何戰(zhàn)勝　鄒　燕　粟勝梅　雷文波　李忠玉

(南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所/特殊病原體防控湖南省重點實驗室，衡陽421001)

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沙眼衣原體pORF5質(zhì)粒蛋白免疫優(yōu)勢片段的篩選與鑒定①

何戰(zhàn)勝鄒燕②粟勝梅雷文波李忠玉

(南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所/特殊病原體防控湖南省重點實驗室，衡陽421001)

[摘要]目的：鑒定沙眼衣原體pORF5質(zhì)粒蛋白的免疫原性，并進(jìn)一步篩選和確定pORF5質(zhì)粒蛋白免疫優(yōu)勢片段。方法：以沙眼衣原體D血清型DNA為模板，設(shè)計pORF5基因全長和9個不同片段特異引物進(jìn)行PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHⅠ、NotⅠ雙酶切后插入經(jīng)同樣雙酶切的原核表達(dá)載體pGEX-6p中，構(gòu)建pORF5質(zhì)粒蛋白不同長度片段的原核表達(dá)重組體，重組體經(jīng)PCR和測序鑒定后，轉(zhuǎn)化XL1 Blue大腸桿菌表達(dá)10種不同長度的GST融合蛋白；ELISA方法檢測pORF5質(zhì)粒蛋白的免疫原性，Western blot 鑒定pORF5質(zhì)粒蛋白的免疫反應(yīng)性；ELISA測定10個不同片段與沙眼衣原體生殖道感染患者血清、鼠免疫血清以及抗pORF5單克隆抗體的免疫反應(yīng)性，鑒定pORF5質(zhì)粒蛋白免疫優(yōu)勢片段。結(jié)果：pORF5質(zhì)粒蛋白免疫原性強，能刺激機體產(chǎn)生高效價抗體；破壞pORF5質(zhì)粒蛋白天然空間結(jié)構(gòu)，其免疫反應(yīng)性基本消失；在ELISA反應(yīng)中，N端缺失66氨基酸的F6片段的免疫反應(yīng)強度與pORF5全長基本相似，F(xiàn)2與F3出現(xiàn)較弱的免疫反應(yīng)，其余片段免疫反應(yīng)消失。結(jié)論：pORF5質(zhì)粒蛋白為構(gòu)象依賴性免疫優(yōu)勢抗原，其免疫優(yōu)勢表位和構(gòu)象表位位于C端，本研究為進(jìn)一步探討pORF5質(zhì)粒蛋白的生物學(xué)功能和疫苗的研制提供實驗依據(jù)。

沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis，Ct)泌尿生殖道感染是一種嚴(yán)重危害公眾健康的細(xì)菌性感染疾病。自上世紀(jì)九十年代以來，Ct已超過淋球菌而成為泌尿生殖道感染性疾病的主要性病病原體。Ct生殖道感染不僅引起女性盆腔炎、不孕和異位妊娠等，也可引起男性尿道炎、附睪炎、睪丸炎和前列腺炎等[1]，同時Ct還可增加HIV[2,3]及宮頸癌[4-6]的發(fā)病率。由于Ct感染臨床癥狀不明顯，致使該疾病不易被發(fā)現(xiàn)而得不到及時治療，造成Ct在宿主體內(nèi)持續(xù)存在引起嚴(yán)重并發(fā)癥。因此，闡明Ct致病機制，尋找免疫優(yōu)勢抗原研制出有效疫苗，是預(yù)防和控制Ct感染性疾病的關(guān)鍵。

