葛士坤，張凱照，劉健新，王晴楠，于 夢(mèng)，陶 攀，寧章勇

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州510642）

羊口瘡病毒GDZC株錨蛋白基因的克隆及序列分析

葛士坤，張凱照，劉健新，王晴楠，于 夢(mèng)，陶 攀，寧章勇＊

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州510642）

摘 要：為研究羊口瘡病毒（Orf virus，ORFV）編碼的錨蛋白（ankyrin，ANK）基因在感染宿主中的免疫調(diào)節(jié)作用，本試驗(yàn)從ORFV GDZC株感染的細(xì)胞病毒液中提取基因組DNA，用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增、克隆出5個(gè)ANKs基因，并進(jìn)行了基因序列及其編碼蛋白的生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示，獲得的GDZC株ORFV008、ORFV123、ORFV126、ORFV128、ORFV129基因分別編碼516、525、497、501和516個(gè)氨基酸，與OV－SA00毒株的核苷酸同源性最高，分別為98.3%、98.7%、97.9%、97.3%、98.0%。ORFV編碼的5個(gè)ANKs都含有ANK結(jié)構(gòu)域和F－box結(jié)構(gòu)域，是結(jié)構(gòu)保守蛋白。蛋白跨膜分析表明，ORFV123和ORFV128不含潛在跨膜區(qū)，ORFV129、ORFV008和ORFV126蛋白分別存在1、2和3個(gè)潛在跨膜區(qū)，且均不含信號(hào)肽。本研究結(jié)果為深入研究ANK在ORFV致病過(guò)程中作用和免疫逃逸機(jī)制提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞：羊口瘡病毒；錨蛋白；克??；序列分析

羊口瘡（Orf disease）是由羊口瘡病毒（Orf virus，ORFV）引起的一種急性、高度接觸性的人獸共患病，山羊、綿羊、多種野生動(dòng)物和人均能感染發(fā)?。?－4］。感染動(dòng)物在口腔黏膜、舌、鼻、乳房等部位出現(xiàn)丘疹、水皰、膿皰和疣狀厚痂等病變［1－4］。近年來(lái)，該病在世界各地的羊群中頻頻暴發(fā)和流行，嚴(yán)重威脅著養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展和人類的健康［5－6］。ORFV屬于痘病毒科、副痘病毒屬的嗜上皮型雙鏈DNA病毒，病毒基因組全長(zhǎng)約138kb，末端具有共價(jià)閉合環(huán)狀發(fā)夾結(jié)構(gòu)［7－8］，基因組中心區(qū)編碼基因高度保守與病毒復(fù)制和形態(tài)發(fā)生相關(guān)，末端區(qū)基因與病毒毒力和致病性有關(guān)［9］。感染ORFV對(duì)處于免疫抑制狀態(tài)的動(dòng)物和人會(huì)造成極其嚴(yán)重的危害［10－11］。

ORFV在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，形成了獨(dú)特的免疫逃逸機(jī)制，可以重復(fù)感染同一宿主并致?。?2］。到目前為止，ORFV的這種免疫逃逸機(jī)制仍然不清楚。ORFV通過(guò)編碼一系列免疫調(diào)節(jié)蛋白來(lái)逃避宿主的天然免疫反應(yīng)，這些病毒編碼蛋白包括IL－10、趨化因子結(jié)合蛋白（CBP）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）、GIF和宿主細(xì)胞凋亡抑制蛋白ORFV125［13－17］。此外，ORFV還編碼一類錨蛋白（ankyrin，ANK），這類蛋白具有典型的ANK重復(fù)序列，能有效降解宿主抗病毒因子，調(diào)控病毒的復(fù)制和機(jī)體的天然免疫功能［18－21］。全基因組分析發(fā)現(xiàn)，ORFV共編碼5個(gè)ANK蛋白，除ORFV008基因外，另外4個(gè)（ORFV123、ORFV126、ORFV128、ORFV129）位于基因組3′端反向末端重復(fù)序列區(qū)。最近研究表明，ORFV008、ORFV126能夠結(jié)合宿主包括抗病毒因子在內(nèi)的功能蛋白，激活機(jī)體的泛素活化通路［16，21］，并調(diào)控NF－κB信號(hào)通路，這提示ORFV或許通過(guò)編碼ANK蛋白來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能。本研究對(duì)ORFV編碼的ANK基因進(jìn)行了克隆及序列分析，為進(jìn)一步了解ANK蛋白在病毒致病過(guò)程中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1試劑、病毒株和基因組DNA提取

