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遺傳性耳聾基因?qū)υ肼暦磻?yīng)的研究

2016-02-15 08:48:04楊淑芝蔡群峰董有毅楊衛(wèi)平2胡博華
中華耳科學(xué)雜志 2016年6期
關(guān)鍵詞:爆震基底膜毛細(xì)胞

楊淑芝蔡群峰董有毅楊衛(wèi)平2,胡博華

1解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科(北京100048)

2解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,耳鼻咽喉研究所(北京100853)

3美國紐約州立布法羅大學(xué)聽力耳聾中心(美國14214)

·噪聲性聾專輯·

遺傳性耳聾基因?qū)υ肼暦磻?yīng)的研究

楊淑芝1,3蔡群峰3董有毅3楊衛(wèi)平2,3胡博華3

1解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科(北京100048)

2解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,耳鼻咽喉研究所(北京100853)

3美國紐約州立布法羅大學(xué)聽力耳聾中心(美國14214)

目的探討噪聲性聾小鼠動(dòng)物模型中遺傳性耳聾相關(guān)基因表達(dá)的變化,以了解這些基因是否參與耳蝸對噪聲的反應(yīng)。方法根據(jù)已知的人類耳聾基因挑選出92個(gè)同類小鼠基因,檢查這些基因?qū)υ肼晸p傷的反應(yīng)。8只小鼠(雌雄各半,4周齡)接受持續(xù)噪聲暴露(1-7kHz,120dB SPL)1小時(shí),造成耳蝸的急性聲損傷。ABR檢測聽力變化,熒光染色原位觀察耳蝸毛細(xì)胞損傷情況,qRT-PCR檢測耳聾基因表達(dá)變化。結(jié)果在92個(gè)檢測基因中,86個(gè)基因在耳蝸組織中表達(dá)。噪聲暴露后ABR檢測顯示所有檢測頻率的ABR閾值明顯提高(P<0.001)。免疫熒光染色原位觀察結(jié)果顯示噪聲暴露后耳蝸底轉(zhuǎn)外毛細(xì)胞缺失。qRT-PCR檢測顯示共有6個(gè)基因的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其中表達(dá)下調(diào)的基因有4個(gè),分別是Col4a5、P2rx2、Tmc1、Tprn,表達(dá)上調(diào)的基因有2個(gè),分別是Ndp和Smpx。這些基因參與多種細(xì)胞功能。結(jié)論噪聲性聾是一個(gè)復(fù)雜的退化過程,除環(huán)境因素外,多種耳聾基因參與其發(fā)病。

噪聲性聾,遺傳性聾,基因,小鼠,mRNA表達(dá)

This research was supported by NIDCD National Institute on.Deafness and Other Communication Disorders 1R01DC010154 to BH Hu

Declaration of interest:The authors report no conflicts of interest.

噪聲性聾是一種常見的職業(yè)性損害,其發(fā)病率在感音神經(jīng)性耳聾中位居第二[1]。目前對其發(fā)病機(jī)制尚無明確定論,多數(shù)學(xué)者認(rèn)為噪聲性聾是一種復(fù)雜的疾病,環(huán)境和遺傳因素共同參與其發(fā)病過程[2]。雖然人類定位的耳聾基因座位已超過200個(gè),其中129個(gè)基因被克隆,但截止到目前為止,僅有數(shù)個(gè)耳聾基因(KCNE1、KCNQ4、CAT、PCDH15、MYH14、GJB2、HSP70和Pjvk)被發(fā)現(xiàn)與噪聲易感性相關(guān)[3-7],還有許多易感基因有待進(jìn)一步被鑒定出來。本研究根據(jù)已知的人類遺傳性耳聾基因的功能及其在耳蝸中的表達(dá)情況,選取有關(guān)基因進(jìn)行研究,分析噪聲暴露后這些基因表達(dá)的變化情況,以了解組織損傷機(jī)理。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)選取C57BL/6J小鼠(8只,4周,雌雄各半,杰克遜實(shí)驗(yàn)室,美國)進(jìn)行研究,所有的實(shí)驗(yàn)對象均進(jìn)行基線聽力評估,只有那些聽力正常的小鼠才被選入本實(shí)驗(yàn)中,所有實(shí)驗(yàn)程序均符合美國紐約州立布法羅大學(xué)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)的倫理認(rèn)證。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均接受基線聽力學(xué)評估,隨機(jī)分配進(jìn)入實(shí)驗(yàn)組和對照組。實(shí)驗(yàn)組小鼠接受穩(wěn)態(tài)噪聲暴露(1-7kHz,120dB SPL)1小時(shí),造成耳蝸的急性聲損傷。噪聲暴露后1天進(jìn)行聽性腦干反應(yīng)測試,評估噪聲對耳蝸造成的損傷程度,然后處死動(dòng)物獲取耳蝸組織,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.1 噪聲暴露:噪聲信號由實(shí)時(shí)信號處理器產(chǎn)生(RP2.1,Tucker Davis Technologies,TDT,USA),該信號通過衰減器(PA5 TDT,USA)和放大器(Crown XLS 202,Harman International Company,USA)傳至揚(yáng)聲器(NSD2005-8,Eminence,USA),揚(yáng)聲器位于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物頭頂上方30cm處。應(yīng)用聲級計(jì)(LD-PCB,model 800B,APCB Piezotronics Division,Larson Davis,USA)、前置放大器(LD-PCB,model 825,Larson Davis,USA)和電容式微音器(Larson and Davis,LDL 2559,USA)校準(zhǔn)該區(qū)域的噪聲強(qiáng)度。

