葉 璐，母 丹，付 波，王 敏，楊 莉，鄧洪新

（1.核工業(yè)416醫(yī)院腫瘤科，成都610051；2.四川大學(xué)華西醫(yī)院生物治療國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/2011計(jì)劃“生物治療協(xié)同創(chuàng)新中心”，成都610041）

·應(yīng)用基礎(chǔ)研究·

人肺腺癌SPC-A1荷瘤裸鼠中RNAi靶向沉默F(xiàn)AK的作用*

葉 璐1，母 丹1，付 波1，王 敏1，楊 莉1，鄧洪新2△

（1.核工業(yè)416醫(yī)院腫瘤科，成都610051；2.四川大學(xué)華西醫(yī)院生物治療國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/2011計(jì)劃“生物治療協(xié)同創(chuàng)新中心”，成都610041）

目的：通過用脂質(zhì)體包裹靶向局部粘著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）基因的短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）質(zhì)粒（shRNA-FAK），探討該方法對荷瘤裸鼠中人肺腺癌SPC-A1的抑制效果。方法：用脂質(zhì)體包裹shRNA-FAK，并通過尾靜脈注射治療荷瘤裸鼠，通過腫瘤生長曲線和重量，腫瘤組織形態(tài)學(xué)，腫瘤中的FAK蛋白表達(dá)情況、CD31、VEGF、PCNA和TUNEL檢測，分析該方法對荷瘤裸鼠中人肺腺癌SPC-A1的抑制效果。結(jié)果：荷瘤裸鼠經(jīng)過脂質(zhì)體shRNA-FAK治療后，腫瘤生長速度明顯緩于對照組（P＜0.05），腫瘤重量明顯低于對照組（P＜0.05）。腫瘤組織的免疫組化、western blot和TUNEL檢測顯示與對照組相比，治療組FAK蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）、血管生成和細(xì)胞增殖均減少（P＜0.05）、凋亡細(xì)胞增加（P＜0.05），荷瘤裸鼠主要臟器形態(tài)學(xué)正常。結(jié)論：FAK特異性的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）能夠在體內(nèi)阻斷FAK蛋白的表達(dá)，使組織內(nèi)FAK蛋白的表達(dá)相應(yīng)地減少，并進(jìn)一步誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，最終導(dǎo)致腫瘤的生長速度減緩。

RNA干擾；局部粘著斑激酶；凋亡；SPC-A1

肺癌目前仍是全球惡性腫瘤發(fā)病率和病死率第一的腫瘤［1］。其中，非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占87.05%［2］，約80%NSCLC患者被確診時為晚期，目前以化療為主的治療方案中位生存期不超過1年，多種化療方案并未提高療效［3］。腫瘤細(xì)胞的侵襲生長必須黏附于細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)而影響細(xì)胞的黏附、運(yùn)動與遷移。局部粘著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是依賴于蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase，PTK）活性的細(xì)胞外基質(zhì)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中最為重要的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一［4］。因此在理論上使FAK低表達(dá)或不表達(dá)就有可能干擾細(xì)胞外基質(zhì)對侵襲性生長的調(diào)控，進(jìn)而達(dá)到抑制腫瘤生長的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

