張海英　李偉　周龍龍　姜林　周銘心

摘要：目的 篩選新疆阿魏抗腫瘤的活性部位。方法 采用溶劑法將新疆阿魏分離成不同極性部位，磺酰羅丹明B法檢測各部位對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用，流式細(xì)胞術(shù)分析各部位誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。結(jié)果 新疆阿魏石油醚部位無抗腫瘤活性，新疆阿魏乙酸乙酯部、正丁醇部對人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、人結(jié)腸腺癌細(xì)胞Caco-2、人肝癌細(xì)胞HepG2、小鼠腎癌細(xì)胞MFC均有不同程度的增殖抑制和促凋亡作用，甲醇部位活性較弱。結(jié)論 乙酸乙酯、正丁醇部位有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，可確定為新疆阿魏抗腫瘤活性部位。

關(guān)鍵詞：新疆阿魏；抗腫瘤；活性部位；細(xì)胞凋亡

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.02.015

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）02-0052-05

Screening of Active Parts of Xinjiang Ferulae Resina with Anti-tumor Effects ZHANG Hai-ying1，2， LI Wei2， ZHOU Long-long1， JIANG Lin2， ZHOU Ming-xin1 （1. Xingjiang Medical University， Urumqi 830011， China； 2. Affiliated TCM Hospital of Xingjiang Medical University， Urumqi 830000， China）

Abstract： Objective To screen the active parts of Xinjiang Ferulae Resina with anti-tumor effects. Methods Solvent method was used to separate Xinjiang Ferulae Resina into parts with different polarities. SRB assay was applied to screen the effects of tumor cell inhibiting proliferation of different parts. Flow cytometry method was applied to study the effects of inducing tumor cell apoptosis of different parts. Results Petroleum ether parts of Xinjiang Ferulae Resina have no anti-tumor activity. Ethyl acetate and n-butyl alcohol polarity parts can inhibit proliferation and promote apoptosis of HCT116， Caco-2， HepG2 and MFC cells to some extent. Methanol polarity parts have weak anti-tumor effects. Conclusion Ethyl acetate and n-butyl alcohol polarity parts of Xinjiang Ferulae Resina have strong anti-tumor effects， which can be identified as active parts of Xinjiang Ferulae Resina with anti-tumor effects.

Key words： Xinjiang Ferulae Resina； anti-tumor； active part； apoptosis

阿魏屬隸屬傘形科前胡族，約有150余種，主要分布于地中海、中亞及其鄰邊地區(qū)，我國有31種，其中新疆產(chǎn)25種[1]。2010年版《中華人民共和國藥典》收載阿魏為傘形科植物新疆阿魏Ferula. sinkiangensis K.M.Shen或阜康阿魏Ferula. fukanensis K.M.Shen的樹脂，味苦、辛，性溫，歸脾胃經(jīng)，具有消食、化癥、散痞、殺蟲之功效[2]。近年來由于發(fā)現(xiàn)阿魏有植物雌激素作用和抗癌活性而倍受人們關(guān)注。新疆少數(shù)民族用其治療胃腸道腫瘤，研究表明阿魏同屬植物有明確的抗腫瘤作用[3-5]。

本研究采用不同極性溶劑將新疆阿魏分為石油

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（81260625）

通訊作者：周銘心，E-mail：zmx9998@vip.sina.com

醚、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇4個(gè)部位，采用磺酰羅丹明B（SRB）法檢測不同部位對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用，流式細(xì)胞術(shù)檢測新疆阿魏不同部位誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，初步確定新疆阿魏抗腫瘤活性部位。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞株

人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、人肝癌細(xì)胞HepG2、小鼠胃癌細(xì)胞MFC、人結(jié)腸腺癌細(xì)胞Caco-2，中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所提供，實(shí)驗(yàn)使用細(xì)胞為5～10代。

