陳信忠袁芳許奕宸郭書林龔艷清楊俊萍

（1.廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局福建廈門361026；2.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院）

七彩神仙魚和神仙魚的DNA條形碼研究

陳信忠1袁芳2許奕宸2郭書林1龔艷清1楊俊萍1

（1.廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局福建廈門361026；2.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院）

應(yīng)用通用引物測(cè)定了觀賞魚市場(chǎng)上具有較高價(jià)值的7個(gè)品系七彩神仙魚和3個(gè)品系神仙魚的16S rRNA基因和CO I基因部分序列，并應(yīng)用DNA序列分析軟件，對(duì)這些基因進(jìn)行了同源性比較和系統(tǒng)發(fā)育分析。通過GenBank中的核酸BLAST和BOLD SYSTEMS數(shù)據(jù)庫對(duì)這些基因序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明16S rRNA基因和CO I基因可以在物種水平對(duì)神仙魚進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，但對(duì)七彩神仙魚只能進(jìn)行有限度的鑒別。由于不同品系的七彩神仙魚或神仙魚，盡管其體色和斑紋具有明顯差異，但16S rRNA基因和CO I基因序列高度相似。因此，對(duì)這些觀賞魚依靠16S rRNA基因或CO I基因都無法準(zhǔn)確鑒定，需要研究進(jìn)化速度更快的DNA基因條碼。

基因條碼；七彩神仙魚；神仙魚；物種鑒定；16S rRNA；CO I

1 前言

觀賞魚是近年來全球蓬勃興起和快速發(fā)展的產(chǎn)業(yè)，2013年我國(guó)觀賞魚的規(guī)模已發(fā)展到36.9億尾[1]，成為發(fā)展?jié)摿ψ畲蟮男屡d產(chǎn)業(yè)之一。七彩神仙魚（Symphysodon sp）和神仙魚（Pterophyllum sp）是觀賞魚市場(chǎng)上最常見的兩種慈鯛，因其色彩斑斕、體態(tài)飄逸優(yōu)雅而深受觀賞魚愛好者的喜愛。神仙魚又稱天使魚，原產(chǎn)于南美洲亞馬遜水域及其支流，已知的野生種類有大神仙魚（P.scalare）、埃及神仙魚（P.altum）和利氏神仙魚（P.leopordi）。七彩神仙魚又稱盤麗魚，原產(chǎn)于巴西、哥倫比亞和委內(nèi)瑞拉的熱帶雨林河流中，已知的野生種類有黑格爾七彩神仙魚（S.discus）、野生棕七彩神仙魚（S.aequifasciatus）和野生藍(lán)七彩神仙魚（S.haraldi）；人工繁育的七彩神仙魚主要有蛇紋七彩、全色藍(lán)七彩、紅點(diǎn)綠七彩、鴿子紅七彩、全色紅七彩、條紋松石七彩和黃金七彩等品系，不同品系七彩神仙魚的區(qū)別主要表現(xiàn)在魚身的花紋和色彩方面，魚體的形態(tài)基本相似[2]。神仙魚和七彩神仙魚經(jīng)過長(zhǎng)期的人工選育、雜交等改良，已培育了許多絢麗多彩的品系，目前水族館中的神仙魚和七彩神仙魚大多為人工繁育的品系，因其色彩和斑紋具有明顯差異，欣賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值也有巨大差別。而不同品系的觀賞魚幼體階段很難依據(jù)形態(tài)進(jìn)行鑒別，因此，需要建立其他準(zhǔn)確快速的鑒別方法。

