翁宇航陳颯周金章劉惠剛龍孝斌

1南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院（廣州510280）

2佛山市順德區(qū)第一人民醫(yī)院（佛山528300）

·基礎(chǔ)研究·

順鉑損傷后幼年斑馬魚(yú)側(cè)線毛細(xì)胞STAT3的表達(dá)及意義

翁宇航1陳颯1周金章2劉惠剛1龍孝斌1

1南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院（廣州510280）

2佛山市順德區(qū)第一人民醫(yī)院（佛山528300）

目的建立斑馬魚(yú)側(cè)線神經(jīng)丘的順鉑損傷模型，檢測(cè)STAT3基因的表達(dá)情況，探討其在毛細(xì)胞順鉑損傷過(guò)程中所發(fā)揮的作用，為抗順鉑耳毒性的研究提供理論依據(jù)。方法將受精后5天的斑馬魚(yú)幼魚(yú)利用250 μM順鉑溶液浸泡3小時(shí)建模，通過(guò)Yo-pro-1熒光染色、TUNEL染色了解毛細(xì)胞損傷情況，利用RT-qPCR、原位雜交等技術(shù)檢測(cè)STAT3基因的表達(dá)改變。結(jié)果使用250 μM順鉑溶液浸泡斑馬魚(yú)幼魚(yú)3小時(shí)，可使其側(cè)線神經(jīng)丘毛細(xì)胞數(shù)降低（P＜0.001），可誘導(dǎo)側(cè)線神經(jīng)丘出現(xiàn)細(xì)胞凋亡（P＜0.001），且在此過(guò)程中，STAT3基因的表達(dá)出現(xiàn)上升（P＜0.001）。結(jié)論STAT3在順鉑對(duì)斑馬魚(yú)側(cè)線神經(jīng)丘毛細(xì)胞的損傷過(guò)程中可能與毛細(xì)胞凋亡相關(guān)并扮演一定角色。STAT3表達(dá)的升高與細(xì)胞凋亡的升高同時(shí)發(fā)生，表明STAT3在一定條件下可能存在促凋亡的作用。

順鉑；斑馬魚(yú)；毛細(xì)胞；損傷；STAT3

順鉑（cisplatin，CDDP）作為臨床常用化療藥物，其應(yīng)用一直因其耳毒性及腎毒性而受到極大限制，如何克服順鉑的毒副作用一直是學(xué)者們研究的焦點(diǎn)。順鉑的耳毒性可造成感音神經(jīng)性耳聾，感音神經(jīng)性耳聾治療的根本方法，是內(nèi)耳感覺(jué)細(xì)胞的修復(fù)或再生[1]；而對(duì)于有明確耳毒性的藥物，通過(guò)阻斷其耳毒相關(guān)通路，預(yù)防耳毒性的發(fā)生，無(wú)疑是最佳應(yīng)對(duì)方法。順鉑耳毒性機(jī)制仍不明確，目前認(rèn)為主要有氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)與細(xì)胞凋亡學(xué)說(shuō)[2]；此外，順鉑的耳毒性還與毛細(xì)胞成熟度、力學(xué)信號(hào)傳導(dǎo)因素、細(xì)胞內(nèi)環(huán)境pH值等因素相關(guān)[3]。斑馬魚(yú)的側(cè)線系統(tǒng)由大量的神經(jīng)丘組成，神經(jīng)丘內(nèi)含感覺(jué)毛細(xì)胞，由于其結(jié)構(gòu)及功能與內(nèi)耳毛細(xì)胞極為相似且便于活體觀察及干預(yù)，現(xiàn)已廣泛用于毛細(xì)胞損傷與再生、遺傳性聾、藥物篩查、行為學(xué)研究等[4]。

目前已經(jīng)證實(shí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子家族（STATs）中的STAT1和STAT6在順鉑毛細(xì)胞損傷中起到促進(jìn)作用[5,6]。最近的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，敲除STAT1后可減少毛細(xì)胞死亡數(shù)量[5]。STATs家族的另一個(gè)成員——STAT3對(duì)細(xì)胞凋亡的作用卻仍存在爭(zhēng)議。本文主要采用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）法及整體原位雜交技術(shù)檢測(cè)斑馬魚(yú)側(cè)線神經(jīng)丘毛細(xì)胞順鉑損傷前后STAT3的表達(dá)變化，探討其在毛細(xì)胞順鉑損傷過(guò)程中所發(fā)揮的作用，為抗順鉑耳毒性的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

