馮靖

介入呼吸病學(xué)的快速現(xiàn)場評價

馮靖

快速現(xiàn)場評價（ROSE）技術(shù)歷史悠久，但在過去相當(dāng)長一段時間內(nèi)并未得到廣泛開展。由于各類介入與微創(chuàng)技術(shù)快速崛起，加之快速染色制片技術(shù)的進(jìn)步，ROSE技術(shù)的價值與優(yōu)勢變得愈加凸顯，正在臨床中發(fā)揮越來越積極的作用。

1 現(xiàn)代ROSE技術(shù)的起源和發(fā)展

現(xiàn)代ROSE的系統(tǒng)研究和系統(tǒng)meta分析始于1993年，2005年左右，經(jīng)氣管鏡針吸活檢（TBNA）、經(jīng)氣管鏡細(xì)針吸引細(xì)胞學(xué)檢查（FNA）與針吸脫落細(xì)胞學(xué)檢查等介入呼吸病學(xué)技術(shù)大量開展。這些檢查具備良好的敏感性和特異性，不僅廣泛用于呼吸系統(tǒng)惡性疾病的診斷，在如結(jié)節(jié)病、肺結(jié)核等良性呼吸系統(tǒng)疾病的診斷中也有較大臨床意義。如果通過這些檢查能夠得到合適的標(biāo)本，則無需進(jìn)行如縱隔鏡、電視輔助胸腔鏡及開胸活檢等創(chuàng)傷性較大的檢查。但在這些檢查中，如何判斷是否得到了標(biāo)本？得到的標(biāo)本量是否足夠和合適？標(biāo)本如何進(jìn)一步處理？甚至如何立即獲得初步診斷等問題就擺在了介入呼吸病學(xué)專家面前。顯然，這些實(shí)時信息的作用是不可估量的。在實(shí)際操作中，如果得到了合適標(biāo)本，操作即應(yīng)立即終止，可以節(jié)省時間并減少患者創(chuàng)傷和并發(fā)癥的發(fā)生。相反，如果沒能得到標(biāo)本，操作應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行并同時改變操作的方式方法。而且，如能立即獲得初步診斷，不僅能為臨床醫(yī)師提供重要參考，還可以做進(jìn)一步操作和適當(dāng)處理，以幫助進(jìn)行特殊輔助檢查，如電子顯微鏡、免疫組織化學(xué)、染色體熒光原位雜交（FISH）、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）及微生物學(xué)相關(guān)檢查，從而使得整個操作近乎完美。正因如此，各種類型的ROSE技術(shù)在歐美得以廣泛使用。由于ROSE技術(shù)（本文中特指呼吸ROSE技術(shù)）具有獲得結(jié)果極快和可重復(fù)次數(shù)極高的優(yōu)勢，使得其在介入呼吸病學(xué)和呼吸危重癥的治療方面具有較大的臨床意義。近年來，介入呼吸病學(xué)新技術(shù)應(yīng)用于臨床。主要包括：經(jīng)支氣管鏡超聲技術(shù)、電子導(dǎo)航超細(xì)支氣管鏡技術(shù)、電磁導(dǎo)航支氣管鏡技術(shù)及三維仿真支氣管鏡技術(shù)等，加之肺部外科手術(shù)技術(shù)的進(jìn)步以及呼吸危重癥治療中對微生物病原學(xué)的急切要求，對ROSE技術(shù)提出了許多更高的要求。

2 ROSE技術(shù)的分類和臨床價值

ROSE工作者可以是有專門經(jīng)驗(yàn)的病理學(xué)專家，也可以是呼吸介入中心的技術(shù)人員、護(hù)士及實(shí)習(xí)研究生，甚至是直接參與介入操作的臨床醫(yī)師。呼吸ROSE技術(shù)主要包括兩大部分：快速現(xiàn)場細(xì)胞學(xué)評價（C-ROSE）和快速現(xiàn)場微生物學(xué)評價（M-ROSE）。這兩部分缺一不可，相輔相成，構(gòu)成了呼吸ROSE技術(shù)的完整輪廓。

C-ROSE的主要臨床意義包括：（1）指導(dǎo)介入呼吸病學(xué)診斷的進(jìn)度。如指導(dǎo)經(jīng)氣管鏡黏膜活檢、經(jīng)氣管鏡深部肺活檢（TBLB）、經(jīng)氣管鏡深部刷檢、TBNA、FNA、經(jīng)氣管鏡支氣管肺泡灌洗（BALF）、經(jīng)皮肺活檢、經(jīng)皮胸膜活檢、經(jīng)胸腔鏡胸膜活檢，以及其他部位（如皮下或深在部位）針吸脫落細(xì)胞學(xué)檢查。（2）指導(dǎo)介入呼吸病學(xué)治療的進(jìn)度及判斷介入呼吸病學(xué)治療的效果。如指導(dǎo)各類經(jīng)氣管鏡消融治療（高頻電刀、氬等離子電凝、冷凍切除、光動力治療、經(jīng)氣管鏡微波治療及經(jīng)氣管鏡激光治療等）。（3）經(jīng)氣管鏡確定肺部腫瘤外科手術(shù)切除線。（4）指導(dǎo)中央型肺癌患者的診斷及治療后隨訪。