由于形態(tài)學(xué)分類方法的局限性，近年來越來越多的分子生物學(xué)方法被應(yīng)用到魚類物種鑒定中，其中應(yīng)用最廣泛的DNA條形碼技術(shù)不僅可以鑒定已知物種，而且可以發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)分類學(xué)方法無法鑒定的新物種和隱存種。該技術(shù)由Hebert等于2003年首次提出，主要利用一段短的DNA序列來實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確和自動(dòng)化的物種鑒定標(biāo)記[3，4]。2004年魚類生命條形碼計(jì)劃（Fish Barcode of Life，F(xiàn)ISH-BOL）啟動(dòng)，建立了魚類DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，重點(diǎn)收集15000種海水魚類的DNA條形碼。隨后的研究中，CO I基因和16S rRNA基因被證明是物種鑒別較為理想的基因條碼，被廣泛應(yīng)用于海洋魚類的鑒定。2009年1月，國(guó)際生命條形碼計(jì)劃（International Barcode of Life，IBOL）啟動(dòng)，建立了生命條形碼數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)（Barcode of Life Data Systems，BOLD）。隨后建立了“海洋生物條形碼組織”（Marine barcode of life，MarBOL），收錄了6199個(gè)海洋物種的37182個(gè)條形碼信息[5]。由于絕大多數(shù)觀賞魚野生物種均來自非洲三大湖和南美洲亞馬遜河流域，對(duì)這些物種的基因條碼研究報(bào)告很少，有關(guān)神仙魚和七彩神仙魚的基因條碼研究也很少。程磊等（2012）研究了鯽屬（Carassius）某些種和亞種中的CO I基因變異，發(fā)現(xiàn)歐亞大陸與日本列島的鯽魚（C.auratus）有明顯分化，銀鯽（C.auratus gibelio）應(yīng)被視為鯽的一個(gè)亞種，而不是一個(gè)有效物種[6]。王茜等（2014）報(bào)告了天津地區(qū)養(yǎng)殖的4種鯉科魚類的CO I基因部分序列，認(rèn)為CO I基因不但可以作為物種辨識(shí)的良好DNA條碼，而且在鯉科魚類的種間系統(tǒng)發(fā)生方面也具有一定的適用性[7]。本文對(duì)觀賞魚市場(chǎng)上常見的兩種10個(gè)品系的觀賞魚進(jìn)行研究，以探討基因條碼在這些觀賞魚品種鑒別中的應(yīng)用價(jià)值。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

實(shí)驗(yàn)所用的神仙魚和七彩神仙魚均購自廈門市水族館，其中神仙魚包括黑神仙魚、金頭神仙魚和熊貓神仙魚等3個(gè)品系，七彩神仙魚包括全色紅七彩神仙魚、紅松石七彩神仙魚、藍(lán)松石七彩神仙魚、全色藍(lán)七彩神仙魚、黃金七彩神仙魚、紅點(diǎn)黃金七彩神仙魚和天子藍(lán)七彩神仙魚等7個(gè)品系。每一個(gè)品系選擇具有相同形態(tài)、體色和斑紋的10條魚進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 儀器

Veriti PCR儀：美國(guó)ABI公司；臺(tái)式冷凍離心機(jī)：美國(guó)Thermo公司；FlashGel閃膠系統(tǒng)：Lonza公司。

2.1.3 試劑

動(dòng)物組織基因組提取試劑盒：Tiangen公司。

2.2 方法

2.2.1 DNA提取

用潔凈解剖刀和剪刀取魚體背部肌肉約100 mg，按照試劑盒方法提取DNA；提取的DNA置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?；取完樣的魚樣品置于-70℃超低溫冰箱中保存。

2.2.2 PCR引物

擴(kuò)增觀賞魚16S rRNA的引物參考Palumbi（1996）報(bào)告的方法[8]，上游引物序列為16Sar-5：5’-CGC CTG TTT ATC AAA AAC AT-3’，下游引物序列為16Sbr-3：5’-CCG GTC TGA ACT CAG ATC ACG T-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)約590 bp；擴(kuò)增CO I的引物參考Ivanova（2007）報(bào)告的方法[9]，上游引物序列為FF2d：5’-TTC TCC ACC AAC CAC AAR GAY ATY GG-3’，下游引物序列為FR1d：5’-CAC CTC AGG GTG TCC GAA RAA YCA RAA-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)約680 bp。

2.2.3 PCR擴(kuò)增

采用50 μL反應(yīng)體系，即在PCR反應(yīng)管中加入17.5 μL超純水，5 μL模板DNA，25 μL2×Taq PCR MasterMix（包含Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反應(yīng)緩沖液、PCR反應(yīng)的增強(qiáng)劑和優(yōu)化劑以及穩(wěn)定劑），引物（20 μmol/L）各1.25 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋合?5℃預(yù)變性1 min，然后95℃15 s、52℃（擴(kuò)增CO I基因）或54℃（擴(kuò)增16S rRNA基因）15 s、72℃30 s共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7 min，4℃保存。

2.2.4 電泳

為確認(rèn)擴(kuò)增效果，將擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行電泳。采用LONZA閃膠系統(tǒng)（FlashGelTMDNA System），在預(yù)制好的含有緩沖液的瓊脂凝膠，加入樣品和標(biāo)記（Marker），觀察結(jié)果。

2.2.5 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列測(cè)定

擴(kuò)增產(chǎn)物純化后送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測(cè)序。

2.2.6 DNA序列分析

利用chromas軟件和CLUSTAL X軟件對(duì)CO I基因和16S rRNA基因測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接和分析。應(yīng)用MEGA軟件[10]，選擇Kimura-2參數(shù)模型制作系統(tǒng)發(fā)育樹，計(jì)算遺傳距離。系統(tǒng)分析采用鄰接法（neighbor-joining，NJ），發(fā)育樹采用重復(fù)抽樣分析（Bootstrap）1000次檢驗(yàn)各分枝的置信度。