野生型AB品系斑馬魚(yú)成魚(yú)由南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院基因工程研究所發(fā)育生物學(xué)教研室提供，養(yǎng)殖于28.5℃系統(tǒng)水中（鹽濃度為0.03%-0.04%，PH7.4-7.5，人工光源控制斑馬魚(yú)生活環(huán)境光照周期，照明14h/黑暗10h交替），養(yǎng)殖系統(tǒng)為北京愛(ài)生公司凈水系統(tǒng)。餌料選用孵育的鹽水蝦，每天上下午各飼喂1次。實(shí)驗(yàn)所用幼魚(yú)由成魚(yú)配卵孵育所得，收集魚(yú)卵前一天挑選1年齡左右的同種品系成年斑馬魚(yú)數(shù)對(duì)（雄性:雌性1:2），放置于安裝有擋板的小培育缸中，雌雄斑馬魚(yú)用擋板隔開(kāi)。收集魚(yú)卵當(dāng)天早晨8:30打開(kāi)光源，撤除培育缸內(nèi)的擋板，斑馬魚(yú)受光照刺激會(huì)出現(xiàn)“追尾”現(xiàn)象，隨后雌魚(yú)產(chǎn)卵。將雌雄斑馬魚(yú)交配后半小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生的受精卵吸出，系統(tǒng)水清洗干凈后放入盛有系統(tǒng)水（加美藍(lán)）的培養(yǎng)皿中，置于28.5℃孵箱中，每天更換培養(yǎng)液并移除壞死的魚(yú)卵，直至胚胎發(fā)育至5 dpf（days-post-fertilization，受精后5天）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與實(shí)驗(yàn)儀器

1.2.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑

順鉑粉劑（P4394-25MG,Sigma），三卡因（MS-222，Sigma），多聚甲醛粉劑（PFA，Sigma），熒光活性染料Yo-pro-1（life），TUNEL試劑盒（Takara），To?tal RNA Isolation Kit試劑盒（TaKaRa）、T7聚合酶（thermo）、DEPC Water（TaKaRa）、6×DNA Lodding Buf?fer、Taq DNA聚合酶（TaKaRa）、RNase Inhibitor（TaKa?Ra）、T4 DNA連接酶（TaKaRa）、HindⅢ限制性內(nèi)切酶（TaKaRa）、BamhⅠ限制性內(nèi)切酶（TaKaRa）、質(zhì)粒提取試劑盒（thermo）、DNA片段純化試劑盒（thermo）、磷酸鹽緩沖液(PBS，南方醫(yī)科大學(xué)試劑中心)

1.2.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器

斑馬魚(yú)養(yǎng)殖單元及反滲透凈水機(jī)（北京愛(ài)生科技），ZSD-A1160A光照培養(yǎng)箱（上海智城分析儀器），BX51正置熒光顯微鏡（Olympus），SZX10體式顯微鏡（Olympus公司），PE9600PCR擴(kuò)增儀（北京東勝創(chuàng)新生物科技），LightCycler?Nano qPCR儀（Roche）

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 模型建立方法

下述同一實(shí)驗(yàn)所用斑馬魚(yú)均為同一批次產(chǎn)。將發(fā)育至5dpf野生AB型斑馬魚(yú)幼魚(yú)隨機(jī)分為順鉑處理組和對(duì)照組。順鉑處理組幼魚(yú)使用250 μM順鉑溶液避光處理3小時(shí)；對(duì)照組幼魚(yú)使用系統(tǒng)水避光處理相同時(shí)間。干預(yù)后，棄去順鉑溶液或系統(tǒng)水，并用系統(tǒng)水清洗3次，每次5分鐘。

1.3.2 斑馬魚(yú)側(cè)線毛細(xì)胞活體染色計(jì)數(shù)

取順鉑處理組（CDDP）和對(duì)照組（Control）斑馬魚(yú)各10條，分別按照上述建模方法干預(yù)、清洗后，加入2 μM Yo-Prp-1活體染液，避光染色1小時(shí)后，系統(tǒng)水清洗3次，每次5分鐘。隨后將斑馬魚(yú)置于0.02%MS-222（三卡因）溶液中進(jìn)行麻醉，再移至凹面載玻片上，加4%甲基纖維素于載玻片上并調(diào)整其體位為右側(cè)臥位。熒光顯微鏡下觀察毛細(xì)胞形態(tài)并拍照，取SO1、SO2、O1、OC1四個(gè)神經(jīng)丘進(jìn)行毛細(xì)胞計(jì)數(shù)，神經(jīng)丘命名方法參考該文獻(xiàn)[7]。

