史珣貝林昶楊仕明吳南

1福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科,福建省耳鼻咽喉研究所(福州350005)

2解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，解放軍耳鼻咽喉研究所，聾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（北京100853）

·技術(shù)與方法·

過表達(dá)mitf基因腺相關(guān)病毒的構(gòu)建與鑒定

史珣貝1林昶1楊仕明2吳南2

1福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科,福建省耳鼻咽喉研究所(福州350005)

2解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，解放軍耳鼻咽喉研究所，聾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（北京100853）

目的獲得能夠過表達(dá)小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(mitf）的重組腺相關(guān)病毒載體，用于mitf基因突變相關(guān)疾病的基因治療。方法利用PCR擴(kuò)增獲得目的基因，構(gòu)建攜帶目的基因mitf的重組腺相關(guān)病毒載體，利用人工脂質(zhì)體法將pAAV-RC，pHelper,以及pAAV-GFP系列載體轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中，采用細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒DNA同源重組法進(jìn)行重組腺相關(guān)病毒載體構(gòu)建，利用柱純化法純化病毒載體，qPCR法測(cè)定重組腺相關(guān)病毒載體滴度，病毒載體感染HEK293細(xì)胞進(jìn)行病毒有效性及安全性鑒定，real-time PCR與western blot法進(jìn)行mitf表達(dá)的鑒定。結(jié)果PCR擴(kuò)增和測(cè)序結(jié)果一致證實(shí)成功獲得目的基因并且成功構(gòu)建mitf基因腺相關(guān)病毒載體，測(cè)得高水平病毒滴度1.0*10^12vg/ml，病毒載體感染HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率為86.3%，并未發(fā)現(xiàn)HEK293細(xì)胞死亡，Real-time PCR及Western blot檢測(cè)構(gòu)建Mitf基因轉(zhuǎn)錄mRNA與表達(dá)的蛋白與正常MITF一致。結(jié)論成功構(gòu)建的攜帶mitf基因的重組腺相關(guān)病毒載體為未來進(jìn)行mitf突變導(dǎo)致的遺傳性疾病的基因治療提供新思路。

MITF；腺相關(guān)病毒；基因治療

Foundation item：National 863 project young scientists(2014AA020510);the National Natural Science Foundation of China(NSFC# 81271082,81400472).Special Cultivating and Developing Program of Beijing Science and Technology Innovation Base（z151100001615050)；Key Projects of Fujian Provincial Science and Technology Department(2014I0003);Innovation and drive power engineering project of China association for science and technology（2016CXQD01）.

Declaration of interest:The authors report to no conflicts of interest.

小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（MITF）位于小鼠6號(hào)染色體，人類染色體3p12.3–14.1位點(diǎn)，由Mitf基因編碼的含有419個(gè)氨基酸，分子量大小約為46kDa，具有組織特異性的，含有堿性螺旋-環(huán)-螺旋亮氨酸拉鏈（bHLH-Zip）的二聚體結(jié)構(gòu)[1-3]。Mitf通過bHLH-Zip結(jié)構(gòu)域識(shí)別位于靶基因啟動(dòng)子區(qū)上的E-box特異序列（CATGTG），結(jié)合后啟動(dòng)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄[4]。MITF對(duì)于黑色素細(xì)胞，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，肥大細(xì)胞以及破骨細(xì)胞的發(fā)育以及維持細(xì)胞形態(tài)都有重要的作用[5]。因此，MITF突變會(huì)造成多種疾病發(fā)生，例如Waardenburg綜合征，視網(wǎng)膜退行性變，先天小眼球病等疾病。以往研究中使用的動(dòng)物模型大多是嚙齒類動(dòng)物（小鼠、大鼠、豚鼠等），或是靈長(zhǎng)類動(dòng)物，嚙齒類動(dòng)物在遺傳學(xué)方面與人類相差甚遠(yuǎn)，而靈長(zhǎng)類動(dòng)物則存在倫理學(xué)問題。豬是除靈長(zhǎng)類以外跟人類進(jìn)化關(guān)系最相近的物種，并且沒有靈長(zhǎng)類動(dòng)物倫理方面問題，因此以豬為動(dòng)物模型的科學(xué)研究逐漸增多，在繁殖生理學(xué)、轉(zhuǎn)基因、皮膚生理學(xué)、干細(xì)胞移植等方面都已經(jīng)進(jìn)行了廣泛的研究[6-7]。因此本實(shí)驗(yàn)根據(jù)正常豬的mitf基因設(shè)計(jì)引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增目的基因MITF，重組腺相關(guān)病毒載體構(gòu)建、包裝、純化、滴度測(cè)定以及表達(dá)鑒定，成功構(gòu)建過表達(dá)mitf腺相關(guān)病毒載體，為未來在mitf基因突變疾病的基因治療中奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