2.2.7 數(shù)據(jù)庫比對(duì)

將測(cè)序所得到的16S rRNA基因和CO I基因序列在GenBank和BOLD SYSTEMS數(shù)據(jù)庫中搜索相似序列，進(jìn)行鑒定結(jié)果分析。

3 結(jié)果

3.116 S rRNA基因和CO I基因檢測(cè)結(jié)果

神仙魚和七彩神仙魚的16S rRNA基因和CO I基因檢測(cè)結(jié)果表明，上述兩對(duì)引物均能很好地?cái)U(kuò)增相應(yīng)的基因片段。3個(gè)品系神仙魚的組內(nèi)序列基本一致，差異不超過1個(gè)堿基。在7個(gè)品系的七彩神仙魚中，全色藍(lán)七彩和全色紅七彩的品系內(nèi)基因序列完全一致；紅松石七彩神仙魚、藍(lán)松石七彩神仙魚、黃金七彩神仙魚和紅點(diǎn)黃金七彩神仙魚的品系內(nèi)序列基本一致，有1-2個(gè)堿基的差異；而天子藍(lán)七彩神仙魚的序列存在較大的組內(nèi)變異，存在3-4個(gè)堿基的差異。

上述神仙魚和七彩神仙魚的16S rRNA和CO I基因序列已登錄GenBank，其登錄號(hào)見表1。

表1 神仙魚和七彩神仙基因GenBank登錄號(hào)

3.216 S rRNA基因的同源性分析

3.2.1 神仙魚16S rRNA基因的同源性分析

3個(gè)品系神仙魚的16S rRNA序列與大神仙魚（KP987118.1）完全相同，與埃及神仙魚（KT180164.1）的同源性為96.63%。因此，可以確認(rèn)這3個(gè)品系的神仙魚均來自大神仙魚，但依據(jù)16S rRNA序列顯然無法區(qū)分不同品系的神仙魚。

3.2.2 七彩神仙魚16S rRNA基因的同源性分析

7個(gè)品系七彩神仙魚16S rRNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示。全色紅七彩神仙魚、紅松石七彩神仙魚和天子藍(lán)七彩神仙魚的16S rRNA序列與Genbank中的S.haraldi（NC_027965.1）完全相同而聚成一支；藍(lán)松石七彩神仙魚、黃金七彩神仙魚、紅點(diǎn)黃金七彩神仙魚的16S rRNA序列完全相同，聚成另一支，該序列與S.haraldi（NC_027965.1）的同源性為99.10%；全色藍(lán)神仙魚單獨(dú)成為一支，與3種野生七彩神仙魚均有一定的距離。

圖1 基于16S rRNA基因序列的七彩神仙魚系統(tǒng)發(fā)育樹

7個(gè)品系的七彩神仙魚與3種野生七彩神仙魚基于16S rRNA序列的遺傳距離見表2，所有七彩神仙魚之間的遺傳距離均小于0.010。因此，依據(jù)16S rRNA序列顯然難以判定這些品系的來源，也無法區(qū)分不同品系的七彩神仙魚。

表2 七彩神仙魚基于16S rRNA基因的遺傳距離

3.3 CO I基因的同源性分析

3.3.1 神仙魚CO I基因同源性分析

神仙魚基于CO I基因的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。黑神仙魚和金頭神仙魚最接近，兩者僅有1個(gè)堿基的差異，與熊貓神仙魚的差異也很小。3個(gè)品系的神仙魚與大神仙魚聚成一支，與埃及神仙魚相距較遠(yuǎn)。3個(gè)品系的神仙魚與大神仙魚和埃及神仙魚基于16S rRNA序列的遺傳距離見表3。從表3可以看出，3個(gè)品系的神仙魚均來自大神仙魚，其中熊貓神仙進(jìn)化速度更快。表明通過CO I基因條碼可以對(duì)上述3個(gè)品系的神仙魚進(jìn)行有限區(qū)分，但因?yàn)椴町愝^小，難以進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別。