Ct 共有A～L 19個血清型，每個血清型幾乎均存在一種約7.5 kb大小的隱蔽性質(zhì)粒，該質(zhì)粒共有8個開放閱讀框架(Open reading frame，ORF)，編碼8種質(zhì)粒蛋白。在8種質(zhì)粒蛋白中，pORF5是唯一一種分泌性質(zhì)粒蛋白[7]。在自然感染狀態(tài)下，pORF5質(zhì)粒蛋白基因均被激活產(chǎn)生內(nèi)源性靶蛋白。有研究發(fā)現(xiàn)Ct患者血清中存在高滴度的特異性的pORF5抗體，提示pORF5可能為免疫優(yōu)勢抗原[8,9]。為進(jìn)一步鑒定pORF5質(zhì)粒蛋白的免疫原性，篩選和確定pORF5質(zhì)粒蛋白免疫優(yōu)勢片段，本研究采用基因重組技術(shù)構(gòu)建Ct質(zhì)粒蛋白pORF5全長和9個不同長度的原核表達(dá)重組體，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌XL1 Blue，并對表達(dá)的蛋白進(jìn)行免疫原性研究，本研究為Ct基因工程疫苗和免疫診斷試劑的研制提供實驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1主要材料Ct D標(biāo)準(zhǔn)株、XL1-Blue大腸桿菌和pGEX-6p原核表達(dá)載體為本研究所保存；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、NotⅠ、pfxDNA聚合酶、蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)等為Invitrogen公司產(chǎn)品；QuickClean PCR 純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自美國Qiagen公司；Glutathione Sepharose 4B Beads為Phatnacia 公司產(chǎn)品。

1.2pORF5不同片段基因克隆及原表達(dá)重組體的構(gòu)建根據(jù)GenBank提供的Ct pORF5基因序列設(shè)計10對引物(表1)，并在各對引物的5′加上BamH Ⅰ酶、Not Ⅰ酶切位點及保護(hù)堿基。PCR方法擴增pORF5基因全長(FL)和9個不同長度的pORF5基因片段(F1～F9)，PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHⅠ、NotⅠ酶切后，連接至經(jīng)相同酶消化后的pGEX-6p載體中，構(gòu)建pGEX-6p/pORF5-FL、F1～F9原核表達(dá)重組體，重組體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌XL1 Blue，在含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上挑取單個菌落，小量提取質(zhì)粒，PCR篩選和DNA測序鑒定。

表1pORF5基因不同片段引物

Tab.1Primers for different fragments of pORF5 gene

Name(Length)PrimersequencesFL(M1-A264)5'-CGC-G▼GATCC-ATGGGAAATTCTGGTTTTTATTTG-3'5'-TTTTCCTTTT-GC▼GGCCGC-TTAAGCGTTTGTTTGAGGTATTA-3'F1(M1-S66)5'-CGC-G▼GATCC-ATGGGAAATTCTGGTTTTTATTTG-3'5'-TTTTCCTTTT-GC▼GGCCGC-TTAAGAAGCATTGGTTGATGAATT-3'F2(M1-N132)5'-CGC-G▼GATCC-ATGGGAAATTCTGGTTTTTATTTG-3'5'-TTTTCCTTTT-GC▼GGCCGC-TTAGTTGCATTGAATTTTATTAGTG-3'F3(M1-S198)5'-CGC-G▼GATCC-ATGGGAAATTCTGGTTTTTATTTG-3'5'-TTTTCCTTTT-GC▼GGCCGC-TTATGAGTATCCATAACTAATCG-3'F4(I67-N132)5'-CGC-G▼GATCC-ATTACAATTGGTTTGGTAGCGG-3'5'-TTTTCCTTTT-GC▼GGCCGC-TTAGTTGCATTGATTTTATTAGTG-3'F5(I67-S198)5'-CGC-G▼GATCC-ATTACAATTGGTTTGGTAGCGG-3'5'-TTTTCCTTTT-GC▼GGCCGC-TTATGAGTATCCATAACTAATCG-3'F6(I67-A264)5'-CGC-G▼GATCC-ATTACAATTGGTTTGGTAGCGG-3'5'-TTTTCCTTTT-GC▼GGCCGC-TTAAGCGTTTGTTTGAGGTATTA-3'F7(G133-S198)5'-CGC-G▼GATCC-GGGTTATTCACTCCCAGTAAC-3'5'-TTTTCCTTTT-GC▼GGCCGC-TTATGAGTATCCATAACTAATCG-3'F8(G133-A264)5'-CGC-G▼GATCC-GGGTTATTCACTCCCAGTAAC-3'5'-TTTTCCTTTT-GC▼GGCCGC-TTAAGCGTTTGTTTGAGGTATTA-3'F9(S199-A264)5'-CGC-G▼GATCC-TCAGGCATTCCTAATTTATGTAG-3'5'-TTTTCCTTTT-GC▼GGCCGC-TTAAGCGTTTGTTTGAGGTATTA-3'