shRNA表達(dá)載體購自pGenesil（武漢GeneSil生物技術(shù)有限公司）。ShRNA-FAK根據(jù)已公布的FAK siRNA序列［5］設(shè)計(jì)目標(biāo)mRNA序列5′-AACCACCTGGGCCAGTATTAT-3′（圖1），ShRNA-HK序列是一個與任何人類和小鼠基因沒有同源性的序列（5′-GACTTCATAAGGCG CATGC-3′），用于對照。大腸桿菌（Amersham Pharmacia Biothech）。SPC-A1細(xì)胞株［ATCC（American Type Culture Collection）］。裸鼠（BALB/cA-nu）：4～6周齡，18只（中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動物中心）。用于體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)的DOTAP-Chol陽離子脂質(zhì)體的制備參考文獻(xiàn)［6］并略有改動。將陽離子脂質(zhì)成份DOTAP與中性成分膽固醇（Chol）按1∶1的摩爾比進(jìn)行混合，并將混合物用HPLC級的氯仿進(jìn)行溶解，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上40℃下旋蒸1小時后成膜，真空干燥過夜。利用超聲將所形成的膜打碎，然后高壓均質(zhì)，將樣品取出后溶解于5%的葡萄糖溶液中，然后在55℃水浴條件下震蕩1小時，將混合物轉(zhuǎn)到試管中，并通過220nm聚碳酸酯膜擠壓5～6次，最后將混合物溶解在適量的5%的葡萄糖溶液中，得到濃度為5mg/ml的DOTAP-Chol陽離子脂質(zhì)體混懸液，儲藏在4℃?zhèn)溆?。質(zhì)粒小量快速提取試制盒［道普生物科技（北京）有限公司］。無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒EndoFree plasmid Giga Kit（Qiagen）。細(xì)胞凋亡檢測試劑盒DeadEnd Fluorometric TUNEL System（Promega公司）。蛋白質(zhì)定量試劑（BIO-RAD）。DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。Western blotting化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（PIERCE公司）。蛋白酶抑制劑cocktail（Sigma）。兔抗人FAK單克隆抗體IgG2b（Sigma）。小鼠抗人GAPDH單克隆抗體（Sigma）。辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（H+L）（北京中山生物公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)主要方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及荷瘤模型的建立 人肺腺癌SPC-A1細(xì)胞株使用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，收集對數(shù)生長期的SPC-A1細(xì)胞，用無血清、無抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌、計(jì)數(shù)。無菌條件下將2×106個細(xì)胞皮下接種于小鼠肋腹側(cè)。待腫瘤體積達(dá)70～100 mm3時，將小鼠隨機(jī)分為3組（6只/組）進(jìn)行治療。葡萄糖組（GS組）：每只小鼠尾靜脈注射（5%葡萄糖溶液100μL/次），每周3次，共10次。脂質(zhì)體空載質(zhì)粒組（HK組）：每只小鼠尾靜脈注射100μL/次：5μg空載質(zhì)粒，脂質(zhì)體15μg溶于5%葡萄糖溶液中并充分混勻，總體系100μL，給藥時間同上。脂質(zhì)體shRNA-FAK組（shRNA-FAK組）：每只小鼠尾靜脈注射100μL/次：5μg質(zhì)粒，脂質(zhì)體15μg溶于5%葡萄糖溶液中并充分混勻，總體系100μL，給藥時間同上。從開始治療起每3天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（L）和短徑（D），計(jì)算腫瘤體積：腫瘤體積V（mm3）＝0.52×L ×D2。治療結(jié)束后第3天，處死裸鼠。取小鼠的心、肝、脾、腎固定于福爾馬林溶液中，取各組小鼠的腫瘤組織進(jìn)行稱重。并計(jì)算抑瘤率，抑瘤率＝（對照組平均瘤重－實(shí)驗(yàn)組平均瘤重）/對照組平均瘤重×100%。

圖1 質(zhì)粒pGenesil-shRNA質(zhì)粒圖譜Figure 1 Plasmid pGenesil-shRNA plasmid map

1.2.2 腫瘤組織及裸鼠主要臟器形態(tài)學(xué)觀察 腫瘤組織及裸鼠心、肝、脾、腎用10%的中性福爾馬林固定，石蠟包埋、切片機(jī)切片，厚度為3～5μm。Mayer氏蘇木素及伊紅染色，中性樹膠封片，顯微鏡（×200）下觀察并照相。