1.3.3 斑馬魚(yú)側(cè)線神經(jīng)丘凋亡染色

取順鉑處理組及對(duì)照組斑馬魚(yú)各10條。分別按照上述建模方法干預(yù)、清洗后，使用4%多聚甲醛溶液固定斑馬魚(yú)，再將斑馬魚(yú)移入TUNEL染液中37℃避光處理1小時(shí)，棄掉染液，用系統(tǒng)水清洗3次，每次5分鐘。移至凹面載玻片上，加4%甲基纖維素并調(diào)整至右側(cè)臥位，在熒光顯微鏡下觀察側(cè)線神經(jīng)丘凋亡信號(hào)點(diǎn)、拍照并計(jì)數(shù)P1-P6六個(gè)神經(jīng)丘的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)

取順鉑處理組及對(duì)照組，每組10條。經(jīng)過(guò)順鉑或系統(tǒng)水干預(yù)處理后，直接將幼魚(yú)置入RNA提取液中，使用1ml注射器抽吸獲得組織勻漿，根據(jù)TaKaRa公司的操作手冊(cè)進(jìn)行總RNA的提取。使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA的合成。按照下列組成配置PCR反應(yīng)液：總量10μl，SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)5μl,Reverse Primer(10 μM)0.5μl, Forward Primer(10 μM)0.5μl,cDNA 1μl,ddH2O 3μl。反應(yīng)條件：94℃維持300秒，然后按94℃30秒，57℃30秒,72℃30秒在熒光定量PCR儀上進(jìn)行32個(gè)循環(huán)。所用引物根據(jù)基因庫(kù)核苷酸序列，STAT3引物參考文獻(xiàn)[8]，用Primer5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)（具體引物序列見(jiàn)表1）。

1.3.5 原位雜交技術(shù)

取順鉑處理組及對(duì)照組斑馬魚(yú)，經(jīng)過(guò)順鉑或系統(tǒng)水干預(yù)處理后用多聚甲醛固定，然后使用梯度甲醇脫水、蛋白酶K消化，漂洗后加入預(yù)雜交液，再加入地高辛標(biāo)記的探針，60℃環(huán)境中過(guò)夜。移除探針，用緩沖液在60℃環(huán)境下洗滌6次，室溫下將斑馬魚(yú)置于封閉液中封閉1小時(shí)，加入抗體阻斷液4℃過(guò)夜。取出樣本，移除抗體后用PBST洗滌6次，染色并再次用PBST洗滌。4%多聚甲醛再固定后，將斑馬魚(yú)放入70%甘油中，4℃保存。觀察前經(jīng)過(guò)梯度脫水、梯度復(fù)水、甘油脫水，最后用100%甘油處理2小時(shí)，顯微鏡下觀察并拍照，觀察在斑馬魚(yú)幼魚(yú)側(cè)線上STAT3基因mRNA的表達(dá)情況。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

資料分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，方差齊性檢驗(yàn)采取Levene檢驗(yàn)。設(shè)P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 順鉑對(duì)斑馬魚(yú)側(cè)線毛細(xì)胞造成損傷

經(jīng)過(guò)順鉑或生理鹽水干預(yù)3小時(shí)并染色后，熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)斑馬魚(yú)側(cè)線SO1、SO2、O1、OC1四個(gè)神經(jīng)丘之毛細(xì)胞，以其平均值代表斑馬魚(yú)側(cè)線神經(jīng)丘的毛細(xì)胞數(shù)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：順鉑處理組斑馬魚(yú)側(cè)線神經(jīng)丘毛細(xì)胞數(shù)均數(shù)為5.03±0.59，對(duì)照組斑馬魚(yú)側(cè)線神經(jīng)丘毛細(xì)胞數(shù)均數(shù)為10.78±0.65，二者經(jīng)t檢驗(yàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1，t=20.636，P＜0.01）。這表明經(jīng)過(guò)250 μM順鉑溶液處理3小時(shí)后，斑馬魚(yú)側(cè)線神經(jīng)丘的毛細(xì)胞數(shù)較正常水平出現(xiàn)下降，即順鉑可造成斑馬魚(yú)側(cè)線神經(jīng)丘毛細(xì)胞的損傷。此外，筆者在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，斑馬魚(yú)側(cè)線神經(jīng)丘毛細(xì)胞數(shù)量隨干預(yù)的順鉑溶液濃度增加而減少，且順鉑作用時(shí)間越長(zhǎng)，側(cè)線毛細(xì)胞數(shù)量減少越明顯（數(shù)據(jù)未顯示），說(shuō)明順鉑對(duì)斑馬魚(yú)側(cè)線毛細(xì)胞的損傷具有濃度以及時(shí)間依賴性。