1.2.2 ABR檢測:動(dòng)物腹腔內(nèi)注射氯胺酮(87mg/kg)和賽拉嗪(3mg/kg)混合物麻醉成功后,將動(dòng)物置于加熱毯上維持體溫在37.5℃。記錄電極置于動(dòng)物顱頂皮下,參考電極和接地電極分別置于測試耳和對側(cè)耳后皮下。刺激聲為短純音,刺激重復(fù)率21次/秒。帶通濾波100~3000Hz。應(yīng)用誘發(fā)電位檢測系統(tǒng)(TDT,Tucker-Davis Technologies,USA)分別檢測4、8、16、32KHz頻率的反應(yīng)閾值。

1.2.3 標(biāo)本收集

1.2.3.1 用于轉(zhuǎn)錄分析耳蝸組織的收集:獲取小鼠耳蝸底轉(zhuǎn)柯蒂氏器(包括內(nèi)、外毛細(xì)胞和支持細(xì)胞),每個(gè)標(biāo)本包含1只小鼠的1只耳蝸組織。標(biāo)本取材的方法如下:動(dòng)物經(jīng)深度CO2麻醉2分鐘后處死,快速解剖出耳蝸,浸泡入冷卻的Dulbecco’s PBS液中(DPBS,GIBCO,Life Technologies,USA),迅速去除耳蝸底轉(zhuǎn)的骨壁,將其浸泡在RNA保護(hù)液(RNALater,Qiagen,USA)中,使用自行設(shè)計(jì)的顯微器械小心仔細(xì)地在Deiters細(xì)胞和Hensen細(xì)胞之間剔除網(wǎng)狀層,使之與基底膜分離,然后將分離的組織轉(zhuǎn)移到裝滿新鮮的RNA保護(hù)液的小瓶皿中,洗掉粘在標(biāo)本表面的碎片組織,將標(biāo)本移至RNase-free的PCR小管中,儲(chǔ)存在-80℃冰箱中待用。

1.2.3.2 用于耳蝸病理檢查標(biāo)本的收集:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死后,快速收集另外一側(cè)耳蝸,浸入冷卻的10mM PBS液中。用針尖刺破耳蝸的圓窗膜和卵圓窗膜,從圓窗輕輕注入10%福爾馬林液固定標(biāo)本4小時(shí)后,PBS液清洗。

1.3 熒光顯微鏡標(biāo)本制作

本研究采用原位觀察耳蝸的方法,了解噪聲暴露后耳蝸毛細(xì)胞損傷情況。顯微鏡下去除蝸尖和外側(cè)壁部分以充分暴露耳蝸底轉(zhuǎn)基底膜。用Alexa Fluor 488 phalloidin(1:75,Applied Biosystems,USA,10 mM PBS稀釋)、0.25%Triton X-100和1%小牛血清蛋白室溫下孵育30分鐘,PBS液漂洗后,置于培養(yǎng)皿中進(jìn)行熒光顯微鏡下觀察。

