吳疑，匡梅綜述，周紅，潘夕春審校

（第三軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，重慶400038）

TLR4信號通路及其負(fù)調(diào)控研究進(jìn)展*

吳疑，匡梅綜述，周紅，潘夕春△審校

（第三軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，重慶400038）

受體，細(xì)胞表面；膜糖蛋白類；信號處理，計算機輔助的；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；TLR4；脂多糖；負(fù)調(diào)控

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.18.013

A

1009-5519（2016）18-2821-04

Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是機體天然免疫系統(tǒng)中的模式識別受體，可識別不同的病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associatedmolecular patterns，PAMPs），從而啟動相關(guān)的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［1］。其中，TLR4相對分子質(zhì)量為90×103～150×103，主要分布于巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、T/B淋巴細(xì)胞及上皮細(xì)胞，識別革蘭陰性（G-）菌的菌壁成分脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）［2-4］。TLR4為Ⅰ型跨膜受體，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)及胞內(nèi)區(qū)組成。胞外區(qū)負(fù)責(zé)識別配體，由22個長度為20～30氨基酸殘基的亮氨酸重復(fù)序列（leucine-rich repeat，LRR）組成；跨膜區(qū)富含半胱氨酸，決定TLR4的胞膜定位；胞內(nèi)區(qū)包含1個在所有TLRs中序列保守的結(jié)構(gòu)域，即Toll/ IL-1受體（Toll/interleukin-1 receptor domain，TIR）結(jié)構(gòu)域，可招募下游銜接蛋白從而啟動下游通路，導(dǎo)致腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factors α，TNF-α）、白介素6（IL-6）等炎癥因子的大量釋放［5-7］。TLR4通路與感染性疾病、腫瘤、自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡等的發(fā)生密切相關(guān)，被認(rèn)為是上述疾病的重要靶點。本文將就TLR4介導(dǎo)的天然免疫信號通路及其負(fù)調(diào)控的最新進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1　TLR4介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

1.1LPS誘導(dǎo)TLR4二聚體化LPS主要由3個部分構(gòu)成：脂質(zhì)A、核心多糖和O抗原多糖，其中脂質(zhì)A是誘發(fā)TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要部分。G-菌的脂質(zhì)A一般含1條糖胺主鏈和5～7條脂鏈。大腸埃希菌和沙門菌的脂質(zhì)A含2個磷酸基團(tuán)且其?；擞?條脂鏈，研究表明這種結(jié)構(gòu)比其他G-菌有更強的炎性反應(yīng)活性［1，8］。脂質(zhì)A的脂鏈和磷酸基團(tuán)數(shù)量發(fā)生改變均可抑制TLR4二聚體化［9-10］。因此，可通過改變脂質(zhì)A脂鏈和磷酸基團(tuán)數(shù)量，獲得具有阻斷TLR4二聚體化活性的LPS類似物作為新型抗生素。

TLR4與髓分化蛋白2（myeloid differentiation protein 2，MD-2）形成異二聚體［1］。MD-2是分泌型糖蛋白，含1個β-折疊和2個β-片層，2個β-片層之間為結(jié)合LPS的疏水活性中心。相較于其他β-折疊類蛋白，MD-2的β-片層間無二硫鍵，因此疏水中心較易暴露。MD-2的疏水中心由大量帶正電荷基團(tuán)修飾，因此易結(jié)合兩親性的或帶負(fù)電荷的配體，如LPS。MD-2只有約1/3部分與TLR4凹面結(jié)合，剩余部分結(jié)合LPS或其他配體［5］。MD-2與TLR4結(jié)合方式：TLR4胞外區(qū)N端和中心部分的電荷與MD-2表面電荷互補結(jié)合，其結(jié)合位點主要分為A、B區(qū)。A區(qū)負(fù)電荷與MD-2表面正電荷作用，B區(qū)正電荷與MD-2表面負(fù)電荷作用，此外還有氫鍵等作用參與，使二者表面緊密結(jié)合。研究表明，A、B區(qū)或親水基團(tuán)突變均會影響TLR4與MD-2結(jié)合［1］。

