王英，洪偉勇，王金明

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053； 2.臺(tái)州市立醫(yī)院藥劑科，浙江 臺(tái)州 318000

高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定大血藤中原兒茶酸和綠原酸的含量

王英1，2，洪偉勇2，王金明2

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053； 2.臺(tái)州市立醫(yī)院藥劑科，浙江 臺(tái)州 318000

目的：建立高效液相色譜法測(cè)定大血藤中原兒茶酸和綠原酸的含量。方法：使用ODS2 C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）色譜柱。以甲醇-0.2%甲酸水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速1 mL/min，柱溫為30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：原兒茶酸在0.017 0～1.70 mg/mL的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，加樣回收率為97.83%，RSD為2.31%；綠原酸在0.015 2～1.52 mg/mL的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，加樣回收率為96.87%，RSD為1.69%。結(jié)論：高效色相色譜法測(cè)定大血藤中原兒茶酸和綠原酸的方法具有專屬性強(qiáng)、回收率高、重復(fù)性好等突出特點(diǎn)，能夠比較快速、準(zhǔn)確地測(cè)定大血藤藥材中原兒茶酸和綠原酸的含量。

高效液相色譜法；大血藤；原兒茶酸；綠原酸

大血藤為木通科植物大血藤Sargentodoxa cuneata(Oliv.) Rehd.et Wils的干燥藤莖，具有活血、祛瘀、清熱解毒等功效，主要用于跌打損傷、風(fēng)濕痹痛、痛經(jīng)、腸癰腹痛等[1～2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，大血藤含有的化學(xué)成分具有較明顯的抗炎、抑菌、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)等作用[3]。大血藤中含有的原兒茶酸和綠原酸具有多方面的藥理活性，但關(guān)于其含量測(cè)定的報(bào)道相對(duì)較少。筆者采用高效液相色譜法測(cè)定大血藤中原兒茶酸和綠原酸的含量，以期為控制大血藤藥材質(zhì)量提供依據(jù)。

1 儀器與藥品

1.1 儀器 安捷倫高效液相色譜儀(包括柱溫箱，自動(dòng)進(jìn)樣器，泵，紫外檢測(cè)器)；BT25S型電子分析天平(北京賽多利斯分析儀器有限公司)，電熱恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械五廠)，2500DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，DFT-50手提式高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)。

1.2 藥品 原兒茶酸(中國(guó)食品藥品檢定所研究院，110761-201409)；綠原酸(中國(guó)食品藥品檢定所研究院，110542-201410)；甲醇(色譜純，西隴化工有限公司，20140318)；甲酸(Sigma公司，分析純)；大血藤藥材購(gòu)自河北安國(guó)藥材市場(chǎng)，經(jīng)鑒定為木通科植物大血藤的干燥藤莖；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Dkima ODS2 C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)。以甲醇(A)-0.2%甲酸水(B)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫程序：10%～25%B(0～20 min)；25%B(20～35 min)；25%～10%B(35～40 min)。流速：1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm，柱溫：30℃。

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 取原兒茶酸、綠原酸對(duì)照品適量，精密稱定，將其置于50 mL量瓶中，加適量的甲醇使其溶解并定容至刻度，搖勻，即得濃度為0.170 mg/mL、0.152 mg/mL的混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，備用。

2.3 供試品溶液的制備 取大血藤藥材飲片適量，烘干、粉碎、過(guò)篩，取粉末(過(guò)65目)約0.5 g，精密稱定，置具塞的錐形瓶中，精密加入25 mL甲醇，精密稱定，超聲提取(功率300 W，頻率50 kHz)30 min，放涼，再精密稱定，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 mL，置于10 mL的量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻。精密吸取各對(duì)照品溶液10 μL注入高效液相色譜儀，照2.1項(xiàng)的色譜條件測(cè)定原兒茶酸和綠原酸的峰面積。以原兒茶酸、綠原酸濃度對(duì)其峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得原兒茶酸的回歸方程為：Y1=76493X-48953，r= 0.999 6。綠原酸的回歸方程為：Y2=69821X-49731，r= 0.999 4。結(jié)果表明，原兒茶酸在0.017 0～1.70 μg的范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系；綠原酸在0.015 2～1.52 μg的范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 取大血藤供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣量均為10 μL，按照2.1項(xiàng)的色譜條件測(cè)定，計(jì)算原兒茶酸峰面積的RSD值為1.97%，綠原酸峰面積的RSD值為1.75%。結(jié)果表明，精密度良好，符合含量測(cè)定的基本要求。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液，于0、2、4、6、8、12、24 h精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀，按照2.1項(xiàng)的色譜條件測(cè)定，計(jì)算原兒茶酸峰面積的RSD值為1.99%，綠原酸面積的RSD值為2.03%，結(jié)果表明，原兒茶酸和綠原酸在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批大血藤藥材粉末(過(guò)65目)，按照2.3項(xiàng)的方法平行制備6份樣品，分別精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀，按照2.1項(xiàng)的色譜條件測(cè)定，計(jì)算原兒茶酸峰面積的RSD值為1.67%，綠原酸峰面積的RSD值為1.46%。結(jié)果表明，用該方法測(cè)定大血藤中原兒茶酸和綠原酸的含量，重復(fù)性較好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批已知原兒茶酸和綠原酸含量的大血藤藥材粉末(過(guò)65目)6份，每份約0.2 g，精密稱定，分別加入混合對(duì)照品溶液適量，按照2.3項(xiàng)的方法制備溶液，分別精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀，按照2.1項(xiàng)的色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1、表2。