1.2 藥物

新疆阿魏藥材為傘形科植物新疆阿魏Ferula sinkiangensis K.M.Shen的樹脂，經(jīng)新疆伊犁州食品藥品檢驗(yàn)所檢驗(yàn)合格，批號20120004。

1.3 主要試劑與儀器

DMEM高糖、RPMI1640培養(yǎng)液（美國Gibco公司，批號1346370、1237839），胎牛血清（美國Hyclone公司，批號F120121），SRB（美國Sigma公司，批號20223FAV），三氯乙酸（分析級，天津市百世化工有限公司，批號20100102），乙酸乙酯、正丁醇、甲醇、30～60 ℃石油醚均為分析純。超凈工作臺（中國上海智誠ZHJH.C1112B），酶標(biāo)儀（美國Thermo公司），二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），流式細(xì)胞儀（美國MILLPORE公司，GUAVA EASYCYTE8HT），10 mL移液管、5 mL移液管、100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿、6孔板、96孔板（美國COSTAR公司），移液器（德國Eppendorf公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 新疆阿魏不同極性部位的分離

新疆阿魏400 g，用30～60 ℃石油醚2000 mL超聲提取40 min，控溫在40 ℃以下，相同方法提取1次，過濾，濃縮，60 ℃干燥，至無氣泡產(chǎn)生，即得石油醚部位。上述殘?jiān)儆?5%乙醇2000 mL超聲提取2次，過濾，合并提取液，減壓濃縮。濃縮的膏液用硅藻土拌樣分散均勻后，用乙酸乙酯2000 mL超聲提取2次至提取液近無色，減壓回收得乙酸乙酯部位；繼續(xù)用水飽和正丁醇2000 mL超聲提取2次至提取液近無色，減壓回收得正丁醇部位；用甲醇2000 mL超聲提取2次至提取液近無色，減壓回收得甲醇部位。

2.2 磺酰羅丹明B法檢測

HCT116、HepG2、MFC、Caco-2細(xì)胞用加10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素在37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。體外各極性部位對腫瘤細(xì)胞增殖作用的測量采用SRB法。取處于對數(shù)生長期的HCT116、HepG2、MFC、Caco-2細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，96孔板上每孔加入，培養(yǎng)24 h后加藥處理。新疆阿魏石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇部位4組為藥物組，用DMSO助溶后分別稀釋成250、125、62.5、31.2、15.6 mg/L。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。并設(shè)調(diào)零孔、對照組，三氯乙酸溶液（50%）固定細(xì)胞，沖洗5遍，每孔加入0.4%SRB染液，染色30 min后，再用1%乙酸漂洗4次，加150 μL Tris-base堿液（10 mmol/L，pH 10.5），反復(fù)振蕩10 min，在酶標(biāo)儀515 nm處測定吸光度值（A）[6]。計(jì)算腫瘤細(xì)胞增殖抑制率[（A對照孔-A給藥孔）÷（A對照孔-A調(diào)零孔）×100%]。

根據(jù)各濃度抑制率，半數(shù)抑制濃度（IC50）采用Graphpad Prism 5軟件的IC50計(jì)算模型計(jì)算。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，求出3次實(shí)驗(yàn)各濃度的抑制率與IC50，以平均值作為最終結(jié)果。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測

取處于對數(shù)生長期的HCT116、HepG2、Caco-2細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，每孔1 mL加入6孔板，培養(yǎng)24 h。設(shè)對照組與新疆阿魏石油醚部、乙酸乙酯部、正丁醇部、甲醇部4個(gè)給藥組，藥物濃度為62.5 mg/L，每孔加入2 mL含藥培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。取出6孔板，PBS打散成細(xì)胞混懸液，4 ℃、500 r/min離心5 min，重復(fù)清洗2次，加入染料Annexin V-FITC 5 μL混勻，4 ℃染色20 min，再加入PI染料10 μL混勻，4 ℃染色5 min。點(diǎn)樣在96孔板中，流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析[7-8]。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SAS.JMP 9.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，先進(jìn)行單因素方差分析，與對照組比較采用Dunnett法，多組兩兩比較采用TUKEY-HSD法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 新疆阿魏各極性部位一般情況