M-ROSE的主要臨床意義包括：（1）可以提供部分微生物病原的形態(tài)學(xué)依據(jù)。如念珠菌屬的屬間鑒別，曲霉菌屬的屬間鑒別，耶氏肺孢子菌、其他類型真菌、球菌和桿菌的形態(tài)學(xué)，中性粒細(xì)胞球菌和桿菌的細(xì)菌吞噬現(xiàn)象。（2）可以有極高的重復(fù)檢查次數(shù)。（3）由于可以提供細(xì)胞分類與計(jì)數(shù)及其比例等細(xì)胞學(xué)背景，因此可以進(jìn)行病情的估計(jì)和療效的預(yù)判。

3 ROSE技術(shù)的基本操作方式

ROSE在實(shí)際操作中主要是用普通光學(xué)顯微鏡或熒光顯微鏡對采集到的標(biāo)本玻片進(jìn)行立即觀察判讀并獲得結(jié)果。所以，ROSE操作實(shí)際上由制片、染色和觀察3部分構(gòu)成。由于對時間的要求嚴(yán)格，ROSE操作的核心是如何提高制片和染色的速度。ROSE快速制片方式主要有：（1）小外檢組織塊滾片（印片）法。用于多數(shù)經(jīng)氣管鏡或胸腔鏡黏膜活檢與肺活檢，經(jīng)皮肺活檢或其他經(jīng)皮檢到的組織塊，還用于TBNA取到的條形組織塊。（2）細(xì)胞刷涂抹（刷片）法。用于多數(shù)經(jīng)氣管鏡刷片或用于其他較黏稠樣品。（3）噴片法與噴射推片法。用于多數(shù)FNA，也用于經(jīng)皮細(xì)針吸引肺細(xì)胞學(xué)活檢或其他經(jīng)皮檢到的細(xì)胞學(xué)標(biāo)本，還用于TBNA得到的條形組織塊以外的細(xì)胞學(xué)標(biāo)本。（4）液基薄層細(xì)胞制片（TCT）法。用于液基標(biāo)本，如胸水或TBNA、FNA獲得的液基標(biāo)本。（5）微孔濾膜過濾法。也用于液基標(biāo)本。（6）涂抹法。用于痰液等黏稠的液體標(biāo)本。

對于做好的ROSE制片，應(yīng)根據(jù)患者實(shí)際情況適當(dāng)采用以下方式進(jìn)行快速染色：（1）極快速（30 s）改良瑞氏染色（WF染色）：它是在瑞氏染色基礎(chǔ)上加以改良所形成的一種極快速染色方式，耗時僅30s，多數(shù)情況下1 min內(nèi)就可以在顯微鏡下觀察。這種染色通用于絕大多數(shù)C-ROSE與M-ROSE，簡單、快速、直接、有效，是ROSE最常用的染色方式。通常，單做WF ROSE在大多數(shù)情況下就已經(jīng)足夠了。而對于不熟悉WFROSE的呼吸介入中心，也可直接采用瑞氏染色或瑞氏-吉姆薩染色，同樣能在數(shù)分鐘內(nèi)完成。瑞氏和改良瑞氏染色主要由A液浸泡、磷酸鹽緩沖液浸泡、B液浸泡和清水清洗4步構(gòu)成，然后立即用吸水紙吸干，上普通光學(xué)顯微鏡觀察。（2）極快速（10 s）改良乳酸染色，也叫改良乳酸酚棉蘭染色，這種染色主要應(yīng)用于各類真菌。（3）快速（30min）支原體DNA霍氏熒光染色，這種染色耗時30 min，主要應(yīng)用于支原體感染。（4）快速（20min）金-羅耐酸菌熒光染色，也叫金胺O-羅丹明熒光染色，主要應(yīng)用于抗酸菌如結(jié)核分枝桿菌和努卡菌，也用于軍團(tuán)菌。通常結(jié)核分枝桿菌和努卡菌為金胺O-羅丹明染色強(qiáng)陽性，而軍團(tuán)菌染色可呈弱陽性。（5）試劑盒化快速（3 min）革蘭染色，這種染色主要應(yīng)用于球菌和桿菌，根據(jù)筆者的經(jīng)驗(yàn)，WF染色完全可以實(shí)現(xiàn)革蘭染色的功能。