圖2 基于CO I基因序列的神仙魚系統(tǒng)發(fā)育樹

表3 神仙魚基于CO I基因的遺傳距離

3.3.2 七彩神仙魚的CO I基因同源性分析

七彩神仙魚基于CO I基因的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。藍(lán)松石七彩神仙魚、紅松石七彩神仙魚、紅點(diǎn)黃金七彩神仙魚、黃金七彩神仙魚等4個(gè)品系的CO I基因序列完全相同；全色藍(lán)七彩神仙魚和天子藍(lán)七彩神仙魚的CO I基因序列完全相同；全色紅七彩神仙魚與其他品系的CO I基因序列都存在差異。表明人工繁育的七彩神仙魚與野生種類相比，其CO I基因已經(jīng)出現(xiàn)一定的進(jìn)化，而且不同品系的進(jìn)化速度明顯不同。

圖3 基于CO I基因序列的七彩神仙魚系統(tǒng)發(fā)育樹

表4為七彩神仙魚與3種野生七彩神仙魚基于CO I基因的遺傳距離分析。表4顯示，全色藍(lán)七彩和天子藍(lán)七彩與3種野生七彩神仙魚的遺傳距離最大，分別達(dá)到0.020、0.020和0.019，與其他品系的七彩神仙魚的遺傳距離也達(dá)到0.017；全色紅七彩神仙魚與S.haraldi、S.discus的遺傳距離最小，只有0.003；藍(lán)松石七彩神仙魚等4個(gè)品系的七彩神仙魚與其他七彩神仙魚均有一定的遺傳距離。因此，通過CO I基因序列分析，可以對(duì)人工繁育的不同品系的七彩神仙魚進(jìn)行有限的區(qū)分，尚無法對(duì)所有品系進(jìn)行鑒別。

表4 七彩神仙魚基于CO I基因的遺傳距離

3.4 在GenBank和BOLDSystem數(shù)據(jù)庫中的搜索結(jié)果

神仙魚和七彩神仙魚的16S rRNA和CO I基因在GenBank和BOLDSystem數(shù)據(jù)庫中的搜索結(jié)果見表5。3個(gè)品系的神仙魚均可以確定為大神仙魚，兩個(gè)數(shù)據(jù)庫的搜索結(jié)果基本相同。7個(gè)品系的七彩神仙魚在BOLDSystem數(shù)據(jù)庫中的搜索結(jié)果排在第一位的均為黑格爾七彩神仙魚，而且相似度均達(dá)到100%，但與其他兩種野生七彩神仙魚的同源性也大于98%；而在GenBank的搜索結(jié)果，所有7個(gè)品系的七彩神仙魚的16S rRNA和CO I基因與3種野生七彩神仙魚的同源性均大于98%。因此，無法根據(jù)16S rRNA或CO I基因條碼對(duì)七彩神仙魚進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。

表5 16S rRNA基因和CO I基因與數(shù)據(jù)庫相關(guān)序列比對(duì)結(jié)果

4 討論

4.1 神仙魚和七彩神仙魚DNA條形碼測(cè)定的有效性

Hebert等（2003）通過對(duì)13320個(gè)物種進(jìn)行遺傳距離統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)大部分物種的種內(nèi)遺傳距離小于2%，一般都小于1%[3]。因此認(rèn)為CO I基因可以有效地進(jìn)行物種鑒定的關(guān)鍵在于物種間的遺傳距離大于種內(nèi)遺傳距離，即物種的種內(nèi)CO I序列的遺傳距離一般小于1%，而種間遺傳距離通常大于2%。由于魚類屬于比較低等的脊椎動(dòng)物，常常因?yàn)樯巢煌斐傻牡乩砀綦x形成很多形態(tài)表觀特征具有明顯不同的種類，依據(jù)形態(tài)學(xué)的分類方法存在大量的同物異名、一種多名現(xiàn)象，但這些魚類在人工條件下往往可以進(jìn)行雜交繁育下一代。因此，雖然很多觀賞魚經(jīng)過人類不斷的培育和改良，形成了大量體態(tài)、體色、斑紋等完全不同的品系，但這種遺傳相對(duì)不夠穩(wěn)定，容易受環(huán)境和餌料等因素的影響，需要經(jīng)過幾十代或者更多的繁育才可能形成相對(duì)穩(wěn)定的色彩和斑紋，而且這些觀賞魚的種內(nèi)遺傳距離均很小。如人工繁育七彩神仙魚的色彩和斑紋主要由其父母代的遺傳特性所決定，不同七彩神仙魚的色彩和斑紋特質(zhì)可以遺傳，但要獲得純系的品系，就必須通過該品系的兄弟姐妹之間進(jìn)行繁殖。

本研究結(jié)果也表明，不同品系的神仙魚或七彩神仙魚的CO I基因序列，其種內(nèi)遺傳距離均小于2%，因此均未形成獨(dú)立的物種，這與傳統(tǒng)分類學(xué)方法得到的結(jié)論一致。

