王健君綜述，鐘樹志，李曉敏審校（皖南醫(yī)學(xué)院：.組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室；2.病理學(xué)教研室，安徽蕪湖24002）

Legumain在惡性腫瘤中的表達(dá)及意義*

王健君1綜述，鐘樹志1，李曉敏2△審校
（皖南醫(yī)學(xué)院：1.組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室；2.病理學(xué)教研室，安徽蕪湖241002）

天冬酰胺；腫瘤；內(nèi)皮細(xì)胞；巨噬細(xì)胞；腫瘤侵潤(rùn)；細(xì)胞外基質(zhì)；綜述

Legumain又稱天冬酰胺內(nèi)肽酶（asparaginylendopeptidase，AEP），是一種溶酶體半胱氨酸蛋白酶，最初是在豆類植物（legumainous plants）種子中發(fā)現(xiàn)的。隨后在人體也發(fā)現(xiàn)了Legumain，其基因定位于14號(hào)染色體，與動(dòng)脈粥樣硬化、腦退行性變、肝臟纖維化、抗原加工處理等病理生理過程密切相關(guān)。2003年，Liu等［1］最先報(bào)道了Legumain與腫瘤關(guān)系密切，并通過免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)了人乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、卵巢癌及中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤等組織中Legumain的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Legumain在這些腫瘤組織中均呈高表達(dá)，而在相應(yīng)的正常組織中不表達(dá)或表達(dá)水平極低。隨后的研究表明，Legumain在人胃癌［2］、葡萄膜黑色素瘤［3］、橫紋肌肉瘤［4］等惡性腫瘤中也高表達(dá)，其表達(dá)能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、增殖和遷移能力，對(duì)腫瘤微環(huán)境也有重要作用。根據(jù)Legumain能夠特異性地在惡性腫瘤高表達(dá)這一特點(diǎn)，以Legumain為靶點(diǎn)進(jìn)行的腫瘤疫苗研制、腫瘤體內(nèi)成像和藥物靶向性研究等也取得了一些進(jìn)展。本文就Legumain在惡性腫瘤組織中的表達(dá)特點(diǎn)、意義及相關(guān)靶向性研究作一綜述。

1　Legumain在惡性腫瘤中的表達(dá)及作用

1.1Legumain在惡性腫瘤組織中高表達(dá)的原因及機(jī)制腫瘤組織普遍存在的缺氧環(huán)境是Legumain高表達(dá)的主要原因［5］，這也解釋了最初發(fā)現(xiàn)Legumain在多種腫瘤組織中高表達(dá)，而在體外培養(yǎng)的相應(yīng)腫瘤細(xì)胞株中卻不表達(dá)的原因［1］，缺氧條件下培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞則能夠誘導(dǎo)Legumain高表達(dá)。此外，在細(xì)胞內(nèi)存在天然的半胱氨酸蛋白酶抑制物E/M（cystatin E/M），又稱Cystatin 6（CST6），其在腫瘤組織內(nèi)表達(dá)缺失也是Legumain高表達(dá)的原因之一［6-7］。為探討Legumain在腫瘤組織內(nèi)表達(dá)水平增高的分子機(jī)制，Yamane等［8］通過計(jì)算機(jī)分析及染色質(zhì)免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了p53與人Legumain基因內(nèi)含子1區(qū)域存在結(jié)合位點(diǎn)，通過體外培養(yǎng)人大腸癌細(xì)胞HCT116和人肺癌細(xì)胞H1299，分別沉默和上調(diào)p53基因的表達(dá)，證實(shí)p53可在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控Legumain的表達(dá)。同樣，在對(duì)乳腺癌的研究中也發(fā)現(xiàn)p53與Legumain的表達(dá)呈正相關(guān)［9］。此外，有研究表明，Legumain也是核質(zhì)內(nèi)第二信使Ca2+調(diào)控細(xì)胞增殖的靶基因之一，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，Legumain啟動(dòng)子區(qū)可能存在轉(zhuǎn)錄因子Elk-1的結(jié)合位點(diǎn)，核質(zhì)內(nèi)Ca2+可能是通過Elk-1調(diào)控Legumain表達(dá)［10］。