1.2.3 Western-blot 提取總蛋白進(jìn)行FAK蛋白表達(dá)情況的檢測。組織在液氮中加入蛋白酶抑制劑cocktail 10μg/mL，RIPA裂解液（1mL per 107cells/100mm dish/150cm2flask，單位細(xì)胞量使用的裂解液），研磨組織至粉末狀。以15 000rpm于4℃離心10min，將上清液轉(zhuǎn)入新的EP管中，用蛋白質(zhì)定量試劑對各樣品的總蛋白進(jìn)行定量，即以牛血清白蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)，采用BIO-RAD公司蛋白質(zhì)定量試劑（protein assay）比色測定蛋白質(zhì)的含量，根據(jù)公式C（mg/mL）＝1.45×A280－0.74×A260計(jì)算蛋白質(zhì)的濃度，蛋白樣品置于－80℃保存。取各組的總蛋白50μg用Tricine-PAGE分離，以100V、50min轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。室溫下將PVDF膜在含有5%脫脂奶粉的TBS中使用搖床封閉1～2h。TBS室溫下漂洗PVDF膜10min×2次，TBST室溫下漂洗10min。將PVDF膜在含有兔抗人FAK單克隆抗體的TBST（1∶500）中于室溫孵育1～2h，或者于4℃孵育過夜。同時使用小鼠抗人GAPDH單克隆抗體（1∶5 000）孵育作為對照。TBS室溫下漂洗PVDF膜10min×2次，TBST室溫下漂洗10min。HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（H+L）（用于FAK），山羊抗小鼠IgG（H+L）（用于GAPDH），在TBST中稀釋（1∶10 000），再與PVDF膜于室溫下在搖床上孵育1～2h。TBST室溫下漂洗PVDF膜5min×3次。將兩種化學(xué)發(fā)光底物等體積混合，于暗室中進(jìn)行適時曝光；在X光醫(yī)用沖洗機(jī)上顯影，Quantity One軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以FAK/GAPDH的IOD比值作為FAK的蛋白相對表達(dá)量。

1.2.4 腫瘤組織免疫組化、抗血管生成和細(xì)胞增殖 將石蠟切片置于65℃孵箱中加熱2h，隨后二甲苯脫蠟15min×2次；再先后用100%、95%、80%、70%酒精浸泡各2min；無菌去離子水洗滌5min×2次。用3%過氧化氫處理（室溫）切片25min以阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶的作用；PBS室溫下漂洗組織切片5min×2次；將切片置于0.01M檸檬酸緩沖液（pH6.0）中，煮沸后高壓加熱10min進(jìn)行抗原修復(fù)（FAK）或枸櫞酸緩沖液（pH6.0）高壓加熱10min修復(fù)（CD31或PCNA）；自然冷卻至室溫，無菌去離子水洗片5min×2次；以3%的與第二抗體同源血清處理切片，室溫或37℃20min，之后用濾紙吸去多余血清；濾紙吸去血清后直接滴加FAK蛋白免疫前的兔血清或兔抗人FAK抗血清（1∶1 000），或小鼠抗人CD31和PCNA一抗（1∶500），置濕盒內(nèi)于37℃孵育30min，然后4℃冰箱過夜；PBS室溫下漂洗組織切片5min×2次；滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔第二抗體（1∶200，以PBS稀釋）50μL，置濕盒內(nèi)于37℃孵育40min；PBS室溫下漂洗組織切片5min×2次；酶標(biāo)鏈親和素復(fù)合物（1∶200，以PBS稀釋）50μL，置濕盒內(nèi)于37℃孵育40min；PBS室溫下漂洗組織切片5min× 2次；濾紙吸去切片周圍液體，滴加新鮮配制DAB工作液［0.01M PBS 1mL中加入DAB貯存液（25mg/ mL）20μL、3%過氧化氫10μL］顯色，鏡下觀察，適時終止顯色，流水充分沖洗；蘇木素復(fù)染，室溫4min，流水充分沖洗后用1%鹽酸酒精（80%酒精99ml中加入濃鹽酸1ml）分色30s左右，流水沖洗返藍(lán)15min；脫水、透明，用中性樹膠封片，光鏡下觀察并照相。

1.2.5 TUNEL檢測 腫瘤組織的細(xì)胞凋亡采用Promega公司的DeadEnd Fluorometric TUNEL（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling，原位末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法）System檢測，參照試劑盒提供的方法進(jìn)行。在熒光顯微鏡下全面觀察每一張切片，隨機(jī)選擇3個高倍（×400）視野，每個視野內(nèi)計(jì)數(shù)紅色熒光細(xì)胞和綠色熒光細(xì)胞的數(shù)量，計(jì)算出腫瘤組織細(xì)胞的凋亡指數(shù)（凋亡指數(shù)＝凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 20.0軟件，各組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），計(jì)量采用t檢驗(yàn)；檢驗(yàn)水平為α＝0.05。

