張可靜，李桃紅，金雨虹，徐赤裔

肺上皮細(xì)胞鈣超載在急性呼吸窘迫綜合征發(fā)生中的機制研究

張可靜，李桃紅，金雨虹，徐赤裔

目的 細(xì)胞水平上闡明鈣敏感受體（CaSR）介導(dǎo)的鈣超載在急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）中的可能作用和機制。方法 肺泡上皮細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞在不同脂多糖（LPS）濃度分別以不同時間處理；選擇Fluo-4熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度；加入相應(yīng)的siRNA和混雜對照后，Western blotting測定CaSR蛋白含量。結(jié)果 LPS對細(xì)胞增殖的抑制作用呈現(xiàn)劑量和時間依賴性。加用LPS后，細(xì)胞內(nèi)的熒光含量增加；siRNA的加入，使得CaSR蛋白含量下降，同時增加的熒光含量也下降，LPS誘發(fā)的抑制細(xì)胞生長作用被逆轉(zhuǎn)。結(jié)論 實驗首次發(fā)現(xiàn)肺上皮細(xì)胞上有CaSR的表達；LPS對肺泡上皮細(xì)胞增殖存在影響；CaSR的活化可以抑制細(xì)胞的生長。

鈣敏感受體；肺上皮細(xì)胞；急性呼吸窘迫綜合征

急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是臨床常見的呼吸系統(tǒng)急危重癥，病死率高。目前尚無特效治療手段，其原因很大程度在于對其發(fā)病機制缺乏詳細(xì)、深入了解。因此，揭示ARDS的發(fā)病機制，以及在此基礎(chǔ)上，在疾病早期采取有效措施進行防治，已成為進一步提高ARDS治療效果的關(guān)鍵。以往相關(guān)研究更多集中在內(nèi)皮細(xì)胞、肺上皮細(xì)胞是否存在鈣超載現(xiàn)象，目前尚不清楚。本研究就肺上皮細(xì)胞鈣敏感受體（CaSR）蛋白表達，與ARDS的關(guān)系進行了探討，報道如下。

1 資料與方法

1.1 材料 A549細(xì)胞（ATCC，美國）；脂多糖、單克隆抗肌動蛋白、CaSR（Sigma公司，西班牙）；Fluo-4熒光探針、脂質(zhì)體-2000（Invitrogen公司，英國）；siRNA，包括混雜對照（Ambion，英國）；CCK-8試劑盒（Dojindo實驗室，日本）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞以杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM）培養(yǎng)基（含10%熱滅活胎牛血清，100U/ml的青霉素和100g/ml鏈霉素）保存，在二氧化碳培養(yǎng)箱[1]。培養(yǎng)基1周更換2次，細(xì)胞每4～5天以1∶3的比例傳代。

1.2.2 細(xì)胞處理 A549細(xì)胞在不同脂多糖（LPS）濃度（5、10、15 g/ml）處理0、3、6、12和24 h。

1.2.3 細(xì)胞活力測定 CCK-8試劑盒測定細(xì)胞活力。

1.2.4 細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度測定 使用Ca2+指示劑染料Fluo-4，通過熒光顯微鏡來測定[2-3]。

1.2.5 Western blotting測定 用放射免疫測定緩沖液裂解細(xì)胞制備全細(xì)胞裂解液，使用蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。Western印跡分析，50 g的每個樣本的描述[4]處理。使用下列抗體：抗CaSR和抗actin。二次抗體被耦合到辣根過氧化物酶和化學(xué)發(fā)光檢測。通過掃描光密度分析X線片確定各波段的免疫蛋白的相對含量。

1.2.6 siRNA的轉(zhuǎn)染 細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中，被CaSR靶向siRNA（25 nM）轉(zhuǎn)染，時間在6h以上，介質(zhì)被抽吸，更換成含血清培養(yǎng)基，并且加入轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體-2000至最終濃度2 l/ml[5]，處理24h。

1.3 統(tǒng)計方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行處理。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用ANOVA分析。＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LPS對肺泡上皮細(xì)胞增殖的影響 LPS對細(xì)胞增殖的抑制作用呈現(xiàn)劑量和時間依賴性。肺泡上皮細(xì)胞系 A549細(xì)胞 50%抑制濃度的條件是 10g/ml （12 h）。見封三彩圖5。

2.2 LPS對細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響選擇Fluo-4熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的熒光含量增加。見封三彩圖6。