AAV-CAG-ZsGreen載體由漢恒生物公司提供，NheI和KpnI酶購(gòu)自Fermentas公司，T4連接酶購(gòu)自Fermentas公司，大腸桿菌菌株stbl3購(gòu)自Tiangen公司，抽提質(zhì)粒試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)，胰酶購(gòu)自Hy?clone公司，HEK293細(xì)胞由漢恒生物公司提供，Li?pofiterTM轉(zhuǎn)染試劑由漢恒生物公司提供，DNase I及蛋白酶K購(gòu)自Fermentas公司，Trizol購(gòu)自Gibco公司，RIPA裂解液購(gòu)自碧云天公司，PVDF膜購(gòu)自Millipore公司，MITF雙抗購(gòu)自Invitrogen公司，β-actin購(gòu)自In?vitrogen公司，SDS-PAGE分離膠購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重組腺相關(guān)病毒的構(gòu)建

根據(jù)已知目的基因MITF(sus scrofa,Gene ID:NM_ 001038001.1)cDNA序列設(shè)計(jì)合成基因擴(kuò)增引物，利用化學(xué)合成法獲取目的基因。目的片斷插入Nhe I和Kpn I位點(diǎn)，由CAG啟動(dòng)子調(diào)控表達(dá)，CAG啟動(dòng)子后為多克隆位點(diǎn)區(qū)，載體中含有ZsGreen標(biāo)記基因，PCR擴(kuò)增MITF基因,引物設(shè)計(jì)為F5’-ATATGCTAG?CACGCGTGCCACCATGCTGGAAATG-TAGAATATAAT-3’，R5’-ATATGGTACCGCAAGCATGCTCGGTTTCTTCCAT-3’。

AAV-CAG-ZsGreen載體用Nhe I和Kpn I酶切，酶切完成后進(jìn)行膠回收。利用PCR高溫變性94℃20s，低溫退火55℃20s，引物延伸72℃90s，共25個(gè)循環(huán)，獲得的目的基因MITF片段，在T4連接酶作用下與載體進(jìn)行連接反應(yīng)。氨芐霉素抗性板上37℃培養(yǎng)過夜，在感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌菌株stbl3中轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后的MITF平板挑菌,37℃250轉(zhuǎn)/分鐘搖菌14小時(shí)，菌液進(jìn)行PCR鑒定，將陽(yáng)性克隆菌液送測(cè)序公司測(cè)序，進(jìn)行測(cè)序結(jié)果比對(duì)。

1.2.2 腺相關(guān)病毒包裝

用抽提質(zhì)粒試劑盒大量提取質(zhì)粒，0.25%胰酶加入到HEK293細(xì)胞中充分消化細(xì)胞，加入預(yù)先預(yù)熱過的10%DMEM混勻，取出50μl細(xì)胞懸液再次加入10%DMEM，即為10倍稀釋，混勻，取10ul細(xì)胞于計(jì)數(shù)板中計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)板共4大格16小格。觀察細(xì)胞密度，80-90%滿即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將加入LipofiterTM轉(zhuǎn)染試劑的含有pAAV-RC 10μg，pHelper 20μg，以及pAAV-GFP系列載體的混合物共轉(zhuǎn)染AAV-293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后72h，將培養(yǎng)皿中所有細(xì)胞用收于離心管中，將離心管在液氮及37℃水浴反復(fù)凍融三次。離心收集含病毒的上清液。用全能核酸酶處理37℃孵育1h，離心取上清液，得到的AAV病毒液加入樹脂柱進(jìn)行柱純化，收集最終得到的純化后的病毒，于-70°C保存。

1.2.3 重組AAV-MITF滴度的鑒定

DNase I及蛋白酶K反應(yīng)液消化AAV病毒樣品。用PCR緩沖液將稀釋標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成不同拷貝梯度105、106、107、108、109、1010。QPCR測(cè)定，反應(yīng)體系為2X mix 4.8μl，引物-F 0.4μl，引物-R 0.4μl，模板1μl，水3μl。經(jīng)一次95°C 180s預(yù)變性后，94°C 30s變性，62°C 30s退火，72°C 30s延伸，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，利用統(tǒng)計(jì)軟件數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 重組AAV-MITF感染HEK293細(xì)胞