1.2Legumain在惡性腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)特點(diǎn)及臨床意義在人大腸癌、前列腺癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌等惡性腫瘤組織高表達(dá)的Legumain與患者的不良預(yù)后相關(guān)，Legumain是判斷患者預(yù)后和總體生存率的新型標(biāo)記物。有學(xué)者進(jìn)一步研究了人惡性腫瘤細(xì)胞Legumain免疫組化陽性染色方式及部位與患者預(yù)后的關(guān)系。Gawenda等［11］在人浸潤(rùn)性乳腺癌組織中觀察到Legumain在乳腺癌細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的陽性表達(dá)方式有3種：彌漫性（diffuse）、細(xì)點(diǎn)狀（tiny dots）和囊泡狀（vesicles），其中呈囊泡狀陽性與患者的不良預(yù)后相關(guān)，而呈彌漫性陽性與細(xì)點(diǎn)狀陽性與患者的預(yù)后并不具有相關(guān)性。Ohno等［12］在前列腺癌手術(shù)切除標(biāo)本的免疫組化染色中同樣觀察到Legumain在腫瘤細(xì)胞質(zhì)中有彌漫性和囊泡狀2種陽性表達(dá)方式，表現(xiàn)為囊泡狀陽性的腫瘤常同時(shí)具有包膜侵犯、神經(jīng)侵犯、Gleason評(píng)分高的特征，并且患者生存率明顯低于彌漫性陽性者。最近，有研究在人結(jié)腸癌手術(shù)切除標(biāo)本中觀察到Legumain除在腫瘤細(xì)胞質(zhì)表現(xiàn)為彌漫性或顆粒狀（granulated）陽性外，大約30%的結(jié)腸癌標(biāo)本Legumain陽性表達(dá)于腫瘤細(xì)胞核 （nuclear），統(tǒng)計(jì)分析表明，腫瘤細(xì)胞核陽性的患者總體生存率明顯降低，而腫瘤細(xì)胞質(zhì)顆粒狀與彌漫性陽性患者生存率并無差異［13］。Legumain在腫瘤細(xì)胞的陽性表達(dá)方式有望成為預(yù)測(cè)惡性腫瘤患者預(yù)后的標(biāo)記物，但需要更多的研究進(jìn)一步支持并驗(yàn)證這種相關(guān)性。

1.3Legumain在腫瘤微環(huán)境中的表達(dá)及作用腫瘤微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞賴以生長(zhǎng)的復(fù)雜環(huán)境，包括腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)及多種細(xì)胞成分，如腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophages，TAM）、成纖維細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞等，腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境之間相互作用共同促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移［14］。Legumain在腫瘤微環(huán)境中的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞中也高表達(dá)。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，屬于M2型巨噬細(xì)胞，通過分泌多種生長(zhǎng)因子、血管生成因子、蛋白酶等促進(jìn)腫瘤基質(zhì)重構(gòu)、新生血管生成、腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移。Solberg等［15］在體外誘導(dǎo)單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化過程中觀察到Legumain的表達(dá)升高，特別是在M2型巨噬細(xì)胞中的表達(dá)更顯著。Luo等［16］發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞高表達(dá)Legumain，而起到免疫監(jiān)視和抗原提呈作用的M1型巨噬細(xì)胞則不表達(dá)Legumain，由于這一表達(dá)特點(diǎn)，靶向Legumain殺傷腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的藥物不會(huì)干擾M1型巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒反應(yīng)及抗原提呈等生物學(xué)功能。吳文苑等［17］為研究腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)的Legumain對(duì)血管內(nèi)皮的影響，在低氧條件下培養(yǎng)人血管內(nèi)皮細(xì)胞株HUVEC，使Legumain高表達(dá)，血管內(nèi)皮細(xì)胞的管腔形成增多，表明在腫瘤組織血管內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)的Legumain可能促進(jìn)腫瘤新生血管的形成，改善腫瘤血供，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。

