作用，同時對腫瘤、免疫及炎癥等的發(fā)生也起著至關重要的調節(jié)作用。常見的胃腸激素包括：胃泌素、生長抑素、P物質、亮氨酸、腦啡肽、胃泌素、胃動素、胃泌素釋放素、膽囊收縮素、生長素等等。由于物理化學因素、胃酸分泌異常和胃黏膜防御能力減弱是導致CAG發(fā)生的主要原因，因此，本研究選取具有代表性的P物質、膽囊收縮素、生長素作為觀察指標。

P物質(substance P，SP)作為第一個被發(fā)現(xiàn)的腦腸肽，胃腸道激素之一，廣泛地分布于腸神經(jīng)系統(tǒng)和整個胃腸道[2]。國內外研究證明，SP是胃腸運動調節(jié)中主要的興奮性神經(jīng)遞質[3～4]，具有強烈興奮胃腸平滑肌收縮，加快胃腸運動，提高胃腸排空率的作用。

CCK作為胃腸激素和神經(jīng)肽，其受體廣泛分布在腦組織、外周組織及胃腸道中，對消化系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)功能的調節(jié)起重要作用，CCK能顯著抑制固體及液體胃排空。CCK可以通過外周途徑和中樞途徑等抑制胃的排空，在對人、狗、鼠、兔、猴等多種哺乳動物實驗研究中發(fā)現(xiàn)，無論生理劑量或藥理劑量的CCK都能抑制進食后的胃排空活動，且濃度與胃的排空率呈反比關系[5～6]。

饑餓素(Ghrelin)最初是由日本學者Kojima M等[7]從人和鼠的胃中分離出來的且是一種主要來源胃的腦腸肽。Ghrelin具有刺激生長激素釋放作用外，還能夠促進食物吸收和胃的排空以及調節(jié)能量消耗等多種生理功能，并且對胃腸道具有保護和促進愈合的作用[8]。

國內外學者的研究顯示，足陽明經(jīng)穴對與胃相關的中樞及外周神經(jīng)電生理、胃運動、胃分泌等均有明顯調整作用[9～10]，以穴位為基礎的干預方法，可以實現(xiàn)對胃腸道激素如SP、CCK、Ghrelin等釋放水平的調節(jié)，從而影響胃腸的動力、胃黏膜的保護屏障，最終實現(xiàn)對胃黏膜損傷修復的調節(jié)，如郭暉研究發(fā)現(xiàn)，針刺足陽明胃經(jīng)穴可以提高胃黏膜損傷大鼠的胃動力，且該作用與增加胃竇的SP含量呈現(xiàn)平行關系[11]。賀鳳娥[12]研究發(fā)現(xiàn)，電針足三里穴可以促進糖尿病胃輕癱大鼠的胃動力，且該作用可能與其調節(jié)胃竇部CCK、Ghrelin的釋放有關。常小榮等[13]研究發(fā)現(xiàn)，電針足三里和陽陵泉穴可促進胃和Oddi括約肌運動，其機制之一可能為針刺影響外周MTL、CCK的釋放，進而調整消化道運動，這種經(jīng)穴對相應臟腑的調整作用具有相對特異性。在本課題組的早期研究也證實，與非經(jīng)非穴點相比，御寒暖胃膏貼敷于胃經(jīng)之足三里和中脘對CAG大鼠胃黏膜損傷的修復作用、血流量等的影響差異均有統(tǒng)計學意義[14]。

本研究發(fā)現(xiàn)：在CAG大鼠的胃黏膜組織病理學檢查提示存在細胞異型增生，大鼠胃黏膜SP、Ghrelin水平降低，CCK水平升高，由此可見，以胃黏膜損傷為基礎，以腺體萎縮、胃黏膜細胞異型增生的CAG癌前病變，可能與長時間、多因素的理化因素作用、刺激，導致胃黏膜損傷并破壞其保護屏障，并從外周及中樞等多個途徑引起多種腦腸肽的分泌異常，進一步抑制胃黏膜損傷的修復，正如本研究所見，與正常組相比，模型組的SP、Ghrelin水平降低，CCK水平升高，而御寒暖胃膏貼敷組和口服維酶素片組則SP、Ghrelin水平較模型組升高，CCK水平較模型組降低，由此可見，御寒暖胃膏穴位貼敷促進CAG大鼠胃黏膜異型增生的逆轉可能其通過藥物的作用激發(fā)經(jīng)氣，啟動腦腸肽的調節(jié)，恢復正常的胃腸道激素水平，從而并調整胃腑的運動功能，該作用可能與其下調CCK水平、上調SP、Ghrelin水平有關。

綜上所述，御寒暖胃膏貼敷胃經(jīng)穴對CAG癌前病變的干預作用及機制明確，該方法值得臨床推廣應用。

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（責任編輯：劉淑婷）

Effect of Warm Stomach Cream Acupiontis Stiking Therapy on Gastrointestinal Hormones of Gastric Precancerous Lesions Mouse

XIE Yufeng，CHEN Yun，F(xiàn)ENG Jun，YANG Zongbao ，WANG Shuhui， PENG Zhihua

Objective：To study the regulating effect of warm stomach cream acupiontis stiking therapy on the level of gastrointestinal hormones，such as substance P(SP)，Ghrelin and cholecystokinin(CCK)，of mice with Chronic Atrophic Gastritis(CAG)，discuss the mechanism of warm stomach cream acupiontis stiking therapy on repairing gastric mucosal lesion of mice with Chronic Atrophic Gastritis(CAG).Methods：Mice were randomly divided into normal group，model group，warm stomach cream acupiontis stiking group，drug control group.Duplicating mice model with Chronic Atrophic Gastritis(CAG)in the way of comprehensive intervention，the pathological change of gastric mucosa tissue under the light microscope was measured and the levels of gastrointestinal hormones，such as SP，Ghrelin and CKK of gastric mucosa were observed in the way of ELISA.Results：Comparing with normal group，mice gastric mucosa histopathological examinations in model group reminded that there exist gland atrophy and some degree of cell atypical hyperplasia.The expression levels of SP and Ghrelin in gastric mucosa were dropped obviously(P＜0.05)，and the levels of CCK were obviously increased(P＜0.05).Comparing with model group，pathological damage of gastric mucosa tissue in warm stomach cream acupiontis stiking group and drug control group was obtained obvious repair.The levels of SP and Ghrelin of mice in warm stomach cream acupiontis stiking group were obviously increased，while the levels of CCK were obviously dropped(P＜0.05 compared with those in model group).Conclusion：The therapy of the warm stomach cream acupiontis stiking can promote the repair of gastric mucosal lesion.This function may be realized by regulating the expression level of gastric mucosal lesion SP，Ghrelin and CKK.

Chronic atrophic gastritis；Acupiontis stiking theropy；Warm stomach cream；Gastrointestinal hormones；P substance(SP)；Cholecystokinin(CCK)；Chrelin；Animal experiment

R285.5

A

0256-7415（2016）06-0267-05

10.13457/j.cnki.jncm.2016.06.118

2015-12-25

深圳市科技研發(fā)資金項目（JCYJ20130401105615482）

謝宇鋒（1983-），男，主治醫(yī)師，研究方向：針灸治療疼痛及脾胃相關病癥。

馮軍，E-mail：szfdzyfj@163.com。