傳代HEK293細(xì)胞至96孔板，直至10^4細(xì)胞/孔進(jìn)行轉(zhuǎn)染。次日，純化后的重組AAV-MITF-GFP轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，每孔加入5μl過表達(dá)mitf重組腺相關(guān)病毒載體。轉(zhuǎn)染后三天熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況。

1.2.5 重組AAV-MITFReal-timePCR及westernblot檢測(cè)

取目的病毒和等滴度的對(duì)照病毒感染HEK293細(xì)胞，48小時(shí)后回收細(xì)胞。一部分細(xì)胞先后加入裂解液Trizol混勻裂解，提取RNA。95℃180s預(yù)變性后，經(jīng)過高溫退火94℃15s，低溫變性60℃30s，引物延伸72攝氏度30s，共40個(gè)循環(huán)。利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA提取質(zhì)量，并通過RNA瓊脂糖凝膠電泳分析。剩下一部分細(xì)胞加入1mlRIPA裂解液10μlPMSF，充分裂解離心，取上清液。配置10% SDS-PAGE分離膠，5%濃縮膠，將上清液加入上樣孔中，以110V恒壓條件電泳，直至出現(xiàn)溴酚藍(lán)指示劑，停止電泳。將PVDF膜預(yù)先用5%牛血清室溫封閉1h，以110V恒壓將膠上的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)PVDF膜上，用MITF一抗（1：1000）及β-actin（1：1000）4℃過夜孵育，TBST洗膜3遍后加入二抗（1：1000）室溫孵育1h，進(jìn)行Western-blot蛋白檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 重組腺相關(guān)病毒AAV-MITF的構(gòu)建及鑒定

利用PCR獲取MITF目的基因（圖1），MITF長(zhǎng)度為1242bp，插入到pAAV-CAG-ZsGreen過表達(dá)載體，插入位點(diǎn)為Nhe I和Kpn I位點(diǎn)，由CAG啟動(dòng)子調(diào)控表達(dá)，載體中含有ZsGreen標(biāo)記基因。重組腺相關(guān)病毒由氨卞霉素挑選出陽(yáng)性克隆菌液，菌液進(jìn)行PCR鑒定（圖2）。DNA測(cè)序結(jié)果顯示克隆MITF基因與正常MITF基因序列一致。

圖1 PCR獲取目的基因MITFFig.1 Target gene MITF via PCR

圖2 單克隆PCR鑒定結(jié)果Fig.2 Results of monoclonal PCR identification

2.2 重組腺相關(guān)病毒AAV-MITF的滴度測(cè)定

統(tǒng)計(jì)軟件得到原始數(shù)據(jù)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的函數(shù)公式及R平方值。根據(jù)曲線的函數(shù)公式，計(jì)算待測(cè)AAV樣品對(duì)應(yīng)的拷貝數(shù)對(duì)數(shù)X，進(jìn)一步換算成拷貝數(shù)10X及病毒滴度vg/ml。測(cè)得mitf病毒滴度為1.0* 10^12vg/ml。

2.3 重組腺相關(guān)病毒AAV-MITF感染HEK293細(xì)胞

重組腺相關(guān)病毒AAV-MITF轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞3天后，在熒光顯微鏡下持續(xù)觀察96h轉(zhuǎn)染結(jié)果。圖中顯示隨機(jī)選取96孔板中的3孔轉(zhuǎn)染病毒載體后在熒光顯微鏡下觀察白光和對(duì)應(yīng)區(qū)域熒光下的觀察結(jié)果（圖3）。計(jì)數(shù)每孔中出現(xiàn)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)后取平均值，計(jì)算出有86.3%的HEK293細(xì)胞被成功轉(zhuǎn)染，未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染病毒后出現(xiàn)HEK293細(xì)胞死亡現(xiàn)象。

圖3 AAV-MITF感染293細(xì)胞情況（圖1、2、3分別為隨機(jī)3孔細(xì)胞在同一區(qū)域白光和對(duì)應(yīng)熒光的觀察結(jié)果）Fig.3 AAV-MITF infection in 293 cells（Figures3(1),(2),(3) are the results of the observation of the white light and the corresponding fluorescence in the same region,respectively)

2.4 MITF基因Real-timePCR鑒定及Westernblot鑒定

病毒感染293細(xì)胞48小時(shí)后回收一部分細(xì)胞進(jìn)行總RNA提取，經(jīng)檢測(cè)目的基因病毒載體AAV-MITF及對(duì)照病毒載體經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)得OD260/OD280及OD260/OD230比值均在正常范圍內(nèi)，表示RNA在提取分別測(cè)得RNA濃度為382ng/ μl，306ng/μl（圖1）。提取后的總RNA進(jìn)行qPCR檢測(cè)，RNA瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果如下（圖5）。另一部分細(xì)胞制備蛋白樣品進(jìn)行western-blot檢測(cè)，經(jīng)免疫反應(yīng)、化學(xué)發(fā)光成像后，結(jié)果顯示AAV-MITF可以在293細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)MITF蛋白（圖6）。

