李 寧 彭 興 黎丹戎 堯良清 黃玉葵 范余娟

(1 廣西南寧市婦幼保健院婦科，南寧市 530001，E-mail：lining0771@163.com；2 廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧市 530021；3 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤實(shí)驗(yàn)研究中心，南寧市 530021；4 復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院婦科，上海市 200011；5 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科，南寧市 530021)

論著·基礎(chǔ)研究

沙利度胺對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥患者內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的影響及其機(jī)制▲

李 寧1彭 興2黎丹戎3堯良清4黃玉葵1范余娟5

(1 廣西南寧市婦幼保健院婦科，南寧市 530001，E-mail：lining0771@163.com；2 廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧市 530021；3 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤實(shí)驗(yàn)研究中心，南寧市 530021；4 復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院婦科，上海市 200011；5 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科，南寧市 530021)

目的 探討沙利度胺對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥(EMT)患者內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞(ESC)的增殖、遷移運(yùn)動(dòng)、修復(fù)及體外侵襲能力的影響及其作用機(jī)制。方法 體外原代培養(yǎng)EMT患者的ESC，加入不同濃度沙利度胺(500.00、250.00、125.00、62.50、31.25 μg/ml)分別作用24 h、48 h后，應(yīng)用噻唑藍(lán)法測(cè)定ESC的抑制率。另取ESC分為空白組(沙利度胺0 μg/ml)、15 μg/ml沙利度胺組、30 μg/ml沙利度胺組，分別應(yīng)用劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell小室實(shí)驗(yàn)測(cè)定沙利度胺對(duì)ESC遷移運(yùn)動(dòng)及修復(fù)能力、體外侵襲能力的影響，流式細(xì)胞儀檢測(cè)在沙利度胺作用24 h后ESC的凋亡率，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沙利度胺對(duì)ESC血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果 15、30 μg/ml沙利度胺組細(xì)胞的遷移及修復(fù)能力、穿膜細(xì)胞數(shù)較空白組下降，細(xì)胞凋亡率較空白組升高(P<0.05)；細(xì)胞抑制率隨沙利度胺作用的濃度升高而升高(P<0.05)；15、30 μg/ml沙利度胺組細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)量明顯低于空白對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論 沙利度胺可抑制人EMT患者ESC的增殖、遷移運(yùn)動(dòng)和體外侵襲能力，并可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能是下調(diào)細(xì)胞VEGF蛋白分泌。

子宮內(nèi)膜異位癥；沙利度胺；內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；細(xì)胞增殖；遷移；侵襲