病毒DNA提取試劑盒、Prime STAR GXL DNA聚合酶、DNA片段純化試劑盒、T4DNA連接試劑盒、pMD18－T載體、DL5000DNA Marker、大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞和質(zhì)粒DNA提取試劑盒均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。ORFV－GDZC株由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院病理研究室羊口瘡課題組分離、鑒定和保存。利用病毒DNA提取試劑盒從增殖GDZC株ORFV的OFTu細(xì)胞第5代病毒液中提取該病毒的基因組DNA。

1.2引物設(shè)計(jì)與合成

參考GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的ORFV基因組序列（登錄號(hào)：AY386263），利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增ANK基因，引物信息見表1。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

表1　ANK基因引物信息Table 1 Primer informations ofANKgene

1.3PCR擴(kuò)增、克隆與測(cè)序

以提取的病毒基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系50μL：5×PCR Buffer 10μL，dNTP Mixture（各2.5mmol／L）4μL，上、下游引物（20pmol／μL）各2μL，模板DNA 2μL，高保真DNA聚合酶（1.25U／μL）1μL，超純水29μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，退火（退火溫度見表1）35s，72℃延伸2min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后純化回收，連接到pMD18－T載體，將鑒定正確的質(zhì)粒送至英濰捷基貿(mào)易有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4生物信息學(xué)分析

對(duì)ORFV GDZC株編碼的5個(gè)ANKs基因進(jìn)行編碼蛋白信號(hào)肽、保守結(jié)構(gòu)域等分析。用ProtParam Tool（http：／／web.expasy.org／protparam／）進(jìn)行蛋白理化性質(zhì)分析；用SignalP 4.1Server（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP／）進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)；用ProtScale軟件（http：／／web.expasy.org／protscale／）進(jìn)行蛋白質(zhì)疏水性分析；用TMpred軟件（http：／／www.ch.embnet.org／software／TMPRED＿form.html）進(jìn)行蛋白質(zhì)跨膜區(qū)預(yù)測(cè)；用SMART服務(wù)器（http：／／smart.embl－h(huán)eidelberg.de／）和Conserved domains工具（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／Structure／ cdd／wrpsb.cgi）進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析；使用DNAStar 7.0軟件對(duì)ANKs基因序列和氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)；用Mega 5.0軟件繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1ORFV GDZC株ANK基因的克隆

以提取的病毒基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增后發(fā)現(xiàn)這5個(gè)基因的電泳條帶與預(yù)期大小相符（圖1）。測(cè)序結(jié)果表明，成功克隆了5個(gè)基因，將獲得的5個(gè)基因序列提交至GenBank，獲得登錄號(hào)分別為：KU672077（ORFV008）、KU672076（ORFV123）、KU870636（ORFV126）、KU672075（ORFV128）和KU672074（ORFV129）。

圖1　ANKs基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification products ofANKsgene

2.2ANKs基因的序列分析

將獲得的ANKs基因序列與GenBank中公布的ORFV（OV－IA82、OV－SA00、NZ2、D1701、NA1－11株）、BPSV（BV－AR02株）及PCPV（F00.120R株）毒株相應(yīng)ANKs基因序列進(jìn)行核苷酸同源性比對(duì)，結(jié)果表明，ORFV008、ORFV123、ORFV126、ORFV128、ORFV129與OV－SA00毒株同源性最高，分別為98.3%、98.7%、97.9%、97.3%、98.0%（圖2）。利用Mega 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，ORFV GDZC株與OV－SA00株有最高的親緣性（圖3）。利用ProtParam Tool對(duì)5個(gè)基因編碼的蛋白理化性質(zhì)分析表明，ORFV008、ORFV123、 ORFV126、ORFV128、ORFV129基因分別編碼516、525、497、501和516個(gè)氨基酸。蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分別為56 002.6、56 497.4、56 044.0、53 477.6和55 576.1u。等電點(diǎn)分別為6.07、6.42、8.78、8.88和6.77。利用SMART服務(wù)器和Conserved domains工具分析發(fā)現(xiàn)，5個(gè)蛋白都含有ANK結(jié)構(gòu)域和F－box結(jié)構(gòu)域，是結(jié)構(gòu)保守蛋白（圖4）。利用DNAStar 7.0軟件對(duì)5個(gè)ANK蛋白的ANK結(jié)構(gòu)域和F－box結(jié)構(gòu)域進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明5個(gè)蛋白之間ANK結(jié)構(gòu)域和F－box結(jié)構(gòu)域均具有較高的同源性（圖5）。