1.4Legumain高表達(dá)對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞的作用及機(jī)制Legumain在惡性腫瘤組織的表達(dá)增高主要起到促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移的作用。Wu等［9］對(duì)人乳腺癌切除標(biāo)本通過免疫組化方法觀察到乳腺癌細(xì)胞Legumain的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，認(rèn)為L(zhǎng)egumain可能參與了乳腺癌的轉(zhuǎn)移過程。同樣，國(guó)內(nèi)吳文苑等［17］體外培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞系MDA MB231，在不同濃度Legumain蛋白的作用下，隨著Legumain蛋白濃度的增加，乳腺癌細(xì)胞的遷移能力明顯增強(qiáng)。在體外培養(yǎng)的胃癌［2］和卵巢癌［18］細(xì)胞中，也同樣觀察到Legumain過表達(dá)能夠促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的遷移及浸潤(rùn)。Li等［2］進(jìn)一步通過制備穩(wěn)定過表達(dá)Legumain的裸鼠胃癌腫瘤模型，注射給予Legumain抑制劑（APEI）抑制Legumain表達(dá)，證實(shí)Legumain在體內(nèi)也能夠明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。Legumain促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移的機(jī)制目前仍不明確，研究認(rèn)為，Legumain主要通過蛋白水解作用活化組織蛋白酶［19］，如組織蛋白酶B、L（cathepsins B、L），降解腫瘤基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移。此外，在多種惡性腫瘤組織中，Legumain的表達(dá)與基質(zhì)金屬蛋白-2（MMP-2）的表達(dá)及活性也呈正相關(guān)［1-2］，但Legumain能否直接調(diào)控MMP-2的表達(dá)及活化仍需進(jìn)一步研究。除MMP-2外，另一備受關(guān)注的分子為整合素，在遷移中的大腸癌、乳腺癌等惡性腫瘤細(xì)胞前端均發(fā)現(xiàn)Legumain與整合素有重疊［1，9］，Legumain可能通過整合素途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移及轉(zhuǎn)移。

雖然Legumain在體內(nèi)能夠促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)，但對(duì)體外培養(yǎng)的胃癌及卵巢癌細(xì)胞卻沒有促進(jìn)增殖的作用［2，18］，這可能與腫瘤在體內(nèi)及體外的生長(zhǎng)環(huán)境不同有關(guān)。但是，Andrade等［10］在體外培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞系SKHep1，通過RNA干擾（RNAi）技術(shù)沉默Legumain的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖受到明顯抑制，并且通過Legumain抑制劑抑制Legumain活性后，并未影響Legumain促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的作用，認(rèn)為L(zhǎng)egumain促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的作用是獨(dú)立于其蛋白水解酶活性之外的，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Legumain基因沉默抑制腫瘤細(xì)胞增殖是由于影響了細(xì)胞周期，減少了處于G2/M期細(xì)胞的比例，而不是通過促進(jìn)凋亡作用。而吳文苑等［20］的研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)能夠穩(wěn)定過表達(dá)Legumain的人胚胎腎細(xì)胞株HEK293，應(yīng)用腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和放線菌酮（CHX）共同誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，表明Legumain過表達(dá)能夠抑制凋亡。D′Costa等［7］也在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，Legumain過表達(dá)能夠抑制體外培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖。因此，Legumain在體外是否具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及抑制凋亡的作用仍存在不同觀點(diǎn)。

2　Legumain在腫瘤診斷成像技術(shù)中的應(yīng)用

腫瘤診斷成像技術(shù)主要包括磁共振成像（MRI）、正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描（PET）、X射線斷層掃描光影像（CT）、超聲造影、熒光分子成像等［21］。利用熒光探針對(duì)腫瘤早期病變進(jìn)行靶向性識(shí)別和診斷是研究的熱點(diǎn)。已有多項(xiàng)研究以Legumain為靶點(diǎn)進(jìn)行熒光探針的開發(fā)。Edginfton等［22］設(shè)計(jì)開發(fā)了基于Legumain活性的熒光標(biāo)記探針，能夠與Legumain特異性共價(jià)結(jié)合而發(fā)出熒光，實(shí)現(xiàn)體內(nèi)腫瘤的無創(chuàng)性成像，更具特異性和有效性。此外，Chen等［23］開發(fā)了一種新型的MRI對(duì)比劑和近紅外熒光探針，能夠增強(qiáng)表達(dá)Legumain腫瘤的成像。而Jiang等［24］基于分子動(dòng)力學(xué)模擬方法設(shè)計(jì)了熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）探針，用于檢測(cè)體內(nèi)Legumain，能夠靈敏地檢測(cè)早期腫瘤。