2 結(jié) 果

2.1 shRNA-FAK治療后對荷瘤小鼠瘤重和腫瘤體積的影響

治療第20d，以頸椎脫臼法處死裸鼠。取各組裸鼠的腫瘤組織進(jìn)行稱重并計(jì)算體積。結(jié)果發(fā)現(xiàn)shRNA-FAK能明顯抑制腫瘤生長，到治療終止時腫瘤的生長在治療組（shRNA-FAK組）和陰性對照組（HK組）之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而空白組（GS組）與陰性對照組（HK組）之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2、圖3），表明了實(shí)驗(yàn)中所采用的靶向shRNA-FAK能有效抑制體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的生長。治療組（shRNA-FAK組）抑瘤率為56.50%，與陰性對照組（HK組）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

圖2 各組的腫瘤重量Figure 2 Tumor weight of dissected lung cancer xenograft from each treatment groups

圖3 各組的腫瘤生長曲線Figure 3 The tumor growth curves by groups

表1 各組裸鼠瘤重及抑瘤率比較Table 1 Tumor weight and tumor inhibition rate

2.2 腫瘤模型中的RNA干擾效果

經(jīng)western blot分析，GS組、HK組和shRNAFAK組的相對FAK蛋白質(zhì)表達(dá)量分別為78.36% ±1.67%，79.94%±8.90%和38.37%±1.85%。HK組相對于GS組，未見FAK蛋白含量下調(diào)，而在shRNA-FAK組中，F(xiàn)AK蛋白含量明顯下調(diào)，與GS組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖4）；腫瘤組織FAK免疫組織化學(xué)分析顯示，HK組相對于GS組，未見FAK蛋白含量下調(diào)，而在shRNA-FAK組中，F(xiàn)AK蛋白含量明顯下調(diào)（圖5A）。GS組與陰性對照組（HK組）的腫瘤細(xì)胞形態(tài)完整，沒有出現(xiàn)明顯的壞死區(qū)域。shRNA-FAK治療組的腫瘤組織內(nèi)部可以見到較為明顯的免疫細(xì)胞浸潤甚至細(xì)胞核固縮現(xiàn)象，而各對照組則很少有免疫細(xì)胞浸潤（圖5B）。腫瘤組織TUNEL染色顯示shRNA-FAK治療組中陽性染色細(xì)胞（凋亡細(xì)胞）明顯增加，GS組和HK組未見明顯的凋亡細(xì)胞（圖5C1），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖5C2）。在shRNA-FAK組中，腫瘤組織血管明顯減少，而在GS組和HK組中，未見腫瘤組織血管減少（圖5D1），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖5D2）；腫瘤組織VEGF、PCNA免疫組織化學(xué)分析顯示，在GS組和HK組中，未見VEGF、PCNA蛋白含量下調(diào)（棕黃色為陽性），而在shRNA-FAK組中，VEGF、PCNA蛋白含量明顯下調(diào)（圖5E1、F1），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖5E2、F2）。

圖4 Western blot檢測SPC－A1細(xì)胞中FAK蛋白表達(dá)Figure 4 FAK of SPC-A1 cells measured by Western blot analysis

2.3 不良反應(yīng)觀察

隨著腫瘤逐漸增大，各組荷瘤鼠攝食都出現(xiàn)減少，活動遲緩，體重減輕，精神變差。后期出現(xiàn)腫瘤惡病質(zhì)表現(xiàn)。治療結(jié)束后頸椎脫臼法處死小鼠，取出心、肝、脾、肺、腎等主要臟器進(jìn)行常規(guī)H＆E染色，顯微鏡下觀察各組織器官的細(xì)胞形態(tài)在對照組和治療組中均未出現(xiàn)明顯異常的形態(tài)學(xué)差異（圖6）。

3 討 論

在這項(xiàng)研究中，我們通過shRNA-FAK抑制荷瘤小鼠腫瘤組織的FAK蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)肺腺癌SPCA1細(xì)胞凋亡，抑制肺腺癌腫瘤的生長。結(jié)果表明，在荷瘤小鼠中，F(xiàn)AK蛋白的表達(dá)抑制對于控制人肺腺癌SPC-A1的生長是有效的，與對照組相比，腫瘤體積明顯減小，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，在該腫瘤模型中，shRNA-FAK成功地抑制了腫瘤的生長，F(xiàn)AK或可成為肺腺癌的有效靶點(diǎn)。