2.2 順鉑誘導(dǎo)斑馬魚(yú)側(cè)線毛細(xì)胞凋亡

用250 μM順鉑處理5dpf斑馬魚(yú)3小時(shí)后，檢測(cè)斑馬魚(yú)側(cè)線P1-P6六個(gè)神經(jīng)丘凋亡信號(hào)，以該6個(gè)神經(jīng)丘凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)平均值代表斑馬魚(yú)側(cè)線神經(jīng)丘的細(xì)胞凋亡水平，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。順鉑處理組平均凋亡細(xì)胞數(shù)為0.833±0.11，對(duì)照組平均凋亡細(xì)胞數(shù)為0.033±0.07，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=19.243，P＜0.01）。這說(shuō)明順鉑處理組斑馬魚(yú)側(cè)線神經(jīng)丘凋亡細(xì)胞較對(duì)照組增多，提示順鉑處理后斑馬魚(yú)側(cè)線神經(jīng)丘毛細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，順鉑的促凋亡作用是造成斑馬魚(yú)神經(jīng)丘毛細(xì)胞損傷的重要原因。2.3順鉑干預(yù)后STAT3 mRNA的表達(dá)增加

采用RT-qPCR的方法分析斑馬魚(yú)STAT3 mRNA在順鉑處理前后的表達(dá)變化情況，結(jié)果如圖3C所示。順鉑處理組斑馬魚(yú)的STAT3 mRNA的表達(dá)較對(duì)照組上升，二者差距有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=14.316，P＜0.01）。這說(shuō)明，順鉑的干預(yù)能促進(jìn)斑馬魚(yú)STAT3基因mRNA的表達(dá)。

2.4 原位雜交結(jié)果

經(jīng)過(guò)原位雜交后，STAT3 mRNA富集的細(xì)胞會(huì)被抗體標(biāo)記，鏡下表現(xiàn)為藍(lán)紫色（圖3A、B）。通過(guò)顯微照片可以看出，順鉑處理組斑馬魚(yú)的側(cè)線神經(jīng)丘上，STAT3基因表達(dá)比對(duì)照組明顯增多。

3 討論

斑馬魚(yú)作為近年新興的一種脊椎動(dòng)物模式生物，其易于飼養(yǎng)、生殖周期短、繁殖能力強(qiáng)、基因同源性高等諸多優(yōu)點(diǎn)使其成為越來(lái)越多的研究者青睞的研究對(duì)象。側(cè)線系統(tǒng)作為魚(yú)類(lèi)及兩棲類(lèi)動(dòng)物的遠(yuǎn)距觸覺(jué)器官，其功能是探測(cè)局部水流及壓力變化，調(diào)節(jié)諸如學(xué)習(xí)及逃避撲食之類(lèi)的行為。斑馬魚(yú)體表側(cè)線系統(tǒng)由大量單個(gè)神經(jīng)丘組成，每個(gè)神經(jīng)丘中央包含一簇由傳入及傳出神經(jīng)支配的毛細(xì)胞，而毛細(xì)胞周?chē)鸀橹С旨?xì)胞所包繞。側(cè)線神經(jīng)丘位于體表、易于觀察、可定量分析，是研究毛細(xì)胞損傷及再生的理想模型。與內(nèi)耳毛細(xì)胞不同，神經(jīng)丘內(nèi)毛細(xì)胞可簡(jiǎn)單地用活體染料染色觀察。此外，側(cè)線毛細(xì)胞與其它毛細(xì)胞一樣來(lái)自始基，并具相似的發(fā)育和分化方式，且在結(jié)構(gòu)、功能及分子基礎(chǔ)上與內(nèi)耳毛細(xì)胞極為相似。受精后5天斑馬魚(yú)側(cè)線系統(tǒng)與受精后4天之前相比已經(jīng)成熟，且與受精后7天在數(shù)量上沒(méi)有明顯差異；而受精后7天以后由于魚(yú)體發(fā)育過(guò)快、色素生長(zhǎng)等原因不利于給藥及觀察。因此既往研究多選用受精后5天斑馬魚(yú)作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，并且已經(jīng)證明可以利用受精后5天的斑馬魚(yú)建立不同的藥物毒性模型及進(jìn)行藥物篩選。本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了用順鉑浸泡的方法可以造成幼年斑馬魚(yú)側(cè)線神經(jīng)丘的毛細(xì)胞損傷，并且這種損傷具有時(shí)間和濃度依賴性。由此可快速建立順鉑毛細(xì)胞毒性模型，并且此種模型既省去了解剖的繁瑣過(guò)程，又可以對(duì)觀察對(duì)象進(jìn)行活體在體實(shí)時(shí)觀察，這是目前其他動(dòng)物模型所不具備的。