1.3pORF5不同長度融合蛋白的表達(dá)與純化將鑒定后的陽性克隆接種于含100 μg/ml氨芐的LB培養(yǎng)液中，37℃震蕩培養(yǎng)過夜。次日將過夜培養(yǎng)物以1∶100的比例加入含氨芐的LB培養(yǎng)液中，37℃震蕩培養(yǎng)至OD600約為0.8時，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG，30℃誘導(dǎo)3 h后低速離心收集細(xì)菌，超聲破菌后高速離心收集上清，上清經(jīng)Glutathione Sepharose 4B Beads純化得到pORF5不同長度的融合蛋白(FL、F1～F9)，純化的融合蛋白經(jīng)12% SDS-PAGE電泳分析，觀察其表達(dá)情況和純化效果。

1.4pORF5免疫原性分析將pORF5、CPAF(衣原體蛋白酶樣活性因子)、HSP60(熱休克蛋白60)、MOMP(主要外膜蛋白)融合蛋白進(jìn)行1∶10稀釋后加入谷胱苷肽包被的酶標(biāo)板，同時設(shè)置GST和空白對照孔，4℃過夜后，0.05%PBST洗滌酶標(biāo)板以除去未吸附的游離的蛋白抗原；加入2.5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，再加入經(jīng)含GST的大腸桿菌裂解液吸附后的Ct泌尿生殖道感染患者血清，室溫靜置2 h，PBST洗滌后加入1∶2 000稀釋的HRP標(biāo)記的抗人二抗，室溫2 h；最后加入ABTS顯色劑，室溫避光反應(yīng)5～10 min后，2 mmol/L H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀讀取450nm波長的A值，當(dāng)(實驗組A450值-空白組A450值)/(對照組A450值-空白組A450值)≥2.1時為陽性。同時以pORF5、CPAF、HSP60融合蛋白為抗原，以不同稀釋的Ct泌尿生殖道感染患者血清為一抗、HRP標(biāo)記的羊抗人IgG為二抗，Western blot 分析pORF5質(zhì)粒蛋白的免疫反應(yīng)性。

1.5pORF5免疫優(yōu)勢片段分析將所制備的pORF5 F1~F9融合蛋白及pORF5蛋白全長作為ELISA反應(yīng)抗原，與酶標(biāo)板已包被的谷胱苷肽4℃結(jié)合過夜，2.5%脫脂牛奶封閉后，分別加入Ct泌尿生殖道感染患者血清、鼠抗GST-pORF5多克隆抗體(pAb)和pORF5 單克隆抗體(mAb)2p和4e6，抗原抗體充分反應(yīng)后，再分別加入HRP標(biāo)記的抗鼠、抗人抗體，最后加入顯色劑，酶標(biāo)儀讀取405nm吸收值，分析pORF5蛋白各個片段的免疫反應(yīng)性。

2結(jié)果

2.1pGEX-6p/pORF5-FL與pGEX-6p/pORF5 F1～F9重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定以Ct D血清型DNA為模版，應(yīng)用10對特異性引物對pORF5不同長度基因片段進(jìn)行擴增，結(jié)果擴增出了特異性目的基因片段，與預(yù)期目的基因片段大小相符(圖1)。pGEX-6p/pORF5-FL及pGEX-6p/pORF5 F1～F9重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和NotⅠ雙酶切后，可切出2個片段，小片段與各目的片段基因大小一致，大片段約4.9 kb，與空質(zhì)粒大小一致(圖2)。重組質(zhì)粒測序結(jié)果顯示各基因片段與GenBank登陸的D型Ct pORF5質(zhì)粒堿基序列完全一致。

2.2pORF5各基因片段融合蛋白的表達(dá)將pORF5全長和9個不同片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli XL1Blue，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)10個融合蛋白，Glutathione Sepharose 4B beads 純化融合蛋白，純化的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒菌在各自相應(yīng)的位置有一明顯蛋白條帶，結(jié)果與預(yù)期各融合蛋白分子量相符(圖3)。

2.3pORF5 免疫原性分析ELISA結(jié)果顯示，pORF5與病人血清出現(xiàn)了強烈的免疫反應(yīng)，病人血清中存在高滴度pORF5抗體，與傳統(tǒng)的衣原體免疫優(yōu)勢抗原比較，pORF5 與CPAF免疫原性基本相似，但略高于MOMP、HSP60抗原(圖4)。在Western blot分析pORF5免疫特性時，發(fā)現(xiàn)病人血清進(jìn)行1∶4 000稀釋后，pORF5出現(xiàn)較弱的反應(yīng)條帶，而CPAF、MOMP和HSP60出現(xiàn)強陽性反應(yīng)條帶，病人血清做1∶20 000稀釋時，pORF5反應(yīng)帶消失，而CPAF、MOMP和HSP60蛋白仍可見明顯的條帶(圖5)。