圖5 各組腫瘤組織中蛋白表達(dá)情況與細(xì)胞凋亡分析Figure 5 Analysis of protein expression and apoptosis in tumor tissues

在許多惡性腫瘤中FAK均過表達(dá)，包括卵巢癌［7］，甲狀腺癌、乳腺癌［8］、結(jié)腸癌［9］、頭頸部腫瘤［10］。FAK是關(guān)鍵的非受體激酶，F(xiàn)AK與一些信號及細(xì)胞骨架分子結(jié)合后磷酸化，傳遞來自細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的信號或傳遞來自可溶性生物活性因子的信號［11］。FAK在細(xì)胞遷移、存活和增殖中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用［12］。FAK也是細(xì)胞存活和細(xì)胞凋亡的重要介質(zhì)；FAK表達(dá)水平的升高與人腫瘤細(xì)胞侵入電位高度相關(guān)［13］。當(dāng)細(xì)胞受到紫外線照射，或接觸到依托泊苷、過氧化氫時，F(xiàn)AK的過表達(dá)能使細(xì)胞免受這類應(yīng)激反應(yīng)的傷害。但是以前的報告表明FAK活性的抑制并不一定誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［14－15］。在體外實(shí)驗(yàn)中，抑制FAK活動沒有影響胰腺癌細(xì)胞的增殖，也未誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［16］。細(xì)胞在體外單層培養(yǎng)時，F(xiàn)AK基因沉默不誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而它在裸鼠中抑制腫瘤的生長，這表明，抑制FAK表達(dá)進(jìn)而抑制體內(nèi)腫瘤生長可能體現(xiàn)在失巢凋亡上：即凋亡的形成是由于FAK基因沉默導(dǎo)致與細(xì)胞外基質(zhì)信號傳導(dǎo)缺失的緣故。

圖6 各組裸鼠主要臟器（心臟、肝臟、脾臟、腎臟）H＆E染色Figure 6 H＆E staining of heart，liver，spleen and kidney tissues in each group，SP×200.

與siRNA［17］相比，在質(zhì)粒中表達(dá)shRNA可更方便地以低成本進(jìn)行擴(kuò)增，并且shRNA非常穩(wěn)定。本研究中，我們采用了質(zhì)粒表達(dá)shRNA來特異性抑制FAK基因的功能，并在體內(nèi)應(yīng)用時用脂質(zhì)體包裹表達(dá)質(zhì)粒以延緩其在血清中的半衰期，取得了比較理想的抗腫瘤效果。病毒DNA載體表達(dá)的shRNA也已經(jīng)用于對特定基因的沉默［18］。但是，病毒載體在全身給藥時能激起機(jī)體的免疫反應(yīng)［19］，特別是可能會因?yàn)椴《净蚪M的插入而導(dǎo)致其他疾?。ㄈ绨籽。?，使其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用受到限制［［20－21］。Cardoso等［22］研究發(fā)現(xiàn)，由轉(zhuǎn)鐵蛋白、脂質(zhì)體和siRNA三者構(gòu)成的復(fù)合體更加穩(wěn)定且靶向性和安全性好；利用聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）修飾的免疫脂質(zhì)體（pegylated immunoliposomes，PIL）包裹表達(dá)shRNA的質(zhì)粒不僅增加了表達(dá)質(zhì)粒在體內(nèi)的穩(wěn)定性，而且能靶向性地透過血腦屏障［23］，使RNAi質(zhì)粒能夠到達(dá)腫瘤部位?？傊?，使用shRNA為人類進(jìn)行治療，很大程度上依賴于安全而有效的輸送系統(tǒng)。FAK在腫瘤進(jìn)展中起著關(guān)鍵性的作用［24］，未來或?qū)⒂懈嗟氖褂胹hRNA靶向FAK的治療方案，比如使用特定抗體綴合載體、組織特異性基因啟動子載體或細(xì)胞特異性基因啟動子載體以抑制FAK激酶活性。