子宮內(nèi)膜異位癥(endometrionsis，EMT)的發(fā)病率為10%～15%。異位內(nèi)膜極具浸潤(rùn)性及種植能力，可侵犯全身任何部位，患者可出現(xiàn)痛經(jīng)、盆腔痛、性交痛，甚至不孕等，嚴(yán)重影響患者的身心健康和生活質(zhì)量[1-2]。藥物治療是EMT的主要治療方法，臨床上多采用激素類藥物進(jìn)行治療，但存在療效不理想、副作用大的弊端，因此，尋找非激素類的治療藥物意義重大[3]。大量文獻(xiàn)報(bào)告EMT雖為婦科良性疾病，卻與惡性腫瘤具有相似的黏附、侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及新生血管生成等生物學(xué)特性[4-5]。因此，抗血管生成有可能成為治療EMT的新趨勢(shì)。沙利度胺具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用，其機(jī)制可能是抑制新生血管的形成[6]。為探討沙利度胺對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞(endometrionsis-endometrial stromal cell，EMT-ESC)的影響，本課題對(duì)EMT患者的內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞(endometrial stromal cell，ESC)進(jìn)行體外培養(yǎng)，將沙利度胺作為主要干預(yù)因子，觀察其對(duì)細(xì)胞的影響。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞來源 選擇2013年1月至2015年1月在南寧市婦幼保健院婦科就診的EMT患者31例為研究對(duì)象，患者年齡29～40(32.0±1.7)歲，術(shù)前無激素用藥史，術(shù)后經(jīng)病理檢查明確診斷。術(shù)中留取患者卵巢巧克力囊腫的囊壁進(jìn)行原代EMT-ESC培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 主要藥品及儀器：沙利度胺購自常州制藥廠有限公司(批號(hào)020126)。稱取沙利度胺藥物粉末25 mg，加入5 ml無血清RPMI-1640培養(yǎng)基使其充分溶解，經(jīng)0.22 μm無菌濾膜過濾即得5 mg/ml藥物原液，分裝，于4℃保存，使用時(shí)采用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋藥物原液至所需濃度。鼠抗人波形蛋白抗體購自武漢博士德公司(批號(hào)：130106025A)；倒置顯微鏡為日本Nikon公司生產(chǎn)；噻唑藍(lán)(methyl thiazol tetrazolium，MTT)、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)-熒光標(biāo)記二抗、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購自美國(guó)Sigma公司(批號(hào)：13031311M、12112618M、12120928M)；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒購自美國(guó)Abcam公司(批號(hào)：130520631H)；Transwell小室購自美國(guó)Chemi-Con公司(批號(hào)：1300165)；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國(guó)Gibco公司(批號(hào)：130412P、130325X)；流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司生產(chǎn)。

1.2.2 原代細(xì)胞培養(yǎng)：術(shù)中取少量新鮮EMT組織(巧克力囊腫的囊壁)，臨時(shí)儲(chǔ)存于完全培養(yǎng)基中，并及時(shí)轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)室，處理步驟如下：將部分人EMT組織經(jīng)磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)漂洗后，用眼科手術(shù)剪刀小心地反復(fù)剪切組織至1 mm3左右的小塊，再用PBS溶液清洗至清洗液清亮，靜置數(shù)分鐘，棄去上清。視組織塊量加入5～6倍的0.25%胰酶液，37℃消化30 min，每隔5 min振蕩一次。靜置，吸去上清，加2 ml細(xì)胞培養(yǎng)液，用吸管反復(fù)吹打組織塊，使細(xì)胞呈單個(gè)游離狀，將細(xì)胞懸液接種至T 25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察原代培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)情況。用鼠抗人波形蛋白抗體對(duì)分離獲得細(xì)胞進(jìn)行免疫組化染色鑒定[3]，鑒定后的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 MTT實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ESC，以1×105/ml密度接種于96孔板中，每孔100 μl，37℃培養(yǎng)24 h后，加入100 μl不同濃度沙利度胺(500.00、250.00、125.00、62.50、31.25 μg/ml)，空白孔加100 μl細(xì)胞培養(yǎng)液，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。37℃分別培養(yǎng)24、48 h后每孔加20 μl MTT，37℃繼續(xù)孵育4 h，小心吸棄孔板中的所有試劑，加入200 μl DMSO，10 min后在酶標(biāo)儀上測(cè)定波長(zhǎng)570 nm吸光度值(A)，按公式計(jì)算抑制率及半數(shù)抑制濃度IC50。抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組A值/空白對(duì)照組A值)×100%[7]。選擇抑制率小于10%的濃度，觀察沙利度胺對(duì)細(xì)胞增殖活力的影響。

1.2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ESC，將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×106/ml，于6孔板中每孔加細(xì)胞懸液500 μl，37℃、5% CO2孵育24 h，使之形成單層細(xì)胞。10 μl無菌移液槍槍頭劃痕，PBS溶液輕柔洗細(xì)胞3次。加入不同濃度的沙利度胺(0、15、30 μg/ml)，37℃、5% CO2孵育，按0 h、24 h、48 h、72 h取樣，顯微鏡觀察、拍照。