毛細(xì)胞的損傷主要有兩種形式：壞死和凋亡。在其他物種的實(shí)驗(yàn)中，與普遍認(rèn)為的氨基糖苷類(lèi)抗生素可引起兩種形式的死亡不同，順鉑主要是誘導(dǎo)毛細(xì)胞凋亡[9,10]。順鉑對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用主要依賴于其與細(xì)胞核DNA建立的烷基化樣鏈接[11]。隨后高遷移率族(high mobility group,HMG)蛋白與此鏈接結(jié)合，形成順鉑-DNA-HMGB1復(fù)合體，起到阻斷轉(zhuǎn)錄因子的作用，從而抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄及增值[9]。而對(duì)于順鉑損傷毛細(xì)胞，既往在各種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，包括大鼠、小鼠、幾內(nèi)亞豬及斑馬魚(yú)，均有證據(jù)提示順鉑通過(guò)細(xì)胞凋亡途徑誘導(dǎo)毛細(xì)胞損害[12-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，在順鉑組斑馬魚(yú)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞較對(duì)照組明顯增高，說(shuō)明順鉑能誘導(dǎo)其毛細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，順鉑干預(yù)后毛細(xì)胞的缺失與其發(fā)生的細(xì)胞凋亡有關(guān)，這與其他實(shí)驗(yàn)的結(jié)論是一致的[9,12,13,15]。

STAT3作為STATs中重要的一員，是JAK-STAT信號(hào)通路的重要環(huán)節(jié)。正常組織細(xì)胞中，STAT3主要參與細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過(guò)程。生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等多肽類(lèi)配體在細(xì)胞表面與相應(yīng)的受體結(jié)合，受體在胞漿內(nèi)與受體型酪氨酸蛋白激酶JAKs相結(jié)合，受體上的酪氨酸殘基磷酸化并使JAKs活化；活化的JAKs和受體募集細(xì)胞漿內(nèi)的STAT3，最終激活STAT3。正常情況下，STAT3的激活非常迅速，且持續(xù)時(shí)間短暫；若STAT3蛋白持續(xù)表達(dá)，則可以導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度增殖、分化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的發(fā)生，并且促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移和免疫逃避[16]。已有報(bào)道顯示，在鼻咽癌和喉癌組織中，癌癥組STAT3的表達(dá)量要明顯高于陰性對(duì)照組，并且與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)；而在甲狀腺腫瘤中，STAT3的表達(dá)卻與腫瘤的大小和轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)[17]。目前關(guān)于STAT3促進(jìn)細(xì)胞凋亡的研究認(rèn)為STAT3在大鼠腦缺血再灌注模型中表達(dá)上調(diào)，并且與細(xì)胞凋亡水平呈正相關(guān)[18,19]，亦有研究發(fā)現(xiàn)STAT3在大鼠重癥急性胰腺炎模型肺損傷過(guò)程中高表達(dá)，提示其與細(xì)胞急性壞死有關(guān)[20]。同時(shí)亦有研究發(fā)現(xiàn)，順鉑能降低大鼠的耳蝸組織STAT3蛋白表達(dá)[21]，提示STAT3并未在順鉑的毛細(xì)胞毒性中發(fā)揮積極的促凋亡作用。另有研究認(rèn)為STAT3的激活可以促進(jìn)抗凋亡蛋白如Bcl2及IAP家族蛋白的表達(dá)[22]，即發(fā)揮抗凋亡作用。本研究在原位雜交實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)順鉑處理后幼年斑馬魚(yú)側(cè)線神經(jīng)丘STAT3 mRNA表達(dá)升高，且RT-qPCR的結(jié)果顯示與原位雜交結(jié)果相符合，提示STAT3在順鉑對(duì)斑馬魚(yú)側(cè)線神經(jīng)丘毛細(xì)胞的損傷過(guò)程中可能與毛細(xì)胞凋亡相關(guān)并扮演一定角色。STAT3表達(dá)的升高與細(xì)胞凋亡的升高同時(shí)發(fā)生，提示STAT3在一定條件下可能存在促凋亡的作用。