1.4 實(shí)時(shí)定量RT-PCR基因表達(dá)分析

1.4.1 總RNA提?。河肦Neasy Mini試劑盒(Qiagen,USA)按照步驟提取耳蝸基底膜組織總RNA??俁NA的質(zhì)量和數(shù)量用Nanodrop 1000分光光度計(jì)(Thermo Scientific,USA)進(jìn)行測定。

1.4.2 cDNA合成:以每個(gè)實(shí)驗(yàn)個(gè)體的總RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。采用High-Capacity cDNA Re?verse Transcription試劑盒(Life Technologies,USA),按照步驟合成單鏈cDNA,于PCR儀(Eppendorf Mas?terCycler gradient,Germany)42℃15 min,95℃2 min。

1.4.3 Custom TaqMan? Gene Expression Assays設(shè)計(jì):自行設(shè)計(jì)包含92個(gè)遺傳性耳聾基因和3個(gè)內(nèi)參基因的PCR array(Applied Biosystems,USA),應(yīng)用TaqMan?Gene Expression MasterMix,用 ABI 7900HT熒 光 定 量 PCR儀(Applied Biosystems 7900HT Real-Time PCR System,USA)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR分析。軟件SDS 2.4自動(dòng)輸出數(shù)據(jù)。

1.4.4 數(shù)據(jù)分析:采用Ct值描述耳聾目的基因在柯蒂氏器的表達(dá)情況。具體計(jì)算方法參見2-ΔΔCt方法,每個(gè)目的基因的Ct值與3個(gè)內(nèi)參基因(Rplp1、Hprt、Actb)的平均值進(jìn)行歸一化得出?Ct值,然后通過比較目的基因噪聲暴露前后的變化得出??Ct值[8],詳見下面的計(jì)算公式。

ΔCt噪聲組=實(shí)驗(yàn)組目的基因Ct值-實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因Ct值

ΔCt對照組=對照組目的基因Ct值-對照組內(nèi)參基因Ct值

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用GraphPad Prism 5.0(La Jolla,CA,USA)軟件ANOVA方差分析或Student’s t-test進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 噪聲暴露造成的聽力損害

暴露前和噪聲暴露后1天,分別進(jìn)行ABR檢測,了解噪聲暴露對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物聽力功能的影響,共檢測4只小鼠8只耳。結(jié)果顯示噪聲暴露后所有檢測頻率的ABR閾值均明顯提高,4個(gè)頻率的平均閾值由38.9±18.9 dB SPL提高至86.8±10.4 dB SPL,平均閾移為47.8 dB,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見表1和圖1所示。

表1 爆震前、后各頻率ABR閾值Table 1 TheABR thresholds at 4 frequencies pre-and after noise exposure

圖1 噪聲暴露前、后腦干誘發(fā)電位閾值檢測結(jié)果。噪聲爆震造成4個(gè)檢測頻率的閾值明顯提高Fig.1 Variations of the ABR thresholds after noise exposure at 4 detected frequencies.The thresholds of 4 frequencies improved significantly after noise exposure.

2 噪聲暴露造成耳蝸毛細(xì)胞損害

采用熒光顯微鏡觀察噪聲爆震后耳蝸底轉(zhuǎn)基底膜毛細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化,為減少解剖因素造成人為的組織損傷,采用本課題組建立的原位觀察方法進(jìn)行觀察。數(shù)碼相機(jī)連續(xù)記錄多層面圖片(SPOT RT,Color Diagnostic Instruments Incorporation,USA),應(yīng)用Adobe Photoshop CS6軟件自動(dòng)合成視圖。肉眼觀察圖片中表皮板染色,外毛細(xì)胞區(qū)染色缺失被記為缺失。如圖2中所顯示,與正常對照相比較,噪聲暴露后耳蝸底轉(zhuǎn)外毛細(xì)胞缺失明顯增多。

圖2 耳蝸底轉(zhuǎn)基底膜毛細(xì)胞檢查結(jié)果(400X)。綠色熒光為Alexa Fluor 488 phalloidin染色,顯示毛細(xì)胞表皮扳。A示正常對照耳蝸,B示噪聲暴露耳蝸,噪聲暴露導(dǎo)致三排外毛細(xì)胞明顯缺失。Fig.2 Fluorescence microscopic views of hair cells in the basal turn of the cochlea(400X).Green fluorescence is hair cells’surface plate stained withAlexa Fluor 488 phalloidin.A)Control cochlea.B)Cochlea after noise exposed,shows that the three rows of outer hair cells are obviously missing after noise exposure.