新疆阿魏各極性分離部位所得產(chǎn)物的質(zhì)量、比重、性狀都不相同。通過阿魏成分特性推斷，石油醚部富集了一些含硫的脂肪類成分及一些揮發(fā)性萜類；乙酸乙酯部、正丁醇部可能富含不同極性的香豆素倍半萜等；甲醇部則除香豆素倍半萜類外，含簡單苯丙酸類衍生物類成分較多。正丁醇部、甲醇部得率低，石油醚部、乙酸乙酯部得率較高，有進(jìn)一步開發(fā)利用的價(jià)值。結(jié)果見表1。

4.2 新疆阿魏各極性部位對腫瘤細(xì)胞增殖的影響

SRB法研究新疆阿魏各極性部位（250、125、62.5、31.2、15.6 mg/L）對HCT116、HepG2、MFC、Caco-2細(xì)胞的增殖抑制作用，結(jié)果表明，新疆阿魏各極性部位對HCT116、Caco-2、HepG2、MFC細(xì)胞的增殖均有一定抑制作用。其中石油醚部抑制作用較弱，在低濃度下還具有營養(yǎng)作用；新疆阿魏乙酸乙酯部位、正丁醇部位對腫瘤細(xì)胞的抑制效果比較明顯，乙酸乙酯部位對Caco-2、HepG2、MFC細(xì)胞的IC50分別為14.8、28.7、9.0 mg/L，正丁醇部位對Caco-2、HepG2、MFC細(xì)胞的IC50分別為15.6、36.6、14.9 mg/L；新疆阿魏各極性部位對HCT116細(xì)胞增殖抑制較弱。表明新疆阿魏乙酸乙酯、正丁醇部位抗腫瘤活性較高，對Caco-2、HepG2、MFC細(xì)胞的抑制效果比較明顯，為抗腫瘤活性部位，且在抗胃癌方面有進(jìn)一步開發(fā)利用的價(jià)值。結(jié)果見表2～表5。

4.3 新疆阿魏各極性部位對腫瘤細(xì)胞凋亡率的影響

新疆阿魏分離的4個(gè)部位對HCT116、Caco-2、HepG2細(xì)胞均有不同程度的促凋亡作用，與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。其中乙酸乙酯部促凋亡作用優(yōu)于其他3個(gè)部位，HCT116、Caco-2細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見表6、圖1～圖3。

5 討論

細(xì)胞水平上對抗腫瘤藥物的篩選主要是采用MTT法、SRB法等。而在本研究中并未采用傳統(tǒng)的MTT法，原因是MTT與新疆阿魏各極性部位反應(yīng)，需要在藥物處理結(jié)束后棄去含藥培養(yǎng)液和PBS洗板，造成假陽性，而SRB法的操作步驟中染料不直接與含藥培養(yǎng)基接觸，且染色后不像MTT法易變色，細(xì)胞固定染色后在96孔板中可放置較長時(shí)間，因而受測定時(shí)間影響較小，為美國國立癌癥研究所認(rèn)證的藥物對腫瘤細(xì)胞增殖抑制的檢測方法，所以此法具權(quán)威性[9]。

通過不同極性溶劑將新疆阿魏分為石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇4個(gè)部位，并對各部位進(jìn)行高效液相色譜檢測，在梯度洗脫的色譜條件下，石油醚部沒有色譜峰，推測石油醚部富集了一些含硫的脂肪類成分及一些揮發(fā)性萜類；乙酸乙酯部、正丁醇部、甲醇部有12個(gè)共有色譜峰，經(jīng)與對照品色譜圖、光譜圖比對，含有阿魏酸、法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇B、FarnesiferoneA、法尼斯淝醇C等，還有7個(gè)是未知峰，可能富含不同極性的香豆素倍半萜等，且各成分含量差異不大，這可能是乙酸乙酯部、正丁醇部、甲醇部藥效相近的原因，由結(jié)果可知，新疆阿魏抗腫瘤的有效成分為香豆素倍半萜類。

