王 景，蔡雪峰

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院西院，湖北 武漢 430056）

正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化赤靈芝中堿溶性純化多糖的提取工藝

王 景，蔡雪峰*

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院西院，湖北 武漢 430056）

以赤靈芝為原料提取堿溶性多糖，考察了提取時(shí)間、提取溫度、液料比、NaOH濃度及提取次數(shù)對(duì)堿溶性多糖提取率的影響，并采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，確定了赤靈芝中堿溶性多糖最佳提取工藝參數(shù)，即提取時(shí)間2 h，提取溫度60 ℃，液料比15 mL/g，NaOH質(zhì)量濃度5%以及提取次數(shù)3次。驗(yàn)證性試驗(yàn)中實(shí)際測(cè)得堿溶性多糖平均提取率為10.98%，證明該優(yōu)化工藝穩(wěn)定可靠，切實(shí)可行。

赤靈芝；正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)；堿溶性純化多糖；提取工藝

赤靈芝(Ganoderma lucidum)屬擔(dān)子菌綱(Basidiomycetes)多孔菌目(Polyporales)靈芝科(Ganodermatcet)靈芝屬(Ganoderma)，是一種珍貴的藥、食兩用高等真菌[1]，具有扶正固本、抗腫瘤、免疫活性、滋補(bǔ)強(qiáng)壯、抗放射之功效[2]。研究表明[3]，赤靈芝含有多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、多肽、萜類(lèi)、甾類(lèi)、生物堿、有機(jī)酸揮發(fā)油、多種酶、鏈烷烴以及和油脂等。其中靈芝多糖是靈芝中主要有效成分之一，藥理研究表明[4-5]，堿溶性多糖具有良好的體外抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)作用，為了提高赤靈芝堿溶性多糖的提取率，本文采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

赤靈芝購(gòu)自山東泰安；NaOH、無(wú)水乙醇、苯酚、濃H2SO4均為分析純。Seven Compact S220多參數(shù)測(cè)定儀，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Inifnite M200 Pro酶標(biāo)儀，Tecan Austria Gmbh；DHG-9246A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；TD5A-WS臺(tái)式低速離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；BZFS-02型萬(wàn)能高速粉碎機(jī)，西安寶正實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 堿溶性多糖的提取

先將赤靈芝子實(shí)體置于50℃烘箱中烘干，粉碎過(guò)2號(hào)篩，95%乙醇超聲脫脂3次，棄去濾液，殘?jiān)糜?0℃烘箱中烘干，超微粉碎，過(guò)200目篩，得赤靈芝子實(shí)體粉。稱(chēng)取5 g，按一定條件（提取時(shí)間、提取溫度、液料比、堿濃度和提取次數(shù)）進(jìn)行提取，離心，濾液4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 堿溶性多糖的純化

采用Sevage法脫蛋白[6]，脫蛋白多糖溶液加入適量無(wú)水乙醇，使乙醇終濃度為30%，置4℃冰箱中沉淀過(guò)夜，5000 r/min離心15 min，棄去沉淀，上清液再加入無(wú)水乙醇使乙醇終濃度為70%，置4℃冰箱中沉淀過(guò)夜，5000 r/min離心15 min，棄去上清液，所得沉淀經(jīng)真空干燥既得赤靈芝堿溶性純化多糖。

1.2.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

精密稱(chēng)取105℃干燥至恒重的無(wú)水葡萄糖100 mg，置于250 mL容量瓶中， 加蒸餾水使溶解并定容至刻度，搖勻即得濃度為0.40 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密量取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL置于具塞試管中，分別加蒸餾水至2.0mL，另取蒸餾水2.0mL作為空白對(duì)照，各加5%苯酚（重蒸）溶液1.0mL，搖勻，再各加濃硫酸5.0 mL，迅速搖勻，于室溫下放置30 min，于波長(zhǎng)490 nm下測(cè)定吸光度。以吸光度（A）對(duì)葡萄糖溶液濃度（C）作回歸處理，得回歸方程：A=9.527C+0.0065，R2=0.9993，具有良好的線(xiàn)性相關(guān)。

1.2.4 堿溶性多糖提取率（%）的測(cè)定

稱(chēng)取20 mg干燥的赤靈芝純化多糖樣品， 溶于適量熱蒸餾水中，冷至室溫后定容至250 mL，用硫酸-苯酚法[7]測(cè)定多糖含量。多糖提取率計(jì)算公式為（%）=所測(cè)多糖含量（g）×100%/供試赤靈芝子實(shí)體粉重量（g）。

1.2.5 單因素試驗(yàn)

在固定其他條件不變的基礎(chǔ)上，分別考察提取時(shí)間(X1)、提取溫度(X2)、液料比(X3)、堿濃度(X4)和提取次數(shù)(X5)對(duì)赤靈芝堿溶性多糖提取率的影響，每組試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.6 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)

以提取時(shí)間、提取溫度、液料比、堿濃度和提取次數(shù)為試驗(yàn)因素，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)一個(gè)5因素4水平試驗(yàn)16次的正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，即L16(45)設(shè)計(jì)表，因素水平見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)堿溶性多糖提取率的影響

在試驗(yàn)條件為提取溫度60℃、液料比20 mL/g、NaOH濃度5%、提取次數(shù)1次的條件下，提取時(shí)間分別選擇為1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，先是隨著提取時(shí)間的增加，堿溶性多糖的提取率不斷提高，但2 h之后，隨著時(shí)間增加反而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，因此確定提取時(shí)間為2 h。