4 展望

STAT3表達(dá)升高伴隨細(xì)胞凋亡升高并不一定就說(shuō)明其具備促細(xì)胞凋亡的作用。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，計(jì)劃采用STAT3的抑制劑或基因敲除的方法，抑制STAT3的表達(dá)，通過(guò)觀察抑制后STAT3的表達(dá)水平與毛細(xì)胞計(jì)數(shù)、毛細(xì)胞凋亡計(jì)數(shù)以及原位雜交的結(jié)果，進(jìn)一步研究STAT3在順鉑對(duì)幼年斑馬魚(yú)側(cè)線神經(jīng)丘毛細(xì)胞的損傷過(guò)程中所發(fā)揮的作用。

附錄：

表1 RT-qPCR所用引物序列Table 1 The primers for RT-qPCR

圖1 順鉑處理前后斑馬魚(yú)側(cè)線神經(jīng)丘毛細(xì)胞數(shù)量變化Fig.1 HC in the neuromasts of zebrafish decreased after cisplatin injectionsA Neuromasts of zebrafish in the control group(100X),B Neuro?masts of zebrafish in the CDDP group,A’OC1 of zebrafish in the control group(400X),B’OC1 of zebrafish in the control group,C Mean HC/neuromast,n=20,**P＜0.001

圖2 順鉑損傷后斑馬魚(yú)側(cè)線神經(jīng)丘凋亡信號(hào)檢測(cè)Fig.2 TUNEL-labeled cells in zebrafish lateral line neuromast after cisplatin injections

圖3 斑馬魚(yú)側(cè)線神經(jīng)丘STAT3基因的表達(dá)檢測(cè)Fig.3 STAT3 expression in the neuromasts of zebrafish lateral lineA In situ hybridization of zebrafish in the control group(100X), B In situ hybridization of zebrafish in the CDDP group,C STAT3 mRNAexpression,n=20,^STAT3+cell,**P＜0.001

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STAT3 Expression during Cisplatin-induced Hair Cell Injury in the Lateral Line in Zebrafish Larvae

WENG Yuhang1,CHEN Sa1,ZHOU Jinzhang2,LIU Huigang1,LONG Xiaobin1
1 Zhujiang Hospital of Southern Medical University,Guangzhou,510280
2 Shunde First People’s Hospital Affliated to Southern Medical University,Foshan,528300

ObjectiveTo develop a cisplatin-induced hair cell injury model using the lateral line system of zebrafish larvae and to detect the expression of STAT3 mRNA before and after cisplatin exposure.MethodsZebrafish larvae which were 5 days-post-fertilization were exposed to 250 μM cisplatin for 3 hours.Yo-pro-1-and Terminal dUTP Nick-End-Labeling(TUNEL-labeling)were used to examine hair cell densities and apoptosis,respectively.RT-qPCR and in situ hybridization were used to examine the expression level of STAT3.ResultsAfter being exposed to 250 μM cisplatin for 3 hours,hair cell densities of the neuromast in the lateral line of zebrafish larvae were significantly decreased(P＜0.001),and the number of apoptotic cells significantly increased(P＜0.001).Meanwhile,STAT3 expression was up-regulated(P＜0.001).Conclusion STAT3 may be involved in hair cell apoptosis during hair cell injury induced by cisplatin.While apoptosis is activated at the same time,it indicates that STAT3 may be able to induce apoptosis.

cisplatin;zebrafish;hair cell;injury;STAT3

R764

A

1672-2922（2016）06-808-5

2016-08-09審核人：郭維維）

10.3969/j.issn.1672-2922.2016.06.021

翁宇航，碩士，研究方向:耳科學(xué)基礎(chǔ)和臨床

龍孝斌，Email:longfengxb@126.com