為研究新疆阿魏不同分離部位的抑制腫瘤增殖作用的量效關(guān)系，本研究設(shè)置250、125、62.5、31.2、15.6 mg/L共5個(gè)濃度。研究表明新疆阿魏各極性部位在濃度范圍內(nèi)均對HCT116細(xì)胞的增殖有一定抑制作用，且抑制率隨藥物濃度加大而升高，表現(xiàn)為濃度依賴性。以IC50來評判，乙酸乙酯部位對HCT116細(xì)胞增殖抑制效果最好，為43.7 mg/L。

Caco-2細(xì)胞增殖抑制研究發(fā)現(xiàn)，新疆阿魏乙酸乙酯部位、正丁醇、甲醇部位在濃度范圍內(nèi)對Caco-2細(xì)胞的增殖有一定抑制作用，且抑制率隨藥物濃度加大而升高，也表現(xiàn)為濃度依賴性，石油醚部位在低濃度對腫瘤細(xì)胞起到營養(yǎng)作用，在高濃度則有一定抑制作用，其細(xì)胞的增殖抑制效果最好的是乙酸乙酯部位和正丁醇部位，其IC50分別為14.8、15.6 mg/L。

HepG2細(xì)胞增殖抑制研究發(fā)現(xiàn)，新疆阿魏乙酸乙酯部位、正丁醇、甲醇部位和Caco-2細(xì)胞的增殖抑制作用情況相似，但石油醚部位完全表現(xiàn)為營養(yǎng)作用。HepG2雖然是腫瘤細(xì)胞，但仍然保留大部分肝細(xì)胞的一些特性，能對石油醚部位里面脂肪族類化合物吸收利用。增殖抑制最好效果部位則是乙酸乙酯部位，IC50為28.7 mg/L。

MFC細(xì)胞增殖抑制研究發(fā)現(xiàn)，新疆阿魏各個(gè)極性部位對細(xì)胞的增殖均有明顯抑制作用，抑制效果最好的是乙酸乙酯部位，IC50為9.0 mg/L。

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測新疆阿魏不同分離部位對結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、肝癌細(xì)胞HepG2、結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2的凋亡影響。結(jié)果表明，新疆阿魏各極性分離部位均對3種腫瘤細(xì)胞有一定的促凋亡作用，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，促HCT116細(xì)胞凋亡作用以阿魏乙酸乙酯部位效果最好，促Caco-2細(xì)胞凋亡作用以正丁醇部、甲醇部效果最好，促HepG2細(xì)胞凋亡作用以乙酸乙酯部位、正丁醇部效果最好。

綜上，新疆阿魏石油醚部位沒有抗腫瘤活性，新疆阿魏乙酸乙酯部、正丁醇部對HCT116、Caco-2、HepG2、MFC細(xì)胞均有不同程度的增殖抑制和促進(jìn)凋亡作用，甲醇部位活性較弱。其原因可能是倍半萜香豆素類、7-羥基香豆素的多種衍生物等能對腫瘤細(xì)胞有抑制作用的成分在此部位富集，與國外相關(guān)研究文獻(xiàn)相符[3-5]?？梢哉J(rèn)為，乙酸乙酯、正丁醇部位是新疆阿魏抗腫瘤的有效部位。

筆者擬下一步進(jìn)行抗腫瘤動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，研究乙酸乙酯、正丁醇部位的抗腫瘤藥效，并對其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)理進(jìn)行深入研究，為進(jìn)一步開發(fā)新疆特色藥材阿魏提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（收稿日期：2015-04-07）

（修回日期：2015-05-22；編輯：向宇雁）