LPS首先與血清中LPS結(jié)合蛋白（LPS-binding protein，LBP）結(jié)合，然后被轉(zhuǎn)運給CD14。CD14是LPS的高親和力受體，以分泌性蛋白的形式存在或以糖基磷脂酰肌醇形式錨定在巨噬細(xì)胞表面，將LPS聚合物分解為單分子并呈遞給TLR4∶MD-2復(fù)合物［1，9］。隨后脂質(zhì)A的5條脂鏈都嵌在MD-2的疏水中心，另一條R2脂鏈則有部分位點暴露，以結(jié)合TLR4從而介導(dǎo)TLR4二聚體的形成，最終使LPS結(jié)合TLR4和MD-2的聚合物誘導(dǎo)形成“M”形2∶2∶2復(fù)合物，啟動胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

1.2胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)TLR4胞內(nèi)信號通路包括髓分化因子（myeloid differentiation factor 88，MyD88）依賴和非依賴途徑，均可通過招募下游銜接蛋白而放大刺激信號，上調(diào)炎癥基因表達(dá)［4，11］。

1.2.1MyD88依賴途徑LPS活化的TLR4二聚體可形成高度有序的多聚體，從而更易招募MyD88等銜接蛋白。MyD88包含2個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域：C端的TIR結(jié)構(gòu)域，可與TLR、IL-1R和IL-18R的TIR結(jié)構(gòu)域結(jié)合；N端的死亡結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)招募下游含死亡結(jié)構(gòu)域的信號分子［5］。TLR4招募MyD88需要MyD88樣受體（Mal）的參與。不同于其他含TIR結(jié)構(gòu)域的銜接蛋白，Mal通過其突起的“AB loop”連接TLR4和MyD88，且其N端含磷脂酰肌醇4，5-二磷酸，可與細(xì)胞膜上富含TLR4的區(qū)域連接，有利于Mal與MyD88結(jié)合［12］。

隨后MyD88招募IL-1受體相關(guān)激酶（IL-1R associated kinases，IRAKs），形成螺旋狀的MyD88-IRAK-4-IRAK-1/2復(fù)合物（Myddosome）。Myddosome由6個MyD88、4個IRAK-4和4個IRAK-1/2通過死亡結(jié)構(gòu)域連接而成。該復(fù)合物形成過程：TLR4首先招募形成6～8個MyD88復(fù)合物，此復(fù)合物聚集4個IRAK-4使其自身磷酸化，最后結(jié)合4個IRAK-1/2亞基［13-14］。隨后IRAK1磷酸化并與MyD88脫離，招募并活化腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TNFR-associated factor 6，TRAF6），活化的TRAF6招募轉(zhuǎn)化生長因子-β活化激酶結(jié)合蛋白抗體1/2/3（TAB1/2/3），形成轉(zhuǎn)化生長因子激酶1（TAK1）復(fù)合物［6，15］。TAK1復(fù)合物由TAK1及TAB1/2/3構(gòu)成，其中TAB2介導(dǎo)TAK1和TRAF6的結(jié)合，TAB1使TAK1活性增強。TAK1可招募并激活核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）抑制蛋白（IκB）激酶（IκB kinase，IKK），最終作用于IκB并使其磷酸化、泛素化降解，從而導(dǎo)致NF-κB與IκB分離入核，啟動或增強炎癥基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)炎癥因子及炎癥趨化因子如TNF-α、IL-12的表達(dá)［8，16］。TAK1也可招募促細(xì)胞分裂激活性蛋白激酶4（mitogenactivatedproteinkinase 4，MKK4），使C-JunN端激酶（JNK）磷酸化，隨后JNK激活了激活子蛋白-1（AP-1）轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)促炎介質(zhì)如TNF-α等的表達(dá)；TAK1還能招募MKK3和MKK6，誘導(dǎo)p38α活化，從而激活轉(zhuǎn)錄因子CREB和c/EBP-β，誘導(dǎo)炎癥趨化因子、促炎性細(xì)胞因子（IL-10，IL-12）等的表達(dá)［6］。除此之外，MyD88、IRAK-1、IRAK-4和TRAF6也可通過干擾素調(diào)節(jié)因子5（IRF5）作用，促進(jìn)干擾素表達(dá)［17-18］。