3 遺傳性耳聾基因qRT-PCR Array設(shè)計(jì)

搜索遺傳性耳聾基因網(wǎng)站(Hereditary hearing loss homepage),共檢索到已克隆的129個(gè)耳聾基因,根據(jù)耳聾基因在耳蝸中表達(dá)的部位及基因的功能,選取92個(gè)耳聾基因進(jìn)行研究,見表2。

4 噪聲暴露后耳聾基因表達(dá)的變化

本實(shí)驗(yàn)qRT-PCR結(jié)果顯示噪聲暴露前、后共有6個(gè)基因均未檢測到表達(dá)(3個(gè)標(biāo)本中至少2個(gè)以上表達(dá)才被判斷為有表達(dá)),分別是Gjb3、Dspp、Ucn、Diap3、Myo1a和Ush2a基因。2個(gè)基因,Tecta和Col11a2噪聲暴露后表達(dá)消失,但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

在92個(gè)被檢測的基因中有84個(gè)在噪聲暴露前、后均表達(dá),根據(jù)P<0.05的標(biāo)準(zhǔn),共有6個(gè)基因的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其中噪聲暴露后基因表達(dá)下調(diào)的基因有4個(gè),分別是Col4a5、P2rx2、Tmc1、Tprn,表達(dá)上調(diào)的基因有2個(gè),分別是Ndp和Smpx;表達(dá)變化的基因中,差異倍數(shù)>1.5的基因均為表達(dá)上調(diào)的2個(gè)基因,分別是Ndp和Smpx(見表3)。

5 與RNA-Sequencing(RNA-seq)結(jié)果比較分析

與本課題組已經(jīng)完成的RNA-Seq數(shù)據(jù)進(jìn)行比對分析發(fā)現(xiàn),納入研究的耳聾基因在噪聲暴露前共有12個(gè)基因運(yùn)用RNA-Seq技術(shù)在耳蝸柯蒂氏器中未檢測到表達(dá),包括Gjb3、Dspp、Ush2a、Tecta、Tnc、Coch、Col4a6、Kcnq4、Myo1a、Myo3a、Sema3e和Ucn;接受噪聲暴露后Coch基因表達(dá)升高、Sema3e基因出現(xiàn)少量表達(dá)外,其它基因亦無明確表達(dá)。噪聲暴露前Cdh23和Myo15基因出現(xiàn)少量表達(dá),噪聲暴露后表達(dá)完全消失。兩組實(shí)驗(yàn)方法揭示耳蝸柯蒂氏器中Gjb3、Dspp、Ucn、Myo1a和Ush2a基因噪聲暴露前后均不表達(dá)(見圖3)。

圖3 qRT-PCR Array與RNA-Sequence比對分析發(fā)現(xiàn),噪聲暴露前、后兩種檢測方法共有5個(gè)基因均不表達(dá),紅色顏色標(biāo)識(shí)。Fig.3 Comparison the results between qRT-PCR Array and RNA-Sequence.5 common genes are not detected by both qRT-PCR Array and RNA-Sequence methods pre-and after noise exposure(Marked in red)

6 討論

本研究采用候選基因策略,選取部分人類遺傳性耳聾基因,研究其在噪聲爆震誘發(fā)的小鼠耳蝸損傷動(dòng)物模型上的表達(dá)變化情況,以期發(fā)現(xiàn)噪聲相關(guān)的耳聾易感基因。截止到目前為止,人類定位的耳聾基因座位已超過200個(gè),其中129個(gè)基因被克隆,預(yù)測與耳聾相關(guān)的基因大約有500~600個(gè)。這些基因中,僅KCNE1、KCNQ4、CAT、PCDH15、MYH14、HSP70和Pjvk基因與噪聲性聾的易感性相關(guān)得到學(xué)者的共識(shí),還有許多噪聲性耳聾易感基因有待進(jìn)一步被鑒定出來。