1.2.5 Transwell小室實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ESC，將細(xì)胞濃度調(diào)整至5×104/ml，取細(xì)胞懸液200 μl接種于上層小室內(nèi)，小室下室加入含有20%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基。各組Transwell小室加入不同濃度的沙利度胺(0、15、30 μg/ml)，37℃、5% CO2孵育24 h后取出濾膜，擦去Matrigel膠，甲醇固定20 min，行Giemsa染色。200倍光鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)上、下、左、右、中5個(gè)不同視野的穿膜細(xì)胞數(shù)，取均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 檢測(cè)細(xì)胞凋亡率：用Sigma公司的細(xì)胞染色緩沖液洗滌細(xì)胞兩次，然后懸浮細(xì)胞在膜聯(lián)蛋白V結(jié)合緩沖液中，細(xì)胞濃度為0.8×107/ml。移取100μl細(xì)胞懸液放于5 ml的試管中，給藥組分別加入不同濃度的沙利度胺(0、15、30 μg/ml)，以不加藥物的細(xì)胞為對(duì)照組。24 h后收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，每根試管中加入490 μl工作濃度的膜聯(lián)蛋白V結(jié)合緩沖液，振蕩混勻細(xì)胞，同時(shí)加入5 μl膜聯(lián)蛋白V-FITC和1 μl 7-氨基放線菌素D，室溫下避光染色10 min，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行雙參數(shù)分析，測(cè)定壞死、凋亡和正常細(xì)胞的百分率。

1.2.7 VEGF蛋白表達(dá)的測(cè)定：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ESC，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/ml，將ESC置培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的沙利度胺(0、15、30 μg/ml)處理24 h，更換成無血清及細(xì)胞因子的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF含量進(jìn)行測(cè)定。設(shè)置空白孔，將上述收集到的細(xì)胞培養(yǎng)上清液按100 μl/孔加入相應(yīng)預(yù)包被板孔中，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫孵育120 min。加入生物素化抗體工作液(100 μl/孔)。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫孵育60 min。加入酶結(jié)合物工作液(100 μl/孔)。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，避光室溫孵育20 min。上述每個(gè)步驟之間均洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。加入顯色劑3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺100 μl/孔，避光室溫孵育20 min。加入終止液50 μl/孔，混勻后即刻通過酶標(biāo)儀測(cè)量A450值。VEGF濃度與A450值之間呈正比。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以(x±s)表示，多組均數(shù)比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 原代培養(yǎng)EMT患者ESC形態(tài)及鑒定結(jié)果 成功從EMT患者巧克力囊腫標(biāo)本分離培養(yǎng)子宮ESC，細(xì)胞容易貼壁生長(zhǎng)。倒置顯微鏡下觀察原代人EMT-ESC呈蝌蚪形或多角形，細(xì)胞多呈旋渦狀成團(tuán)生長(zhǎng)，見圖1。免疫組化鑒定結(jié)果顯示，原代細(xì)胞具有成纖維細(xì)胞形態(tài)，鼠抗人波形蛋白染色細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色，證實(shí)獲得人EMT-ESC，見圖2。

圖1 原代培養(yǎng)細(xì)胞(×200)圖2 原代培養(yǎng)細(xì)胞鼠抗人波形蛋白染色結(jié)果(×200)

2.2 沙利度胺對(duì)EMT患者ESC增殖能力的影響 不同濃度沙利度胺對(duì)人EMT-ESC的抑制率分別比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，不同濃度的沙利度胺均能顯著抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，且呈明顯的劑量-時(shí)間依賴性(P<0.05)。24 h、48 h沙利度胺對(duì)人EMT-ESC的抑制率IC50分別為245.44 μg/ml和185.36 μg/ml，當(dāng)沙利度胺濃度低于30 μg/ml時(shí)，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率低于10%。見表1。

表1 不同濃度的沙利度胺作用24 h、48 h人EMT-ESC的抑制率(%)