表1 原兒茶酸加樣回收率 %

表2 綠原酸加樣回收率 %

2.9 樣品含量測(cè)定 根據(jù)已建立的含量測(cè)定方法，取3批大血藤藥材粉末(過(guò)65目)，每批3份，稱取適量，按照2.3項(xiàng)的方法制備樣品，并根據(jù)2.1項(xiàng)的色譜條件測(cè)定其峰面積，分別代入線性回歸方程，計(jì)算大血藤藥材中原兒茶酸和綠原酸的含量，結(jié)果見(jiàn)表3、表4。

表3 原兒茶酸含量測(cè)定結(jié)果(n=3) %

表4 綠原酸含量測(cè)定結(jié)果(n=3) %

3 討論

現(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果表明，大血藤中含有多種化學(xué)物質(zhì)，其中所含有的原兒茶酸具有較強(qiáng)的抗菌作用，對(duì)大腸桿菌、傷寒桿菌、痢疾桿菌及枯草桿菌等均有不同程度的抑菌作用；綠原酸具有抗菌、消炎、抗病毒、抗腫瘤、降血壓、降血脂等作用[4～6]。因而建立大血藤中原兒茶酸和綠原酸的含量測(cè)定方法，可為控制大血藤藥材的質(zhì)量提供依據(jù)。

本研究分別考察了加熱回流提取法、超聲提取法的效果，結(jié)果顯示，2種方法提取的原兒茶酸和綠原酸含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但受熱時(shí)間及溫度對(duì)原兒茶酸和綠原酸含量的影響有較大的差異，受熱時(shí)間越長(zhǎng)、溫度越高，原兒茶酸和綠原酸含量越低，故本研究采用超聲提取。本研究同時(shí)對(duì)流動(dòng)相的種類及比例進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示，采用甲醇和0.2%甲酸水作為流動(dòng)相，并采用梯度洗脫時(shí)，可獲得出峰時(shí)間、分離度及峰形等均較好的圖譜。

綜上所述，筆者建立的高效色相色譜法測(cè)定大血藤中原兒茶酸和綠原酸的方法，具有專屬性強(qiáng)、回收率高、重復(fù)性好等突出特點(diǎn)，能夠比較快速、準(zhǔn)確地測(cè)定大血藤藥材中原兒茶酸和綠原酸的含量，可為大血藤藥材質(zhì)量的評(píng)定提供一定的依據(jù)。

[1]李宛蓉，桂雙英，王舉濤，等.不同產(chǎn)地大血藤藥材指紋圖譜研究及紅景天苷和綠原酸的含量測(cè)定[J].安徽中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，33(6)：82-86.

[2]丁越，張永，丁文平，等.HPLC測(cè)定大血藤藥材中綠原酸的含量[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19(4)：99-102.

[3]李霞，楊穎博，李君麗，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定皺皮木瓜中原兒茶酸和綠原酸的含量[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012，9 (34)：110-112.

[4]韋建華，李耀華，梁臣艷，等.HPLC測(cè)定桑葉配方顆粒中原兒茶酸、綠原酸和咖啡酸[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17(3)：93-95.

[5]周燕園.HPLC測(cè)定醋五味子配方顆粒中的原兒茶酸和綠原酸[J].華西藥學(xué)雜志，2014，29(6)：688-690.

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（責(zé)任編輯：吳凌）

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0256-7415（2016）02-0241-03

10.13457/j.cnki.jncm.2016.02.093

2015-10-10

王英（1982-），女，主管中藥師，主要從事藥物方面的研究工作。