不論是冷害還是凍害,葡萄的受害程度除了和當(dāng)時(shí)的溫度下降幅度有關(guān)以外,還和葡萄自身的健康水平、所處的生長狀態(tài)及其生長位置有關(guān)。越是衰弱的植株,受凍后受到的傷害越大;越是處于生長順暢階段的植株或器官,受傷越嚴(yán)重;處于坡底部的植株會(huì)比處于坡頂端的植株受傷更重,處于坡中部的植株往往受傷最輕。

既往研究表明噪聲引起以外毛細(xì)胞改變?yōu)橹鞯募?xì)胞變化,表現(xiàn)為細(xì)胞體變形、腫脹、細(xì)胞質(zhì)均質(zhì)化,細(xì)胞核位移、核固縮、核碎裂、核溶解、細(xì)胞消失、數(shù)量減少,內(nèi)毛細(xì)胞損傷很輕甚至無損傷[9,10]。故本實(shí)驗(yàn)在進(jìn)行qRT-PCR array設(shè)計(jì)時(shí),首選那些在內(nèi)外毛細(xì)胞中表達(dá)的基因作為研究對象,同時(shí)結(jié)合基因的功能進(jìn)行設(shè)計(jì)。表達(dá)于內(nèi)、外毛細(xì)胞的耳聾基因共有25個(gè),分別是Myo7a、Myo15a、Tmc1、Otof、Cdh23、Gipc3、Strc、Pcdh15、Rdx、Triobp、Cldn14、Myo3a、Whrn、Espn、Myo6、Ildr1、Loxhd1、Kcnq4、Myh14、Wfs1、Pou4f3、Myh9、Actg1、Ccdc50、Tjp2基因。Slc26a5基因僅表達(dá)于內(nèi)毛細(xì)胞,Serpinb6基因僅表達(dá)于外毛細(xì)胞。

爆震后耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞也同樣受到損傷,表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)減少,減少的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞主要發(fā)生在耳蝸毛細(xì)胞大量缺失最明顯的部位,表達(dá)于螺旋神經(jīng)節(jié)的Slc26a4、Tmprss3、Pcdh15、Kcnq4、Wfs1、Myh9基因亦納入研究。強(qiáng)噪聲暴露后還可以引起支持細(xì)胞(Deiters細(xì)胞和內(nèi)、外柱細(xì)胞)的缺失,Gjb2、Gjb6、Tmprss3、Cldn14、Myh14、Tjp2、Tmpr基因均表達(dá)于支持細(xì)胞。

本研究通過噪聲爆震造成小鼠耳蝸急性聲創(chuàng)傷,引起ABR閾值明顯提高,4個(gè)頻率的平均閾值由38.9 ±18.9 dB SPL提高至86.8±10.4 dB SPL,平均產(chǎn)生47.8 dB閾移。形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)耳蝸底轉(zhuǎn)基底膜毛細(xì)胞缺失明顯,為聲創(chuàng)傷后聽力下降提供病理學(xué)依據(jù)。為探討分子病因?qū)W機(jī)制,收集耳蝸底轉(zhuǎn)基底膜進(jìn)行候選遺傳性耳聾基因qRT-PCR array分析,揭示共有6個(gè)基因的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其中噪聲暴露后基因表達(dá)下調(diào)的基因有4個(gè),分別是Col4a5、P2rx2、Tmc1、Tprn;表達(dá)上調(diào)的基因有2個(gè),分別是Ndp和Smpx;表達(dá)變化的基因中,差異倍數(shù)>1.5的基因均為表達(dá)上調(diào)的2個(gè)基因,分別是Ndp和Smpx。

表2 96孔板qRT-PCR Array遺傳性耳聾基因分布圖Table 2 Arrangement of the hereditary hearing loss genes studied in customized qRT-PCRArray in 96 wells