圖2　不同毒株ANKs基因核苷酸同源性比對(duì)Fig.2 Nucleotide homology analysis ofANKsgene of different strains

圖3　基于5種ANK基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree analysis based on fiveANKgenes

圖4　ORFV ANK重復(fù)序列蛋白序列的分析Fig.4 Analysis of protein sequence of ORFV ANK proteins

圖5　ORFVANKs基因ANK結(jié)構(gòu)域和F－box結(jié)構(gòu)域的比對(duì)Fig.5 The analysis of ANK and F－box domains of ORFVANKsgene

2.3 ANK蛋白的疏水性分析

利用ProtScale對(duì)蛋白質(zhì)的疏水性分析發(fā)現(xiàn)，ORFV008編碼蛋白最大疏水指數(shù)位于第496位，為2.733，最小疏水指數(shù)位于第170位，為－1.889（圖6A）；ORFV123編碼蛋白最大疏水指數(shù)位于第371位，為1.944，最小疏水指數(shù)位于第14位，為－2.589（圖6B）；ORFV126編碼蛋白最大疏水指數(shù)位于第172位，為2.789，最小疏水指數(shù)位于第21位，為－2.356（圖6C）；ORFV128編碼蛋白最大疏水指數(shù)位于第420位，為2.422，最小疏水指數(shù)位于第463位，為－1.944（圖6D）；ORFV129編碼蛋白最大疏水指數(shù)位于第432位，為3.022，最小疏水指數(shù)位于第118位的，為－3.178（圖6E）。

2.4ANK蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析和信號(hào)肽預(yù)測(cè)

利用TMpred軟件分析表明，ORFV008蛋白存在2個(gè)潛在跨膜區(qū)，其位置分別在196－214位（loop1）和473－506位（loop2）（圖7A）；ORFV126蛋白存在3個(gè)潛在跨膜區(qū)，其位置分別在64－88位（loop1）、123－142位（loop2）和157－177位（loop3）（圖7C）；ORFV129存在1個(gè)潛在跨膜區(qū)，其位置在422－446位（loop1）（圖7E）；ORFV123和ORFV128不含潛在跨膜區(qū)（圖7B和7D）。利用SignalP 4.1 Server分析蛋白質(zhì)信號(hào)肽，發(fā)現(xiàn)這5個(gè)ANK蛋白均不含有信號(hào)肽。

圖6　ORFV ANK蛋白的疏水性分析Fig.6 Hydrophobicity analysis of ORFV ANK proteins

圖7　ORFV ANK蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析Fig.7 Secondary structure analysis of ORFV ANK proteins

3 討 論

大多數(shù)痘病毒都編碼ANK蛋白，這類蛋白由ANK基序結(jié)構(gòu)組成，能夠介導(dǎo)蛋白－蛋白之間的相互作用，在病毒感染和免疫調(diào)控中發(fā)揮重要作用。同源進(jìn)化分析表明，機(jī)體編碼的許多NF－κB結(jié)合蛋白都含有ANK基序，這也暗示了ORFV編碼的ANK蛋白可以通過(guò)與NF－κB結(jié)合蛋白競(jìng)爭(zhēng)抑制宿主的NF－κB信號(hào)通路。雖然痘病毒屬病毒編碼的ANK蛋白調(diào)節(jié)NF－κB信號(hào)通路的激活在不同的物種之間具有較大的差異，但是該類蛋白作為痘病毒的關(guān)鍵毒力因子越來(lái)越受到重視。此外，ANK蛋白的C末端還含有F－box樣蛋白結(jié)構(gòu)，這與痘病毒屬病毒跨宿主傳播具有重要關(guān)系。到目前為止，ORFV編碼的ANK蛋白在病毒免疫逃逸及調(diào)節(jié)機(jī)體天然免疫功能方面的機(jī)制仍然未知［11，17－18］，雖然推測(cè)其與NF－κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控有關(guān)，但是缺乏詳細(xì)的試驗(yàn)證據(jù)支持。對(duì)ORFV編碼的ANK結(jié)構(gòu)和功能的研究，必將為羊口瘡的綜合防控提供科學(xué)依據(jù)。