圖1　Ct pORF5質(zhì)?；虿煌蜳CR擴增產(chǎn)物Fig.1　PCR products of different fragments of pORF5 plasmid gene from Chlamydia trachomatisNote: 1.DNA marker;2.PCR product of pORF5 gene;3.PCR product of pORF5 F1 fragment;4.PCR product of pORF5 F2 fragment；5.PCR product of pORF5 F3 fragment;6.PCR product of pORF5 F4 fragment;7.PCR product of pORF5 F5 fragment;8.PCR product of pORF5 F6 fragment;9.PCR product of pORF5 F7 fragment;10.PCR product of pORF5 F8 fragment;11.PCR product of pORF5 F9 fragment.

圖2　pGEX-6p/pORF5-FL及pGEX-6p/pORF5 F1～F9重組質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.2　Identification of pGEX-6p/pORF5-FL and pGEX-6p/pORF5 F1-F9 recombinant plasmids by double digestionNote: 1.DNA marker;2.pGEX-6p/pORF5-FL recombinant plasmid digested with BamHⅠand NotⅠ;3.pGEX-6p/pORF5-F1 recombinant plasmid digested with BamHⅠand NotⅠ;4.pGEX-6p/pORF5-F2 recombinant plasmid digested with BamHⅠand NotⅠ;5.pGEX-6p/pORF5-F3 recombinant plasmid digested with BamHⅠand NotⅠ;6.pGEX-6p/pORF5-F4 recombinant plasmid digested with BamHⅠand NotⅠ;7.pGEX-6p/pORF5-F5 recombinant plasmid digested with BamHⅠand NotⅠ;8.pGEX-6p/pORF5-F6 recombinant plasmid digested with BamHⅠand NotⅠ;9.pGEX-6p/pORF5-F7 recombinant plasmid digested with BamHⅠand NotⅠ;10.pGEX-6p/pORF5-F8 recombinant plasmid digested with BamHⅠand NotⅠ;11.pGEX-6p/pORF5-F9 recombinant plasmid digested with BamHⅠand NotⅠ.

圖3　純化pORF5不同片段的SDS-PAGE分析Fig.3　SDS-PAGE analysis of purified pORF5 diff-erent fragmentsNote: 1.Protein marker;2.Purified pORF5 full length;3.Purified pORF5 F1;4.Purified pORF5 F2;5.Purified pORF5 F3;6.Purified pORF5 F4;7.Purified pORF5 F5;8.Purified pORF5 F6;9.Purified pORF5 F7;10.Purified pORF5 F8;11.Purified pORF5 F9.

2.4pORF5質(zhì)粒蛋白免疫優(yōu)勢片段分析為篩選pORF5質(zhì)粒蛋白免疫優(yōu)勢片段，將pORF5 9個不同片段分別與Ct生殖道感染患者血清、鼠抗pORF5 pAb、pORF5 mAb (2p和4e6)進(jìn)行ELISA分析，結(jié)果顯示：不同pORF5片段與血清反應(yīng)強度不一，相同的片段在不同的血清中反應(yīng)強度也不盡相同；N端缺失66氨基酸的F6片段在Ct感染患者血清ELISA反應(yīng)中最為強烈，與pORF5全長反應(yīng)強度基本相似，其次是F2、F3片段，F(xiàn)4、F7、F9反應(yīng)性最弱；來源于GST-pORF5免疫小鼠產(chǎn)生的抗體能強烈識別F6及全長，但也能識別其他各個片段。pORF5 mAb 2p和4e6 ELISA反應(yīng)模式相同，只識別F6及全長(圖6)。

圖4　ELISA 方法分析pORF5質(zhì)粒蛋白免疫原性Fig.4　Immunogenic analysis of pORF5 plasmid protein by ELISA method

圖6　pORF5質(zhì)粒蛋白免疫優(yōu)勢片段分析Fig.6　Analysis of immunodominant fragment of pORF5 plasmid protein