表4 紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA提取質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果Table 4 UV spectrophotometer detection of RNA extraction quality test results

圖5 RNA瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果Fig.5 Results of RNAagarose gel electrophoresis(M:DL2000 DNA ladder，條帶自上而下為2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp；1：vector；2：OE)

圖6 western blot檢測(cè)mitf表達(dá)情況Fig.6 Western blot detection of mitf expression(1：vector；2：MITF過表達(dá)樣品)

3 討論

MITF基因具有多啟動(dòng)子，它至少有9種不同的啟動(dòng)子-外顯子結(jié)構(gòu)來決定MITF的不同類型，因此MITF存在不同亞型，它由第一個(gè)外顯子以及不同啟動(dòng)子決定，下游外顯子是相同的，而不同亞型表達(dá)在不同細(xì)胞內(nèi)[5,8]。MITF-M mRNA特異性表達(dá)在黑色素細(xì)胞中以及黑色素瘤細(xì)胞中，在其他細(xì)胞類型中沒有發(fā)現(xiàn)，包括人類視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞[9]。MITF-M與特異性的色素酶基因（酪氨酸酶TYR，酪氨酸酶相關(guān)蛋白TYRP，多巴色素互變異構(gòu)酶DCT）作用，調(diào)控黑色素細(xì)胞的存活與分化[1]。MITF在多種組織器官中都對(duì)于特定細(xì)胞的發(fā)育與分化起到至關(guān)重要的作用。Paula Hertwig從接受X射線66號(hào)治療的小鼠后代中出現(xiàn)的小眼白色小鼠中發(fā)現(xiàn)并且介紹了第一個(gè)小鼠Mitf突變，直至目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了超過24種自發(fā)和誘導(dǎo)的Mitf等位基因突變位點(diǎn)[10]。Mitf突變會(huì)導(dǎo)致多種遺傳性疾病，例如研究較為廣泛的Waardenburg綜合征。Waardenburg綜合征分為四型，其中Waardenburg綜合征II型是一種先天性遺傳性疾病，表現(xiàn)為先天性聾，色素異位。我們研究團(tuán)隊(duì)在中國(guó)重慶榮昌縣發(fā)現(xiàn)一個(gè)與人類Waardenburg綜合征表型高度一致的豬種，已經(jīng)確定榮昌豬的耳聾突變家系就是由于MITF突變導(dǎo)致，并且進(jìn)一步研究表明是由于MITF-M出現(xiàn)插入突變導(dǎo)致。內(nèi)耳的黑色素細(xì)胞位于血管紋的中間細(xì)胞，血管紋的主要功能是分泌鉀離子產(chǎn)生內(nèi)淋巴電位。根據(jù)文獻(xiàn)研究表明MITF-M突變的白化榮昌豬毛細(xì)胞和靜纖毛缺失，血管紋變薄，只剩兩層細(xì)胞結(jié)構(gòu)，檢測(cè)不到可識(shí)別的ABR波形，內(nèi)淋巴電位（EPs)和鉀離子濃度都低于正常豬。由于EPs和高鉀環(huán)境是毛細(xì)胞將機(jī)械能轉(zhuǎn)換成電能的主要驅(qū)動(dòng)力，所以EPs減少及鉀離子濃度減低會(huì)造成極重度耳聾[11]。遺傳性耳聾目前主要通過助聽器及人工耳蝸植入方式治療，雖取得一定的治療效果，但是花費(fèi)巨大，因此科學(xué)家們將基因治療作為遺傳性耳聾治療的研究重點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)中我們通過查找豬來源MITF的片段設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲取MITF目的基因，單克隆CPR鑒定結(jié)果以及測(cè)序結(jié)果表明構(gòu)建的MITF基因與野生型MITF基因一致，這表明此構(gòu)建的過表達(dá)mitf重組腺相關(guān)病毒載體可以為未來進(jìn)行以白化榮昌豬為動(dòng)物模型進(jìn)行遺傳性耳聾基因治療提供研究基礎(chǔ)。