4 現(xiàn)代C-ROSE在臨床的應(yīng)用情況

C-ROSE在介入呼吸病學(xué)新技術(shù)應(yīng)用中發(fā)揮了不可低估的作用。Loo等將ROSE應(yīng)用于電磁導(dǎo)航支氣管鏡（ENB），他將ROSE與正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描（PET-CT）、ENB鉗檢和ENB刷檢結(jié)合起來，用于對約2cm的外周肺結(jié)節(jié)進(jìn)行檢查，結(jié)果顯示ROSE可明顯提高診斷率，使總體診斷率達(dá)94%，且無任何操作相關(guān)并發(fā)癥的產(chǎn)生。在另一些研究中，ROSE技術(shù)被應(yīng)用于ENB和熒光導(dǎo)航支氣管鏡技術(shù)中，也明顯提高了診斷率，并減少了操作相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生。經(jīng)支氣管鏡超聲技術(shù)也是近幾年的一項(xiàng)新興技術(shù)。Collins等將ROSE與該技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)行TBNA，結(jié)果顯示同不使用ROSE相比，ROSE可減少33%的無謂穿刺和30%的無謂涂片，有68%的患者由于使用了ROSE技術(shù)，使得TBNA一次穿刺即獲得成功。最近也出現(xiàn)了一批高科技C-ROSE技術(shù)，例如具有“一站式快速診斷”之稱的波譜庫ROSE技術(shù)，可將玻片與波譜庫進(jìn)行快速對比，從而立即獲得診斷。這些診斷不僅限于惡性腫瘤，對于良性疾病和微生物病原也有快速診斷能力。也有 C-ROSE工作者將遠(yuǎn)程實(shí)時通訊技術(shù)應(yīng)用于ROSE，使得一些ROSE水平欠發(fā)達(dá)的中心在介入呼吸病學(xué)操作中得到ROSE專家的指導(dǎo)。

5 現(xiàn)代M-ROSE在臨床的應(yīng)用情況

M-ROSE在歐美歷史悠久，但真正大規(guī)模臨床應(yīng)用是近幾年才開始的，尤其是眾多呼吸重癥監(jiān)護(hù)病房（ICU）建立起來后，如何獲得真正的感染致病原是困擾呼吸科與感染科醫(yī)生的一大問題。痰培養(yǎng)的臨床意義日趨受到弱化，呼吸ICU往往需要通過氣管鏡來采集真正意義上含有感染源的標(biāo)本。介入呼吸病學(xué)采集感染源標(biāo)本一般通過刷檢和BALF兩種方式進(jìn)行。肺活檢不像刷檢，它可以采集深部肺泡組織及其襯液，對于鑒別定植菌和侵襲性感染菌有一定臨床價值。但由于肺活檢采集到的標(biāo)本小，菌落又通常不暴露于組織塊表面，需要將標(biāo)本在培養(yǎng)皿上反復(fù)翻滾移動來進(jìn)行細(xì)菌學(xué)種植培養(yǎng)。由于苛養(yǎng)菌感染的日趨增加與定植菌的廣泛存在嚴(yán)重干擾了細(xì)菌培養(yǎng)的可信度，臨床醫(yī)生對于細(xì)菌培養(yǎng)越來越不看重。即使細(xì)菌培養(yǎng)來自于BALF，臨床醫(yī)生通常也僅僅將其作為參考。M-ROSE的真正優(yōu)勢體現(xiàn)在微生物形態(tài)學(xué)和中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或淋巴細(xì)胞吞噬細(xì)菌這兩大方面，更為重要的是，它可以提供明確的細(xì)胞學(xué)背景。很顯然，感染性疾病的細(xì)胞學(xué)背景如壞死、中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的大量浸潤與非感染性疾病如哮喘的嗜酸性粒細(xì)胞為主的細(xì)胞學(xué)背景存在明顯差異，而慢性支氣管炎的杯狀細(xì)胞大量增生提示患者氣道的高分泌性。再如，緊密存在的上皮樣細(xì)胞和部分淋巴細(xì)胞提示肉芽腫性疾病的反應(yīng)性增生，而不提示其他球菌、桿菌和真菌的感染。如果在此基礎(chǔ)上，細(xì)菌實(shí)驗(yàn)室能夠提示陽性抗酸染色結(jié)果，或者ROSE中金胺O-羅丹明熒光染色陽性，則能夠確認(rèn)結(jié)核病的診斷。而對于巨細(xì)胞病毒感染，細(xì)胞學(xué)背景在大多數(shù)情況下顯得十分明顯。當(dāng)然，如果能將MROSE形態(tài)學(xué)與其他更先進(jìn)的微生物學(xué)方法如PCR、免疫熒光染色、流式細(xì)胞術(shù)、基因序列分析等相互結(jié)合，則能進(jìn)一步提高M(jìn)-ROSE的敏感性與特異性。