圖5　Western blot 分析pORF5質(zhì)粒蛋白免疫原性Fig.5　Immunogenic analysis of pORF5 plasmid protein by Western blot

3討論

Ct除含有約1 Mb的基因組外，各血清型中亦存在一種隱蔽性質(zhì)粒，質(zhì)粒不是衣原體生存所必需的，但質(zhì)粒缺失后，衣原體毒力高度降低，不能上行引起生殖道的病變[10-12]，提示質(zhì)粒與衣原體毒力密切相關(guān)。在質(zhì)粒編碼的8種質(zhì)粒蛋白中，pORF5是唯一一種分布于宿主細(xì)胞胞漿的分泌性質(zhì)粒蛋白，該蛋白在Ct感染12 h后可在感染細(xì)胞胞漿中檢測其表達(dá)，隨著時間的延長，表達(dá)量逐漸增加，直至維持到整個細(xì)胞發(fā)育周期[7]。已有研究證實pORF5可通過誘生炎癥因子、拮抗LL37抗菌肽活性等多種機制參與衣原體的致病過程[13-17]。

pORF5質(zhì)粒蛋白由264氨基酸編碼，生物信息學(xué)分析該蛋白缺乏信號肽序列，具有多個親水性區(qū)域，提示可能存在多個抗原表位。Donati等研究發(fā)現(xiàn)衣原體感染的患者血清中存在高滴度的特異性抗體[8,9]，為探討pORF5質(zhì)粒蛋白的免疫原性，本研究采用基因重組技術(shù)構(gòu)建Ct質(zhì)粒蛋白pORF5原核表達(dá)重組體，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌XL1 Blue，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)以及Glutathione Sepharose 4B Beads純化后制備了pORF5融合蛋白。采用ELISA方法檢測Ct泌尿生殖道感染患者血清中抗體的滴度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pORF5抗原與患者血清出現(xiàn)強烈的陽性免疫反應(yīng)，其免疫反應(yīng)要高于經(jīng)典的Ct免疫優(yōu)勢抗原MOMP、HSP60，與CPAF基本相似； pORF5不僅與全部患者血清發(fā)生反應(yīng)，而且刺激機體產(chǎn)生抗體的效價最高，提示pORF5可作為一種新的衣原體免疫診斷試劑，有望應(yīng)用于Ct感染的實驗室診斷，同時pORF5亦作為一種新的免疫優(yōu)勢抗原，可為衣原體疫苗的研制提供一個新的潛在靶抗原。

雖然pORF5 與患者的血清在ELISA反應(yīng)中出現(xiàn)了強烈的免疫反應(yīng)，但是當(dāng)用相同的抗原與抗體進(jìn)行Western blot 分析時，卻顯示出較弱的免疫反應(yīng)，其反應(yīng)強度遠(yuǎn)低于MOMP、HSP60和CPAF，其原因可能是在進(jìn)行Western blot 分析時，抗原需要經(jīng)過加熱及SDS作用，破壞了pORF5的天然空間構(gòu)象，而蛋白質(zhì)的一級、二級、三級和四級結(jié)構(gòu)決定了它的物理、化學(xué)、生物化學(xué)、物理化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)，空間構(gòu)象改變，影響抗原與抗體的結(jié)合。提示pORF5存在構(gòu)象依賴性表位，pORF5是一種構(gòu)象依賴性免疫優(yōu)勢抗原。

為進(jìn)一步篩選和確定pORF5抗原免疫優(yōu)勢片段，我們將pORF5抗原分成9個片段，在pORF5 9個片段與Ct生殖道感染患者血清、pORF5多克隆抗體、pORF5單克隆抗體的反應(yīng)中，發(fā)現(xiàn)不同pORF5片段與血清反應(yīng)強度不一，相同的片段在不同的血清中反應(yīng)強度也不盡相同；N端缺失66氨基酸的F6片段在Ct感染患者血清ELISA反應(yīng)中最為強烈，與pORF5全長反應(yīng)強度基本相似，其次是F2、F3片段，F(xiàn)4、F7、F9反應(yīng)性最弱；來源于GST-pORF5免疫小鼠產(chǎn)生的抗體能強烈識別F6及全長，但也能識別其他各個片段，提示pORF5 9個片段都具有免疫原性。但當(dāng)去除F6蛋白N端或C端66個氨基酸時，其免疫反應(yīng)性大大的減弱，說明了pORF5 抗原優(yōu)勢表位主要位于C端。