注：*組內(nèi)不同濃度間兩兩比較，P<0.05。

2.3 沙利度胺對(duì)EMT患者ESC遷移能力的影響 不同濃度的沙利度胺(0、15、30 μg/ml)處理細(xì)胞0 h、24 h、48 h、72 h后，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示沙利度胺能明顯抑制細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)及修復(fù)能力，且呈明顯的劑量-時(shí)間依賴性。見圖3。

圖3 不同濃度沙利度胺作用不同時(shí)間ESC遷移運(yùn)動(dòng)、修復(fù)能力的變化(×100)

2.4 沙利度胺對(duì)EMT患者ESC侵襲能力的影響 空白組和15、30 μg/ml沙利度胺組的穿膜細(xì)胞數(shù)目分別為(79.3±6.5)個(gè)、(11.5±3.6)個(gè)和(6.5±2.4)個(gè)，沙利度胺處理24 h后的人EMT-ESC體外侵襲能力顯著降低(F=2 268.127，P<0.001)，見圖4。

圖4 不同濃度沙利度胺作用24 h對(duì)細(xì)胞體外侵襲能力的影響 (Giemsa染色，×200)

2.5 沙利度胺對(duì)EMT患者ESC凋亡的影響 經(jīng)15 μg/ml和30 μg/ml沙利度胺作用24 h后的細(xì)胞凋亡率分別為14%和29%，顯著高于空白組的0.3%，見圖5。

圖5 不同濃度沙利度胺作用24 h后細(xì)胞的凋亡情況

2.6 沙利度胺對(duì)VEGF蛋白表達(dá)的影響 作用24 h后，15、30 μg/ml沙利度胺組細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)量分別為(42.34±4.50)ng/L、(28.70±3.23)ng/L，明顯低于空白對(duì)照組的(61.56±7.32)ng/L(F=243.635，P<0.001)。

3 討 論

有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，與子宮內(nèi)膜接觸的腹膜部分，其表面間質(zhì)細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)缺失現(xiàn)象，這與子宮內(nèi)膜發(fā)生侵襲的現(xiàn)象相符合[7]，由此可見子宮ESC是一種具侵襲能力的細(xì)胞，可以引起腹膜間質(zhì)細(xì)胞的損傷和凋亡。子宮ESC生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移離不開血管生成，新生血管形成是子宮ESC增長(zhǎng)所必需的先決條件之一。血管增生在EMT的發(fā)病機(jī)制中起著較為關(guān)鍵的作用。大多數(shù)EMT患者存在子宮內(nèi)膜增厚、毛細(xì)血管豐富的典型病理學(xué)特征，組織病理學(xué)檢查也可見到迂曲、擴(kuò)張的毛細(xì)血管。有文獻(xiàn)報(bào)告病變的子宮ESC VEGF分泌量明顯增高，并通過旁分泌作用促進(jìn)微血管增生[8]。目前治療EMT的常用藥物有芳香酶抑制劑、促性腺激素釋放激素拮抗劑、選擇性孕激素受體調(diào)節(jié)劑[9-10]。而針對(duì)血管形成的抑制藥物鮮有報(bào)告。因此，篩選可抑制VEGF的表達(dá)及異位病灶的微血管生成，促進(jìn)異位內(nèi)膜細(xì)胞萎縮壞死，從而抑制EMT發(fā)展的血管生成抑制劑，將為EMT的治療提供新的途徑。