4.2 DNA條形碼在觀賞魚種類鑒定中的局限性

DNA條形碼技術(shù)在魚類鑒定中取得了較好的結(jié)果，但該技術(shù)在應(yīng)用于雜交種、近期分化種、混合種、進(jìn)化速率較低的物種等特殊群體時(shí)還存在諸多問題[5]，實(shí)際上DNA條形碼能否適用于近緣和近期分化的物種確實(shí)存在很大爭(zhēng)議[11]。由于很多高價(jià)值的觀賞魚都是經(jīng)過雜交、選育等人工干涉以后培育的雜交種，這些品種的CO I基因序列差異都比較小。而且，這些觀賞魚的遺傳特性尚不穩(wěn)定，表現(xiàn)在基因序列會(huì)出現(xiàn)一定的變異。本次實(shí)驗(yàn)中的多個(gè)品系神仙魚或七彩神仙魚均存在品系內(nèi)的堿基差異，有些品系的堿基差異還比較大。因此，用CO I基因作為DNA條形碼應(yīng)用到神仙魚和七彩神仙魚等觀賞魚的鑒定中存在明顯的不足，尤其在鑒定七彩神仙魚時(shí)，很難做出準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果。這也從另一方面證明目前七彩神仙魚依據(jù)形態(tài)學(xué)進(jìn)行分類的結(jié)果可能不準(zhǔn)確?，F(xiàn)有的黑格爾七彩神仙魚、野生棕七彩神仙魚和野生藍(lán)七彩神仙魚等3種七彩神仙魚可能尚未分化到物種水平，應(yīng)該都屬于同一個(gè)物種。實(shí)際上，這些七彩神仙魚在人工條件下常?？梢赃M(jìn)行雜交繁育子代，也證明其尚未進(jìn)化到獨(dú)立的物種。

DNA條形碼技術(shù)尚處于快速發(fā)展階段，目前的研究基本上限于物種水平，所研究的基因還很有限。BOLDSystem數(shù)據(jù)庫中的物種基本上都限于自然野生的物種，目前只有CO I基因的數(shù)據(jù)，而CO I條形碼序列對(duì)種以下階元的物種鑒定存在明顯的局限性。由于CO I基因的突變速率相對(duì)線粒體DNA控制區(qū)的要慢[11]，因此若針對(duì)分化程度低的物種，選擇Cytb基因或控制區(qū)基因可能更為有效[12]。故對(duì)于神仙魚和七彩神仙魚等人工干涉較多的物種，應(yīng)該研究進(jìn)化速度更快的基因，如線粒體控制區(qū)的基因作為DNA條形碼。

5 結(jié)論

對(duì)7個(gè)品系七彩神仙魚和3個(gè)品系神仙魚的16S rRNA基因和CO I基因的研究結(jié)果表明，雖然不同品系的七彩神仙魚或神仙魚的體色、斑紋等具有明顯的差異，但其16S rRNA基因和CO I基因序列高度相似而難以有效鑒別，需要研究進(jìn)化速度更快的基因。

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Study on the DNA Barcode of the Discuses and Angelfish

CHEN Xinzhong1，YUAN Fang2，XU Yichen2，GUO Shulin1，GONG Yanqing1，YANG Junping1
（1.Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Xiamen，F(xiàn)ujian，361026；
2.Fisheries College of Jimei University）

The discuses（Symphysodon sp）and angelfish（Pterophyllum sp）were ornamental fishes which had high economic value.Partial sequence of 16S rRNA gene and mitochondrial cytochrome oxidase subunit I（CO I）gene from 7 lines of discuses and 3 of angelfish which had higher value in the market had been amplified using universal primers.The homology and phylogenetic analysis of these genes were carried out by using DNA sequence analysis software.The gene sequence had been compared with the database of GenBank and BOLD SYSTEMS.The phylogenetic tree had been established based on the 16S rRNA gene and the CO I gene.Sequence analysis showed that the 16S rRNA and CO I genes can be used to identify the angelfish accurately in specie level，but it had only limited function in discrimination for discuses.Because of the high similarity of sequences between the different lines of discuses or angelfish，although it had obvious difference in body color and stripes，it is difficult to identify these fishes based on the 16S rRNA or CO I gene.The DNA barcode which had higher rate of evolution should be studied.

Gene Barcode；Discuses；Angelfish；Species Identification；16S rRNA；CO I

Q179；Q523.8

E-mail：chenxz@xmciq.gov.cn

福建省海洋經(jīng)濟(jì)發(fā)展專項(xiàng)（2015N0015）

2016-10-26