1.2.2MyD88非依賴途徑研究表明，MyD88基因缺陷小鼠未完全喪失對LPS刺激的反應(yīng)性，且體內(nèi)IRF3的活化和干擾素-β（IFN-β）的表達(dá)均不受影響，表明TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并不完全依賴于MyD88途徑［19］。TLR4也可招募誘導(dǎo)IFN-β含TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白（TIR domain-containing adaptor inducing interferon β，TRIF），啟動后續(xù)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。具體過程：Mal磷酸化從膜上解離，從而使LPS/MD-2/TLR4聚合物形成內(nèi)體；隨后TRIF相關(guān)接頭分子（TRIF-related adaptor molecule，TRAM）介導(dǎo)含TLR4的內(nèi)體與TRIF結(jié)合，其作用與Mal類似，但僅有當(dāng)TLR4二聚體化且以內(nèi)體形式存在時，TRAM才會與之連接［8，14，20-21］；隨后TRIF招募含RIP同型結(jié)構(gòu)域激酶（RIP homotypic interaction motif containing kinase，RIP1），使RIP1被E3泛素化連接酶Peli1泛素化，最終與IKKγ及TAK1相互作用，通過絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和NF-κB途徑調(diào)節(jié)炎癥基因表達(dá)。TRIF也能招募TRAF3，后者自身修飾后與激酶TBK1相互作用，使轉(zhuǎn)錄因子IRF3磷酸化并移位到核內(nèi)，啟動Ⅰ型干擾素的表達(dá)［3，6，17］。

2　TLR4信號通路中的負(fù)調(diào)控因子

TLR4信號通路是天然免疫系統(tǒng)中最重要的致炎信號通路之一，是治療感染性炎癥的重要靶點。本部分從抑制TLR4表達(dá)、TLR4二聚體化及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)3個不同層面，對現(xiàn)有的負(fù)調(diào)控因子研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

2.1抑制TLR4表達(dá)定量RT-PCR和熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實，let-7家族的miRNA let-7i在轉(zhuǎn)錄后水平與TLR4mRNA的3′-非翻譯區(qū)相互作用，抑制其表達(dá)［2，22］。阿托伐他汀可顯著上調(diào)miRNA let-7i從而抑制TLR4、NF-κB表達(dá)，減弱信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。動脈粥樣硬化患者使用阿托伐他汀后，體內(nèi)miRNA let-7i表達(dá)升高而TLR4表達(dá)降低。阿托伐他汀還可通過干擾胞膜脂筏形成，影響TLR4聚集，導(dǎo)致MyD88招募和通路活化受阻。臨床研究表明，阿托伐他汀和替米沙坦聯(lián)合治療可減少動脈粥樣硬化患者巨噬細(xì)胞中IRAK-1、TRAF6和TLR4的mRNA表達(dá)。該過程中TLR4不是直接靶點，這也給抗感染治療提供了一個新的思路。阿托伐他汀是廣泛應(yīng)用于臨床的降脂藥，其安全性高、作用機制明確，可作為治療G-菌感染或TLR4信號通路介導(dǎo)的其他疾病的候選藥物［2，15，23］。