3　以Legumain為靶點(diǎn)研制腫瘤基因疫苗

基因疫苗是將編碼抗原的基因通過載體導(dǎo)入體內(nèi)，使其在一定時(shí)限內(nèi)能持續(xù)表達(dá)抗原蛋白，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，達(dá)到防病治病的作用。由于基因疫苗可以激活細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞而誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，因此是抗腫瘤免疫領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。近年來，有研究針對(duì)Legumain進(jìn)行了抗腫瘤基因疫苗的研制。Smahel等［25］為提高Legumain基因疫苗誘導(dǎo)的有效免疫效應(yīng)，對(duì)Legumain基因進(jìn)行了一些修改，首先，使Legumain保守序列RGD序列突變?yōu)镚GD或RGG，然后插入破傷風(fēng)毒素p30表位，從而減少了成熟Legumain的產(chǎn)生，增強(qiáng)了免疫原性，通過基因槍給藥后，顯著增強(qiáng)了機(jī)體對(duì)legumain的免疫應(yīng)答反應(yīng)。而Lewēn等［26］構(gòu)建了編碼Legumain的H-2D 和H-2K的小基因病毒表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染入鼠傷寒沙門菌中制成疫苗，可口服給藥，小基因疫苗具有與全基因疫苗相似的抗腫瘤效果，能夠抑制小鼠乳腺癌的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移，且比全基因疫苗更具有靈活性。Karyampudi等［27］為解決腫瘤微環(huán)境普遍存在的免疫抑制作用對(duì)基因疫苗誘導(dǎo)的免疫效應(yīng)的消減問題，提出聯(lián)合用藥能夠增強(qiáng)疫苗的抗腫瘤效應(yīng)，針對(duì)腫瘤抑制免疫的主要機(jī)制PD-1/B7-H1抑制軸，應(yīng)用抗PD-1抗體和包括Legumain在內(nèi)的多肽疫苗聯(lián)合給藥觀察其對(duì)小鼠乳腺癌的治療作用，發(fā)現(xiàn)這種方法能提高抗腫瘤免疫效應(yīng)，延長(zhǎng)小鼠的生存期，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

4　開發(fā)Legumain激活的抗腫瘤前體藥物

化療藥物由于對(duì)細(xì)胞沒有選擇性而常導(dǎo)致一些不良反應(yīng)，如心臟、腎臟損害、骨髓抑制、脫發(fā)等，Legumain是人體內(nèi)唯一一種天冬酰胺肽鏈內(nèi)切酶，在腫瘤組織特異性高表達(dá)，而正常組織不表達(dá)，這一表達(dá)特點(diǎn)為化療藥物的靶向性研究提供了新思路。Smith等［28］設(shè)計(jì)合成了秋水仙素的前體藥物，能夠被Legumain特異性地裂解而激活，不但提高腫瘤細(xì)胞對(duì)前體藥物的攝取率，而且高濃度藥物集中在癌灶內(nèi)也降低了對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用，增強(qiáng)抗癌活性，改善腫瘤患者對(duì)藥物的耐受性。Liu等［29］設(shè)計(jì)合成了有絲分裂抑制劑E（MMAE）的前體藥物8，該前體藥物能夠與腫瘤細(xì)細(xì)胞膜表面高表達(dá)的糖蛋白整合素αvβ3相連，并被Legumain催化為有活性的MMAE，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中能有效抑制乳腺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，并且對(duì)白細(xì)胞的毒性極低。此外，Liu等［30］通過改造攜帶化療藥物的載體以實(shí)現(xiàn)藥物高效、特異性地靶向腫瘤，他們?cè)O(shè)計(jì)開發(fā)了一種Legumain蛋白激活的AANTAT-脂質(zhì)體載體，該脂質(zhì)體所攜帶的AAN為L(zhǎng)egumain的底物丙氨酸-丙氨酸-天冬酰胺，TAT為一種細(xì)胞穿膜肽，能攜帶大分子物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，AAN的添加使TAT的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力下降，通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在腫瘤部位高表達(dá)的Legumain的催化下，TAT脂質(zhì)體能夠被釋放并恢復(fù)穿膜能力，進(jìn)入腫瘤細(xì)胞發(fā)揮殺癌效應(yīng)，為提高抗癌藥物的靶向性、高效性、低毒性提供了一種新方法。

綜上所述，Legumain作為一種新發(fā)現(xiàn)的與腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的蛋白酶，對(duì)腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境都有重要的作用，進(jìn)一步闡明Legumain在腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制，以及Legumain表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，可為惡性腫瘤的診斷、治療和預(yù)防提供新的靶點(diǎn)。

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10.3969/j.issn.1009-5519.2016.07.021

A

1009-5519（2016）07-1021-04

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（2015-12-08）