對(duì)ORFV全基因組分析發(fā)現(xiàn)，ORFV編碼5種具有ANK蛋白典型結(jié)構(gòu)的蛋白，對(duì)其蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，這5種ANK蛋白的N端均含有8～9個(gè)ANK基序以及C末端的F－box樣蛋白結(jié)構(gòu)。有研究發(fā)現(xiàn)該F－box蛋白能與細(xì)胞SCF1（SKP－1、cullin 1和RING－box 1）泛素連接酶復(fù)合體相互作用，激活宿主細(xì)胞的泛素／蛋白酶體機(jī)制，調(diào)節(jié)NF－κB信號(hào)通路［16，21］，這暗示ORFV也可能通過(guò)這些ANK蛋白來(lái)抑制NF－κB作用，從而逃避宿主的免疫反應(yīng)。但是，目前尚無(wú)這方面的研究。因此，有必要選擇這些ANK蛋白進(jìn)行病毒與宿主相互作用機(jī)制研究。

本研究克隆了ORFV GDZC株編碼的5個(gè)ANKs基因，并對(duì)其進(jìn)行了基因序列及編碼蛋白的理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域、疏水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)及信號(hào)肽分析。結(jié)果顯示，5個(gè)ANKs基因編碼氨基酸數(shù)目在497～525個(gè)之間，與OV－SA00毒株具有最高的同源性，基因相對(duì)保守；保守結(jié)構(gòu)域分析表明5個(gè)ANK蛋白都含有N端的ANK結(jié)構(gòu)域和C端的F－box結(jié)構(gòu)域，是結(jié)構(gòu)保守蛋白；ORFV123和ORFV128不含潛在跨膜區(qū)；信號(hào)肽分析發(fā)現(xiàn)這5個(gè)ANK蛋白均不含信號(hào)肽。本試驗(yàn)結(jié)果為研究ORFV ANK蛋白的生物學(xué)功能提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也為進(jìn)一步探究ORFV與宿主相互作用機(jī)制以及預(yù)防控制該病的發(fā)生奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

ORFV編碼的5個(gè)ANKs基因與OV－SA00毒株的核苷酸同源性最高，含有ANK結(jié)構(gòu)域和F－box結(jié)構(gòu)域，為結(jié)構(gòu)保守蛋白，且均不含信號(hào)肽。

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（責(zé)任編輯 晉大鵬）

中圖分類號(hào)：S852.65＋9.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1671－7236（2016）12－3085－09

doi：10.16431／j.cnki.1671－7236.2016.12.001

收稿日期：2016－06－16

基金項(xiàng)目：廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2016A020210079）

作者簡(jiǎn)介：葛士坤（1990－），男，山東聊城人，碩士生，研究方向：獸醫(yī)病理學(xué)，E－mail：geshikun2016＠163.com

通信作者：＊寧章勇（1978－），男，山東莘縣人，教授，研究方向：獸醫(yī)病理學(xué)，E－mail：ningzhyong＠126.com

Cloning and Sequence Analysis of Ankyrin Genes from Orf Virus GDZC Strain

GE Shi－kun，ZHANG Kai－zhao，LIU Jian－xin，WANG Qing－nan，YU Meng，TAO Pan，NING Zhang－yong＊
（CollegeofVeterinaryMedicine，SouthChinaAgriculturalUniversity，Guangzhou510642，China）

Abstract：To investigate the role of ankyrin proteins encoding by Orf virus（ORFV）in the immune modulation to host infection，five ankyrin（ANK）genes of ORFV GDZC strain were amplified using specific primers by PCR amplification and cloning from the viral genome DNA which extracted from virus infection cells，and their sequences and coding protein structure bioinformatics analysis were performed.The results showed that ORFV008，ORFV123，ORFV126，ORFV128and ORFV129consisted of 516，525，497，501and 516amino acids，respectively，which shared a nucleotide identity of 98.3%，98.7%，97.9%，97.3%and 98.0%with those of ORFV OV－SA00strain，respectively.All of five ANK proteins contained ANK and F－box structural domain that showed they were structure conservative proteins.The analysis of protein transmembrane showed that ORFV123and ORFV128had no potential transmembrane domains，while the ORFV129，ORFV008and ORFV126had one，two and three potential transmembrane domains，respectively.And these ANK proteins had no signal peptide.These results provided the basic data for further study of the ANK proteins in the pathogenic and immune evasion mechanisms of ORFV.

Key words：Orf virus；ANK protein；cloning；sequence analysis