總之，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，通過脂質(zhì)體包裹的shRNA-FAK質(zhì)粒使FAK低表達(dá)可抑制肺腺癌SPC-A1腫瘤的生長和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡?；趕hRNA的優(yōu)點(diǎn)和對FAK現(xiàn)有的研究，我們認(rèn)為在未來shRNA和FAK仍會是研究的熱點(diǎn)，如何更有效地將RNAi導(dǎo)入哺乳動物體內(nèi)，進(jìn)行基因功能研究和基因治療，值得進(jìn)一步探索。

作者聲明：本文第一作者對于研究和撰寫的論文出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)相應(yīng)責(zé)任。

利益沖突：本文全部作者均認(rèn)同文章無相關(guān)利益沖突。

學(xué)術(shù)不端：本文在初審、返修及出版前均通過中國知網(wǎng)（CNKI）科技期刊學(xué)術(shù)不端文獻(xiàn)檢測系統(tǒng)學(xué)術(shù)不端檢測。

同行評議：經(jīng)同行專家雙盲外審，達(dá)到刊發(fā)要求。

［1］ Fred R Hirsch.Lung cancer：current therapies and new targeted treatments［J/OL］.http：//www.thelancet.com/journals/lancet/article/PIIS0140－6736（16）30958－8/abstract，2016－08－26.

［2］ Zappa C，Mousa SA.Non－small cell lung cancer：current treatment and future advances［J］.Transl Lung Cancer Res，2016，5（3）：288－300.

［3］ Schiller JH，Harrington D，Belani CP，et al.Comparison of four chemotherapy regimens for advanced non－small－cell lung cancer［J］.N Engl JMed，2002，346（2）：92－98.

［4］ Cance WG，Kurenova E，Marlowe T，et al.Disrupting the scaffold to improve focal adhesion kinase－targeted cancer therapeutics［J］.Sci Signal，2013，6（268）：pe10.

［5］ Xu LH，Owens LV，Sturge GC，et al.Attenuation of the expression of the focal adhesion kinase induces apoptosis in tumor cells［J］.Cell Growth Differ，1996，7（4）：413－418.

［6］ Templeton NS，Lasic DD，F(xiàn)rederik PM，et al.Improved DNA：liposome complexes for increased systemic delivery and gene expression［J］.Nat Biotechnol，1997，15（7）：647－652.

［7］ Hutchinson L.Ovarian cancer：FAK-new target for antiangiogenic therapy［J］.Nat Rev Clin Oncol，2016，13（6）：328.

［8］ Isabelle Tancioni.FAK activity protects nucleostemin in facilitating breast cancer spheroid and tumor growth［J/OL］.https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4407832/，2015－05－28.

［9］ Heffler M，Golubovskaya VM，Conroy J，et al.FAK and HAS inhibition synergistically decrease colon cancer cell viability and af-fect expression of critical genes［J］.Anticancer Agents Med Chem，2013，13（4）：584－594.

［10］Kornberg LJ.Focal adhesion kinase expression in oral cancers［J］.Head Neck，1998，20（7）：634－639.

［11］Yoon H，Dehart JP，Murphy JM，et al.Understanding the roles of FAK in cancer：inhibitors，genetic models，and new insights［J］.J Histochem Cytochem，2015，63（2）：114－128.

［12］Tomakidi P，Schulz S，Proksch S，et al.Focal adhesion kinase（FAK）perspectives in mechanobiology：implications for cell behaviour［J］.Cell Tissue Res，2014，357（3）：515－526.

［13］Sonoda Y，Matsumoto Y，F(xiàn)unakoshi M，et al.Anti－apoptotic role of focal adhesion kinase（FAK）.Induction of inhibitor－of apoptosis proteins and apoptosis suppression by the overexpression of FAK in a human leukemic cell line，HL－60［J］.J Biol Chem，2000，275（21）：16309－16315.

［14］van de Water B，Houtepen F，Huigsloot M，et al.Suppression of chemically induced apoptosis but not necrosis of renal proximal tubular epithelial（LLC－PK1）cells by focal adhesion kinase（FAK）.Role of FAK in maintaining focal adhesion organization after acute renal cell injury［J］.JBiol Chem，2001，276（39）：36183－36193.