2.1.2 提取溫度對(duì)堿溶性多糖提取率的影響

在試驗(yàn)條件為提取時(shí)間2 h、液料比20 mL/g、NaOH濃度5%、提取次數(shù)1次的條件下，提取溫度分別選擇為40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，一開(kāi)始隨著提取溫度的升高多糖提取率顯著增加，當(dāng)溫度超過(guò)60℃時(shí)，由于高溫條件下會(huì)導(dǎo)致部分多糖水解，從而導(dǎo)致多糖提取率明顯降低，因此確定提取溫度為60℃。

2.1.3 液料比對(duì)堿溶性多糖提取率的影響

在試驗(yàn)條件為提取溫度60℃、提取時(shí)間2 h、NaOH濃度5%、提取次數(shù)1次的條件下，液料比分別選擇為10 mL/g、15 mL/g、20 mL/g、25 mL/g、30 mL/g、35 mL/g進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，隨著液料比增大，多糖提取率先是也隨之增大，但當(dāng)液料比增到20 mL/g后，提取率趨于穩(wěn)定，所以確定液料比為20 mL/g。

2.1.4 堿濃度對(duì)堿溶性多糖提取率的影響

在試驗(yàn)條件為提取溫度60℃、提取時(shí)間2 h、液料比20 mL/g、提取次數(shù)1次的條件下，NaOH濃度分別選擇為1%、3%、5%、7%、9%、11%進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，隨著NaOH濃度的增大，堿溶性多糖的提取率不斷地增大，但當(dāng)NaOH 濃度超過(guò)5%時(shí)，由于部分多糖堿水解程度加劇，導(dǎo)致提取率顯著降低，因此確定NaOH濃度為5%。

2.1.5 提取次數(shù)對(duì)堿溶性多糖提取率的影響

在試驗(yàn)條件為提取溫度60℃、提取時(shí)間2 h、液料比20 mL/g、NaOH濃度5%的條件下，提取次數(shù)分別選擇為1、2、3、4、5、6次進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，堿溶性多糖的提取率隨著提取次數(shù)的增加而增加，當(dāng)提取次數(shù)超過(guò)3次后，提取率變化基本趨于穩(wěn)定，故提取次數(shù)選擇為3次。

2.2 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果與方差分析

L16(45)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)及方差分析結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

由直觀分析表2顯示，各因素水平提取率均值最大值分別為：X1、X2和X3均為均值2，X4和X5均為均值3，即赤靈芝堿溶性多糖經(jīng)過(guò)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化的最佳提取工藝為提取時(shí)間2 h，提取溫度60℃，液料比15 mL/g，堿濃度5%和提取次數(shù)3次。極差大小順序?yàn)椋篨1＞X2＞X5＞X4＞X3，表明各因素對(duì)多糖提取率的影響程度大小為提取時(shí)間最大，液料比最小，因此在提取過(guò)程中我們要嚴(yán)格控制好提取時(shí)間和溫度。

由方差分析表3我們也可以看出，各因素的F值大小順序?yàn)椋篨1＞X2＞X5＞X4＞X3，結(jié)果反映的各因素對(duì)多糖提取率影響程度大小順序與直觀分析表結(jié)果一致，同時(shí)提取時(shí)間對(duì)提取率的影響具有顯著性差異(P＜0.05)。

表2 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果直觀分析

表3 方差分析結(jié)果

2.3 驗(yàn)證性試驗(yàn)

為驗(yàn)證正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果，以單因素試驗(yàn)確定的最佳水平組合為對(duì)照作驗(yàn)證性試驗(yàn)，試驗(yàn)重復(fù)3次。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

由表4可看出，單因素試驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)所確定的最佳提取工藝唯一的區(qū)別在于液料比的不同，從多糖提取率平均值比較，二者沒(méi)有顯著性差異，并且考慮到節(jié)約溶劑和能源，縮短濃縮時(shí)間，RSD值也較小，說(shuō)明正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化的赤靈芝堿溶性多糖提取工藝是穩(wěn)定高效的，對(duì)生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)意義。

3 結(jié)論

本研究利用單因素試驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，分別考察了提取時(shí)間、提取溫度、液料比、堿濃度和提取次數(shù)對(duì)赤靈芝堿溶性多糖提取率的影響，試驗(yàn)結(jié)果表明，提取時(shí)間對(duì)堿溶性多糖提取率具有顯著影響(P＜0.05)，然后從大到小依次是提取溫度，提取次數(shù)，NaOH濃度和水料比。

通過(guò)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)確定的赤靈芝堿溶性多糖最佳提取工藝是提取時(shí)間2 h，提取溫度60℃，液料比15 mL/g，堿濃度5%和提取次數(shù)3次，驗(yàn)證性試驗(yàn)表明，該工藝條件穩(wěn)定性更好，赤靈芝子實(shí)體堿溶性多糖提取率高達(dá)10.98%，與單因素試驗(yàn)結(jié)果基本一致，且更節(jié)約能源。因此，正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)用于優(yōu)化赤靈芝堿溶性多糖提取工藝是穩(wěn)定可靠、切實(shí)可行的，可用于生產(chǎn)預(yù)測(cè)。

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ISSN.2095-6681.2016.03.0183.02