在以往的研究中，曾經(jīng)有研究者通過重組腺病毒載體包載野生型mitf基因轉(zhuǎn)染B16小鼠黑色素瘤細(xì)胞以及人類黑色素細(xì)胞[12]。但腺病毒不能整合到宿主的基因組中，并且會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫原性[13]。而腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus,AAV)是一類單鏈線狀DNA缺陷型病毒，是目前所發(fā)現(xiàn)的動(dòng)物病毒中最小的病毒，其基因組DNA小于5kb，無包膜，外形為裸露的20面體顆粒[14]。在病毒載體中它的優(yōu)勢(shì)在于：1.安全性高；2.免疫原性弱；3.宿主范圍廣；4.物理性質(zhì)穩(wěn)定；5.表達(dá)穩(wěn)定[13]。所以腺相關(guān)病毒是目前基因治療中常用的載體之一，并且已經(jīng)取得了初步的研究結(jié)果。Omar Akil利用Vglut3基因敲除小鼠模型，將AAV1-VGLIT3-GFP導(dǎo)入小鼠耳蝸中，成功使耳聾小鼠ABR閾值恢復(fù)至正常范圍內(nèi)，并且至少持續(xù)7w，其中有兩只小鼠可以保持1年半[13,15]。因此本實(shí)驗(yàn)選用腺相關(guān)病毒包載目的基因mitf，利用雙酶切方法構(gòu)建過表達(dá)mitf基因重組腺相關(guān)病毒載體，并進(jìn)行了純化及滴度測(cè)定，證明此構(gòu)建的過表達(dá)Mitf重組腺相關(guān)病毒載體具有有效滴度。轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞結(jié)果顯示綠色熒光蛋白在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)率為86.3%，并且無HEK293細(xì)胞死亡現(xiàn)象，證明病毒載體具有安全性和有效性。Western blot及RT-PCR檢測(cè)證明過表達(dá)mitf基因重組腺相關(guān)病毒載體可以有效轉(zhuǎn)錄出正常Mitf基因的mRNA并且可以表達(dá)出正常的MITF蛋白，大小為46KDa。本次研究首次成功構(gòu)建過表達(dá)mitf重組腺相關(guān)病毒載體，這一載體的構(gòu)建不僅為白化榮昌豬遺傳性耳聾的基因治療提供基礎(chǔ)，也為未來進(jìn)行MITF突變導(dǎo)致的其他遺傳性疾病的基因治療提供新思路。

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Construction and qualification of recombinant mitf adeno-associated virus gene vector

SHI Xunbei1,LIN Chang1,YANG Shiming2WU Nan2
1 Department of Otolaryngology,First Affiliated Hospital,Fujian Medical University,Fuzhou 350005,China
2 Department Otolaryngology-Head and Neck Surgery,Oto-Neurobiology Centre,Institute of Otolaryngology,Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853,China

ObjectiveTo construct a recombinant adeno-associated virus vector for potential gene therapy for mitf mutations.MethodsWe acquired the target gene via PCR amplification.pAAV-RC,pHelper and pAAV-GFP were transfected into HEK293 cells using the artificial liposome method and the recombinant adeno-associated virus vector product was purified via column purification.Titers of the recombinant adeno-associated virus vector were determined by qPCR.The recombinant adeno-associated virus vector was used to infect 293 cells.Real-time PCR and western blot were used to identify expression of the recombinant adeno-associated virus vector carrying mitf.ResultsPCR amplification and DNA sequencing illustrated that the target gene and recombinant adeno-associated virus vector were constructed successfully with high titers (1.0*10^12 vg/ml).Recombinant adeno-associated virus vectors infected 293 cells successfully with an expression efficiency of 86.3%.No cell death was found.The constructed mitf gene was equivalent to the normal mitf gene based on real-time PCR and western blot results.ConclusionThe recombinant adeno-associated virus vector carrying mitf provides a new way of gene therapy for hereditary diseases caused by mitf mutations.

MITF,adeno-associated virus vector,gene therapy

R764

A

1672-2922（2016）06-841-5

2016-12-04審核人：翟所強(qiáng)）

10.3969/j.issn.1672-2922.2016.06.027

國(guó)家863青年科學(xué)家項(xiàng)目(2014AA020510)；國(guó)家自然科學(xué)基金（面上項(xiàng)目81271082，青年基金81400472）；北京科技創(chuàng)新基地培育與發(fā)展專項(xiàng)（z151100001615050）；福建省科技廳重點(diǎn)項(xiàng)目（2014I0003）；中國(guó)科協(xié)創(chuàng)新驅(qū)動(dòng)助力工程（2016CXQD01）。

史珣貝，研究生，研究方向：毛細(xì)胞再生及基因治療

吳南,Email:maxpanda1979@126.com