早在20世紀(jì)90年代就有學(xué)者發(fā)現(xiàn)沙利度胺具有抑制血管生成的作用[11]。有學(xué)者者認(rèn)為，沙利度胺抗血管生成的作用取決于其對(duì)VEGF及堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的影響。有學(xué)者在多發(fā)性骨髓瘤治療方法的探索性研究中發(fā)現(xiàn)，沙利度胺能夠減少骨髓瘤間質(zhì)細(xì)胞VEGF的分泌[12]。此外，還有研究表明，沙利度胺不僅能夠降低細(xì)胞分泌VEGF水平，而且可以通過抑制VEGF的蛋白表達(dá)，進(jìn)一步抑制細(xì)胞的遷移、毛細(xì)血管的生成及血管的形成[13]。本研究結(jié)果顯示，不同濃度沙利度胺組細(xì)胞的凋亡率升高，遷移及修復(fù)能力、穿膜細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞VEGF表達(dá)量較空白組下降(P<0.05)，且隨著沙利度胺濃度升高，細(xì)胞抑制率升高(P<0.05)，提示人EMT患者ESC經(jīng)沙利度胺處理后，細(xì)胞的增殖、遷移運(yùn)動(dòng)、修復(fù)及體外侵襲能力均明顯下降，特別是細(xì)胞分泌的VEGF水平明顯減少，與上述研究結(jié)果相符。筆者推測(cè)沙利度胺對(duì)EMT患者ESC的生長(zhǎng)抑制作用，有可能是通過抑制血管生成的作用而實(shí)現(xiàn)的。

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Effects of thalidomide on endometrial stromal cells in patients with endometriosis and its mechanism

LINing1,PENGXing2,LIDan-rong3,YAOLiang-qing4,HUANGYu-kui1,FANYu-juan5

(1DepartmentofGynaecology,theMaternalandChildHealthHospitalofNanning,Nanning530001,China;2SchoolofPharmacy,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China;3ExperimentalCenterforTumorResearch,theAffiliatedTumorHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China;4DepartmentofGynaecology,GynaecologyandObstetricsHospitalAffiliatedtoFudanUniversity,Shanghai200011,China;5DepartmentofGynaecology,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To explore the effects of thalidomide on the proliferation,migration motion,repair and invasive ability in vitro of endometrial stromal cells(ESCs) in patients with endometriosis(EMT) and its mechanism.Methods The ESCs of patients with EMT primarily cultured in vitro,and were treated with various concentrations(500.00,250.00,125.00,62.50 and 31.25 μg/ml) of thalidomide for 24 and 48 hours respectively.Methyl thiazolyl tetrazolium method was used to detect the inhibition rate of ESCs.Another ESCs were divided into blank group(0 μg/ml thalidomide),15 μg/ml thalidomide group and 30 μg/ml thalidomide group.Scratch-wound assay and Transwell assay were used to determine the effects of thalidomide on the abilities of migration motion and repair,and invasive ability in vitro of ESCs respectively.The apoptosis rates of ESCs were analyzed by flow cytometry after 24 hours of intervention with thalidomide.The effect of thalidomide on the expression of vascular endothelial growth factor(VEGF) protein of ESCs was detected by enzyme-linked immunosorbent assay.Results Compared to the blank group,the abilities of migration and repair,transmembrane cells decreased and cell apoptosis rate increased in the 15 and 30 μg/ml thalidomide groups(P<0.05).The cell inhibition rate was elevated with the increase of the intervention concentration of thalidomide(P<0.05).The expression of VEGF protein in the 15 or 30 μg/ml thalidomide groups was significantly lower than that in the blank control group(P<0.05).Conclusion Thalidomide can inhibit the abilities of proliferation and migration motion,and invasive ability in vitro of ESCs in patients with EMT,and can induce the cell apoptosis.And the mechanism may be related to down-regulation of the secretion of VEGF protein in cells.

Endometriosis,Thalidomide,Endometrial Leydig′s cell,Vascular endothelial growth factor,Cell proliferation,Migration,Invasion

廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃(桂科攻12300016)；廣西南寧市科技局項(xiàng)目(20133174)

李寧(1978～)，女，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向：子宮內(nèi)膜異位癥的基礎(chǔ)及臨床。

彭興(1979～)，女，碩士，講師，研究方向：藥物化學(xué)，E-mail：625025109@qq.com。

R 711.71

A

0253-4304(2016)08-1062-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.08.03

2016-03-23

2016-06-12)