在形態(tài)學(xué)方面，M-ROSE具備天然優(yōu)勢。如果再將TBNA廣泛用于感染性疾病，就可以將TBNA 和M-ROSE的作用同時發(fā)揮到極致，因?yàn)榱馨徒Y(jié)尤其是隆突下淋巴結(jié)，是肺內(nèi)各種病原的“天然收集器”。M-ROSE對于真菌（尤其是處于菌絲時相的真菌）的確認(rèn)相對容易，而且具有極高的靈敏度與特異度。這些容易確認(rèn)的真菌包括隱球菌、芽生菌、組織胞漿菌、青霉菌和耶氏肺孢子菌，此外對于一些寄生蟲如瘧原蟲、利什曼蟲和剛地弓形蟲，M-ROSE也能較快得到診斷。結(jié)合幾種M-ROSE方法，尤其是結(jié)合金胺O-羅丹明熒光染色法以后，對于結(jié)核也有很高的檢出率。中性粒細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞是機(jī)體對抗肺部細(xì)菌感染的主要防御機(jī)制。中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或淋巴細(xì)胞吞噬細(xì)菌現(xiàn)象對感染性疾病的微生物病原有明確的提示意義。而當(dāng)患者罹患血液系統(tǒng)疾病、免疫缺陷性疾病或處于免疫抑制藥物治療中時，吞噬細(xì)菌現(xiàn)象將會明顯受到抑制。采用BALF快速TCT制片結(jié)合WFM-ROSE在中性粒細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌方面可以獲得較高的陽性率。

6 如何開展ROSE工作

盡管ROSE技術(shù)有較多優(yōu)點(diǎn)，但在很多介入中心，該技術(shù)尚未得到廣泛開展。作為ROSE工作者，應(yīng)該具備如下能力：（1）要全身心地投入，對ROSE制片要能認(rèn)、敢認(rèn)及認(rèn)對；（2）還要有龐雜的交叉學(xué)科知識，ROSE涉及常規(guī)呼吸病學(xué)、腫瘤學(xué)、介入呼吸病學(xué)、病理學(xué)、細(xì)胞學(xué)及臨床微生物學(xué)等多學(xué)科的綜合知識；（3）分析ROSE結(jié)果的時候還要有嚴(yán)密的臨床專科邏輯整合能力。應(yīng)結(jié)合病史、查體、影像學(xué)、實(shí)驗(yàn)室檢查等綜合分析，做出正確判斷。這就決定了呼吸科介入中心醫(yī)師自己進(jìn)行ROSE工作不可替代的天然優(yōu)勢。這些醫(yī)生自己問病史、自己查體、看CT及結(jié)合臨床檢驗(yàn)，再自己取標(biāo)本，判讀ROSE結(jié)果的時候，做到一切心中有數(shù)，甚至能夠預(yù)判。ROSE工作者要在長期的ROSE工作中，積累豐富的經(jīng)驗(yàn)，不斷提高臨床素養(yǎng)。希望更多的介入中心將更多的時間和精力投入到ROSE中來。

略，讀者需要可向編輯部索取)

10.3969/j.issn.1671-0800.2016.01.002

R56

C

1671-0800(2016)01-0005-03

2015-12-20（本文編輯：陳志翔）

300052天津，天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院

馮靖，主任醫(yī)師，博士，美國杜克大學(xué)博士后，美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）/環(huán)境與人類健康科學(xué)中心（NIEHS）博士后，斯坦福大學(xué)訪問學(xué)者。主要研究方向：介入呼吸病學(xué)和睡眠呼吸障礙，主持國家自然科學(xué)基金2項(xiàng)，參加國家自然科學(xué)基金2項(xiàng)、國家十五科技攻關(guān)課題1項(xiàng)?，F(xiàn)任中國睡眠研究會青年委員會副主任委員、中華醫(yī)學(xué)會呼吸病分會組織委員會委員和青年委員、天津市醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)會青年委員會副主任委員、衛(wèi)生部海峽兩岸醫(yī)藥衛(wèi)生交流協(xié)會呼吸專業(yè)委員會委員，國家自然科學(xué)基金評議專家，國家來華留學(xué)生教學(xué)專業(yè)委員會委員。Email：zyyhxkfj@126.com