2.2抑制TLR4二聚體化單磷酰脂質(zhì)A（monophosphory lipid A，MPLA）是人乳頭瘤病毒和乙型肝炎病毒疫苗的組成成分，是現(xiàn)今唯一商業(yè)化作用于TLR4途徑的疫苗佐劑。在乙型肝炎疫苗中加入MPLA，可顯著提高免疫受損患者的體內(nèi)抗體濃度［8，24］。MPLA是沙門菌脂質(zhì)A的衍生物，較脂質(zhì)A少一個磷酸基團(tuán)，其與TLR4的結(jié)合位點及形成的TLR4-MD-2二聚體結(jié)構(gòu)與脂質(zhì)A高度相似。但MPLA較LPS致炎活性減弱，原因可能是其缺少磷酸基團(tuán)，與帶正電荷的TLR4-MD-2的親和力減弱，因而誘導(dǎo)二聚化的能力也相應(yīng)減弱［5］。在非靈長類動物皮內(nèi)注射MPLA，發(fā)現(xiàn)其能招募抗原提呈細(xì)胞，且能誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞擴增，因而可作為疫苗佐劑［8，25］。

姜黃素為酸性多酚類物質(zhì)，是姜黃根的主要組成成分，主要在膳食和傳統(tǒng)飲食中作為添加劑使用。其在HEK-TLR4細(xì)胞中可與LPS競爭性結(jié)合MD-2，從而抑制TLR4二聚體形成，阻斷LPS/TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。因而姜黃素也作為候選藥物進(jìn)行研究［26］。

2.3阻斷胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

2.3.1作用于銜接蛋白生長停滯特異基因Gas6是一種分泌蛋白，與抗凝素蛋白氨基酸序列同源度為46%，能特異性激活TAM受體酪氨酸激酶，TAM與Ⅰ型干擾素受體（IFNR1）結(jié)合，通過IFNR1激活信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1（STAT1），活化的STAT1能促進(jìn)細(xì)胞因子信號抑制物1（SH2 domain of suppressor of cytokine signaling 1，SOCS-1）和SOCS-3的表達(dá)，其中SOCS-1可以輔助Mal泛素化降解，阻斷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。實驗表明，SOCS-1轉(zhuǎn)基因小鼠對LPS沒有反應(yīng)，SOCS-3可作用于TRAF3，阻斷下游信號通路［3，27］。

單核細(xì)胞受到LPS誘導(dǎo)后，MyD88剪接體（MyD88s）表達(dá)增加，MyD88s與MyD88競爭性結(jié)合MyD88，形成不能與IRAK-4相互作用的MyD88與MyD88s二聚體，從而抑制下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［3］。含金結(jié)構(gòu)域TRAM接頭蛋白（TAG）是TRAM的一種剪接體，存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和靜息細(xì)胞的早期內(nèi)體中。當(dāng)細(xì)胞受到LPS刺激時，TAG轉(zhuǎn)移到晚期內(nèi)體中干擾TRAM與TLR4的結(jié)合，抑制Ⅰ型干擾素生成。實驗表明，TAG敲除小鼠體內(nèi)TLR4降解速度減慢，表明TAG可促進(jìn)TLR4降解［20，27］。

2.3.2作用于激酶IRAKsIRAKM屬于IRAK家族，但缺少其相似物IRAK-1/2和IRAK-4的激酶活性。IRAKM阻礙IRAK-1/IRAK-4與MyD88的分離，由此抑制IRAK-1與TRAF-6的結(jié)合，從而阻斷下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［28］。

2.3.3作用于TRAFs去泛素化酶鋅指蛋白A20也稱作TNF-α誘導(dǎo)蛋白3（TNF-α-induced protein 3，TNFAIP3），是一個由Tnfaip基因編碼的去泛素化酶。A20特異性識別TRAF6并使其去泛素化，從而阻斷TRAF6與多聚泛素鏈的連接，抑制TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［3，6，27］。

腸道細(xì)菌如大腸埃希菌和沙門菌作用于腸上皮細(xì)胞，然而盡管有TLR存在，腸上皮細(xì)胞對病原體的反應(yīng)較其他細(xì)胞偏弱。其原因是腸上皮細(xì)胞表達(dá)一種負(fù)調(diào)控TLR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子——單個抗體白介素1相關(guān)受體（single Ig IL-1 related receptor，SIGIRR），其可使IRAK與TRAF6分離，具體機制不明。SIGIRR基因缺陷小鼠感染出血性大腸埃希菌后，其腸上皮細(xì)胞擴增且致炎因子表達(dá)增多，表明SIGIRR可抑制TLR通路［29］。