本實驗證實pORF5質(zhì)粒蛋白為Ct免疫優(yōu)勢抗原，在自然感染狀態(tài)下，pORF5質(zhì)粒蛋白可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生高滴度抗體，具有強烈的免疫原性，其免疫優(yōu)勢表位位于C端；同時pORF5質(zhì)粒蛋白具有強烈的免疫反應(yīng)性，pORF5質(zhì)粒蛋白對抗體的識別呈高度的構(gòu)像依賴性，證實pORF5質(zhì)粒蛋白是一種構(gòu)象依賴性免疫優(yōu)勢抗原。本研究為進(jìn)一步闡明Ct pORF5質(zhì)粒蛋白的功能，Ct基因工程疫苗和免疫診斷試劑的研制提供實驗依據(jù)。

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[收稿2015-07-10修回2015-08-17]

(編輯張曉舟)

[關(guān)鍵詞]沙眼衣原體；pORF5質(zhì)粒蛋白；免疫原性；免疫優(yōu)勢表位

Screen and identification of immunodominant fragment of pORF5 plasmid protein from Chlamydia trachomatis

HEZhan-Sheng,ZOUYan,SUSheng-Mei,LEIWen-Bo,LIZhong-Yu.PathogenicBiologyInstitute,SchoolofMedicine,UniversityofSouthChina/HunanProvincialKeyLaboratoryforSpecialPathogensPreventionandControl,Hengyang421001,China

[Abstract]Objective:To investigate the immunogenicity of pORF5 plasmid protein,and further to screen and identify its immunodominant domian.Methods: 10 different fragments of pORF5 gene including full length were amplified from the DNA of Chlamydia trachomatis serovar D by PCR and cloned into appropriate site of pGEX-6p vector to construct recombinant vectors after digested with BamHⅠ and NotⅠ restriction endonucleases.After identification by PCR and sequencing,the recombinant plasmids were transformed into XL1 Blue E.coli to express the GST fusion proteins.ELISA and Western blot were carried out to identify the immunogenicity and immunoreaction of pORF5 plasmid protein.10 different fragments were reacted with sera from patients urogenitally infected with Chlamydia trachomatis,mouse polyclonal antibodies and mouse monoclonal antibodies of pORF5 plasmid protein with ELISA method.Results: pORF5 plasmid protein displayed strong immunogenicity and could induce a strong antibody response in human.The reactivity of human antibodies almost completely disappeared,when the native structure of pORF5 plasmid protein was destroyed.F6 that only lacked the N-terminal 66 amino acids was recognized by antibodies in ELISA as strongly as the whole pORF5 plasmid protein was.However,no other fragments were significantly recognized although there was a minimal reactivity of F2 and F3 with antibodies.Conclusion: pORF5 plasmid protein was an immunodominant antigen containing conformation-dependent epitope,and the C-terminal three quarters of pORF5 amino acid sequence was required for maintaining its immune dominance and conformation.The significance of the above findings lay a foundation for the further study on pORF5 protein function and vaccine development.

[Key words]Chlamydia trachomatis；pORF5 plasmid protein；Immunogenicity；Immunodominant epitope

通訊作者及指導(dǎo)教師：李忠玉(1972年-)，女，教授，主要從事衣原體致病機制與防治研究，E-mail:lzhy1023@hotmail.com。

作者簡介：何戰(zhàn)勝(1971年-)，女，主要從事病原體致病機制研究，E-mail:2241332533@qq.com。

中圖分類號R374+1
①本文為國家自然科學(xué)基金(No.81102230、No.31470277)、湖南省高校創(chuàng)新平臺開放基金(13K081)、湖南省重點研發(fā)計劃(2015JC3087)、湖南省高層次衛(wèi)生人才“225”工程培養(yǎng)項目(2013-13)、湖南省普通高校帶頭人培養(yǎng)項目(2014-186)、特殊病原體防控湖南省重點實驗室(2014-5)和湖南省高等學(xué)?！胺肿影袠?biāo)新藥研究”協(xié)同創(chuàng)新中心(2014-405)資助項目。
②共同第一作者。

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000-484X(2016)01-0059-06

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.01.013

·免疫學(xué)技術(shù)與方法·