2.3 CaSR活化與鈣之間的關(guān)系 以LPS（10 g/ml）處理細(xì)胞12 h后，蛋白免疫印跡實驗中，加CaSR抗體組，在蛋白裂解液中發(fā)現(xiàn)了140 kD分子量大小的蛋白條帶；加入相應(yīng)的siRNA和混雜對照后，CaSR蛋白含量下降，同時增加的鈣濃度也下降，對照陰性。見封三彩圖7。2.4 Western blotting測定CaSR蛋白含量 加入相應(yīng)的siRNA后，LPS誘發(fā)的抑制細(xì)胞生長作用被逆轉(zhuǎn)CaSR活化與細(xì)胞增殖間的聯(lián)系。見封三彩圖8。

3 討論

雖然ARDS的發(fā)病率和死亡率很高，但是臨床治療手段也在不斷進步。研究者的聚焦點主要在于LPS導(dǎo)致的肺炎癥反應(yīng)，且更多關(guān)注內(nèi)皮細(xì)胞，作為肺重要組成的上皮細(xì)胞，關(guān)注甚少。鈣是重要的第二信使[6]，掌管多種重要的細(xì)胞應(yīng)答，包括增殖、遷移和細(xì)胞因子的分泌。以往研究發(fā)現(xiàn)CaSR在管理整體鈣的新陳代謝上發(fā)揮了關(guān)鍵作用[7-8]。在許多哺乳動物的組織廣泛表達，包括一些沒有清楚涉及鈣新陳代謝的組織[9]。因此，CaSR的活化和多種功能結(jié)果相關(guān)，包括細(xì)胞收縮、增殖、分化和炎癥。

本研究發(fā)現(xiàn)：LPS的細(xì)胞毒效應(yīng)具有劑量依賴性，伴隨細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度顯著增加。

本研究首次證實，A549細(xì)胞有CaSR蛋白的表達，針對性的siRNA片段來抑制CaSR，結(jié)果導(dǎo)致CaSR蛋白表達阻滯，并且明顯減少了LPS導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)鈣離子的增加。本研還發(fā)現(xiàn)：細(xì)胞增殖的減少被CaSR-siRNA的出現(xiàn)所抑制，這些結(jié)果表明CaSR的活化在LPS引發(fā)的肺炎癥反應(yīng)中，扮演了關(guān)鍵角色。

[1] Cortijo J,Milara J,Mata M,et al.Nickel induces intracellular calcium mobilization and pathophysiological responses in human cultured airway epithelial cells[J]. Chem Biol Interact,2010,183(1):25-33.

[2] Wang P,Xu S,Zhao K,et al.Increase in cytosolic calcium maintains plasma membrane integrity through the formation of microtubule ring structure in apoptotic cervical cancer cells induced by trichosan-thin[J].Cell BiolInt,2009,33(11):1149-1154.

[3] Jiang Q,Bai T,Shen S,et al.Increase of cytosolic calcium induced by trichosanth in suppresses cAMP/PKC levels through the inhibition of adenylyl cyclase activity in HeLa cells[J].Mol Biol Rep,2011,38 (4):2863-2868.

[4] Zhao K,Wang W,Guan C,et al.Inhibition of gap junction channel attenuates the migration of breast cancer cells[J].Mol Biol Rep,2012,39:2607-2613.

[5] Justinich CJ,Mak N,PachecoI,et al.The extracellular calcium-sensing receptor(CaSR) on human esophagus and evidence of expression of the CaSR on the esophageal epithelial cell line(HET-1A)[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2008, 294(1):G120-129.

[6] Ward DT.Calcium receptor-mediated in tracellular signaling[J].Cell Calcium, 2004,35(3):217-228.

[7] Chang W,Shoback D.Extracellular Ca2+-sensing receptors--an overview[J].Cell Calcium,2004,35(3):183-196.

[8] Chen RA,Goodman WG.Role of the calcium-sensingreceptor inparathyroid gland physiology[J].Am J Physiol Renal Physiol,2004,286(6):F1005-1011.

[9] Brown EM,MacLeod RJ.Extracellular calcium sensing and extracellular calcium signaling[J].Physiol Rev,2001,81(1): 239-297.

10.3969/j.issn.1671-0800.2016.01.009

R563.8

A

1671-0800(2016)01-0020-02

2015-09-15（本文編輯：孫海兒）

寧波市自然科學(xué)基金項目（2009A610175，2014A610248）

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