酪氨酸磷酸酯酶（src-homology-region-2-domaincontaining phosphatase，SHP）可通過抑制TRAF6泛素化從而阻斷TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。實驗表明，SHP敲除小鼠在LPS應(yīng)答中的TNF，可使IL-1β、IL-6表達(dá)增高；骨髓來源細(xì)胞的SHP能保護(hù)SHP缺陷小鼠，防止LPS誘導(dǎo)休克的發(fā)生，表明SHP對TLR4通路有負(fù)調(diào)控作用。進(jìn)一步研究表明，SHP生成依賴于Ca2+依賴的AMP激活蛋白激酶途徑［27］。

2.3.4作用于TLR4通路其他分子黏附/消除病原體的Ⅲ型效應(yīng)蛋白轉(zhuǎn)位緊密黏附素受體（translocatedintimin receptor，Tir）可與細(xì)菌菌膜上的緊密黏附素直接結(jié)合，從而與宿主細(xì)胞的胞膜融合。其有黏附及抹平作用，也可抑制體內(nèi)天然免疫應(yīng)答。Tir與含免疫受體酪氨酸抑制基序（immunoreceptor tyrosine-based inhibition motifs，ITIMs）有相似序列，這種基序在免疫抑制子中常見。Tir被分泌到宿主細(xì)胞內(nèi)，其ITIM樣基序促進(jìn)SHP-1的招募，使NF-κB和MAPK去磷酸化失活；其與TRAF6結(jié)合后可阻斷TRAF6多聚泛素化鏈形成及后續(xù)TAK1的激活；其在胞內(nèi)以Tir-SHP-1-TRAF6復(fù)合體形式抑制NF-κB和MAPK途徑的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［3，30］。

抑制性鋅指蛋白Traid3A是有E3泛素化連接酶活性的環(huán)指蛋白，包含TIR結(jié)構(gòu)域。Traid3A隨TRAF3的減少而增多，且其作用具有劑量依賴性。Traid3A過量表達(dá)促進(jìn)了TLR4的降解；也可使TRAF3第48位的賴氨酸位點泛素化，導(dǎo)致TRAF3的構(gòu)型翻轉(zhuǎn)及第396位的絲氨酸位點磷酸化，從而抑制IRF3的激活［3，20］。

3　小結(jié)

綜上所述，TLR4介導(dǎo)的天然免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分為三步：首先LPS誘導(dǎo)TLR4二聚體化，然后通過MyD88依賴和非依賴途徑招募銜接蛋白，最終導(dǎo)致核因子活化和促炎因子基因的表達(dá)。由于LPS誘導(dǎo)炎癥因子的過度釋放導(dǎo)致膿毒癥、感染性休克等危重癥的發(fā)生，LPS/TLR4通路的負(fù)調(diào)控策略成為研究熱點。根據(jù)TLR4通路的不同階段，可將現(xiàn)有負(fù)調(diào)控因子分為三類：一是TLR4表達(dá)抑制劑，如阿托伐他汀、miRNA let-7i等；二是TLR4二聚體化抑制劑，如MPLA、姜黃素等；三是TLR4通路分子抑制因子，如Gas6、Traid3A等。對上述TLR4通路負(fù)調(diào)控因子中抑制作用明顯、機制明確的分子進(jìn)行體內(nèi)外藥效學(xué)研究、結(jié)構(gòu)改造等深入探索，有助于研發(fā)新的TLR4通路靶向藥物，為治療G-菌感染導(dǎo)致的感染性休克、膿毒癥，以及腫瘤、自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡等提供新的候選藥物。

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國家自然科學(xué)基金資助項目（81202325）。

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（2016-05-22）