［15］Chan PC，Lai JF，Cheng CH，et al.Suppression of ultraviolet irradiation－induced apoptosis by overexpression of focal adhesion kinase in Madin-Darby canine kidney cells［J］.J Biol Chem，1999，274（38）：26901－26906.

［16］Duxbury MS，Ito H，Benoit E，et al.RNA interference targeting focal adhesion kinase enhances pancreatic adenocarcinoma gemcitabine chemosensitivity［J］.Biochem Biophys Res Commun，2003，311（3）：786－792.

［17］黃上明，彭 波，翁志梁.應(yīng)用RNA干擾技術(shù)阻斷PC－3細(xì)胞中SRC－1基因表達(dá)的意義［J］.腫瘤預(yù)防與治療，2013，26（6）：313－317.

［18］McCaffrey AP，Nakai H，Pandey K，et al.Inhibition of hepatitis B virus in mice by RNA interference［J］.Nat Biotechnol，2003，21（6）：639－644.

［19］Vorburger SA，Hunt KK.Adenoviral gene therapy［J］.Oncologist，2002，7（1）：46－59.

［20］Li Z，Dullmann J，Schiedlmeier B，et al.Murine leukemia induced by retroviral gene marking［J］.Science，2002，296（5567）：497.

［21］Marshall E.Gene therapy.Second child in French trial is found to have leukemia［J］.Science，2003，299（5605）：320.

［22］Cardoso AL，Simoes S，de Almeida LP，et al.siRNA delivery by a transferrin－associated lipid－based vector：a non－viral strategy to mediate gene silencing［J］.J Gene Med，2007，9（3）：170－183.

［23］Boado RJ.RNA interference and nonviral targeted gene therapy of experimental brain cancer［J］.Neuro Rx，2005，2（1）：139－150.

［24］Shanthi E，Krishna MH，Arunesh GM，et al.Focal adhesion kinase inhibitors in the treatment of metastatic cancer：a patent review［J］.Expert Opin Ther Pat，2014，24（10）：1077－1100.

RNA Interference Targeting Focal Adhesion K inase Inhibited the Grow th of Human Lung Adenocarcinoma SPC-A1*

Ye Lu，Mu Dan，F(xiàn)u Bo，et al
（Department of Oncology，No.416 Hospital of Ministry of Nuclear Industry，Chengdu 610051，Sichuan，China）

Objective：To evaluate the inhibition effect of the plasmids encoding focal adhesion kinase（FAK）short hairpin RNA（shRNA）encapsulated in liposome on human lung adenocarcinoma SPC-A1 in nudemice bearing tumor.Methods：The nudemice bearing tumor were established and treated with shRNA-FAK encapsulated in liposome through tail vein injection.The inhibition effect of human lung adenocarcinoma SPC-A1 in nude mice was analyzed by tumor growth curve and weight，tumor histomorphology，F(xiàn)AK protein expression，CD31，VEGF，PCNA and TUNEL detection.Results：Tumor growth speed was significantly slower in the nudemice treated with liposomal shRNA-FAK than that in the control group（P＜0.05）.The tumor weight in the nudemice treated with liposomal shRNA-FAK was significantly lower than that of the control group（P＜0.05）.Immunohistochemistry，Western blot and TUNEL assay showed that the expression of FAK protein（P＜0.05），the angiogenesis and cell proliferation decreased（P＜0.05），and the apoptotic cells increased（P＜0.05）in the treatment group compared with the control group，and the main organs of the nudemice bearing tumor were morphologically normal.Conclusion：FAK-specific small interfering RNA（siRNA）can suppress the expression of FAK protein in vivo，and the expression of FAK protein in the tissue is correspondingly reduced，thus induces the apoptosis of tumor cells，leading to the decelerated tumor growth.

RNA Interference；Focal Adhesion Kinase（FAK）；Apoptosis；SPC-A1

R734.2；R73-35；R730.231

A

10.3969/j.issn.1674-0904.2016.06.002

2016-09-07

2016-10-31

*國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)（編號：2009ZX09102－241）

葉 璐（1983－），女，成都人，碩士，主治醫(yī)師，主要從事胸部與腹部腫瘤的臨床研究與綜合治療。

△鄧洪新，教授，E-mail：denghongx＠scu.edu.cn