Col4a5基因(collagen type IV alpha 5 chain),又稱Ⅳ型膠原α5鏈,編碼6種IV型膠原其中的一種,是基底膜重要的組成成分。該基因突變與X連鎖的Alport綜合征有關(guān)(Alport syndrome)。該綜合征是一種主要表現(xiàn)為血尿、腎功能進(jìn)行性減退,常伴有感音神經(jīng)性耳聾和眼部異常的遺傳性綜合征型耳聾。該基因需要與Col4a6基因頭對頭相接,以便共享一個(gè)啟動(dòng)子。在耳蝸組織,α5(Ⅳ)鏈表達(dá)在整個(gè)柯蒂氏器基底膜和螺旋韌帶[11]。基因突變后,相應(yīng)的編碼產(chǎn)物表達(dá)異常或缺失,從而不能構(gòu)建正常的Ⅳ型膠原網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),導(dǎo)致基底膜損傷,出現(xiàn)聽力下降的癥狀。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)噪聲爆震后小鼠耳蝸基底膜中Col4a5的表達(dá)下降,可能影響基底膜的完整性,從而影響基底膜與螺旋韌帶的連接,導(dǎo)致機(jī)械能的傳導(dǎo)受累。

Tmc1基因(transmembrane channel-like 1)編碼一種跨膜蛋白,是維持耳蝸毛細(xì)胞正常功能所必須的蛋白。該基因突變即可引起常染色顯性遺傳性聾(DFNA36),也可引起常染色體隱性遺傳性聾(DF?NB7和DFNB11)。Tmc1和Tmc2定位于更短一些的靜纖毛的頂端,是機(jī)-電換能轉(zhuǎn)導(dǎo)的位置[12]。近期研究表明Tmc1與機(jī)-電換能器(mechanoelectrical trans?ducer,MET)Ca2+通道有關(guān),人DFNA36耳聾小鼠動(dòng)物模型Beethoven攜帶Tmc1基因突變p.Met412Lys,該突變影響MET離子通道孔,降低Ca2+離子的通透性和其與滲透阻斷劑-雙氫鏈霉素的結(jié)合力,從而補(bǔ)償因Ca2+離子內(nèi)流減少而造成的影響[13]。本研究發(fā)現(xiàn)噪聲爆震后Tmc1表達(dá)下降,可能使細(xì)胞內(nèi)Ca2+離子濃度明顯降低,從而影響機(jī)-電換能效率。

P2rx2基因(purinergic receptor P2X,ligand-gat? ed ion channel,2,嘌呤受體P2X,配體門控離子通道2)編碼的P2X2受體廣泛分布在耳蝸柯蒂氏器的毛細(xì)胞、前庭膜上皮細(xì)胞以及螺旋神經(jīng)節(jié)[14],維持耳蝸內(nèi)淋巴電位(EP,~+100 mV)以及毛細(xì)胞跨膜電位(這種電位差為聲音轉(zhuǎn)導(dǎo)的驅(qū)動(dòng)力)。EP和毛細(xì)胞跨膜電位因P2X2樣ATP-門控非選擇性陽離子通道被激活而復(fù)位[15]。近期通過對P2RX2-null的小鼠模型噪聲暴露后不呈現(xiàn)短暫閾移現(xiàn)象的研究,揭示隨著噪聲強(qiáng)度增加,釋放入耳蝸分隔內(nèi)ATP的增加,從而激活P2X2受體,降低聲音的轉(zhuǎn)導(dǎo)和毛細(xì)胞間的突觸傳遞[16]。在一個(gè)中國6代DFNA41耳聾大家系檢測到P2RX2基因c.178G>T(p.V60L)雜合突變,患者表現(xiàn)漸進(jìn)性聽力下降。家系內(nèi)部接受噪聲暴露的年輕人的聽力下降幅度明顯大于那些未接受過噪聲暴露的患者,推測可能攜帶P2RX2基因p.V60L突變的患者對噪聲更加敏感[17]。P2RX2基因可列為噪聲易感基因的候選基因。本研究亦揭示噪聲暴露后P2RX2基因表達(dá)下調(diào)。

Ndp和Smpx基因是本研究發(fā)現(xiàn)的噪聲爆震后表達(dá)上調(diào)的基因,并且差異倍數(shù)>1.5。Ndp基因突變可導(dǎo)致Norrie病,該病是一種X連鎖的遺傳性疾病,表現(xiàn)出生時(shí)視網(wǎng)膜的纖維增殖和血管改變,導(dǎo)致嬰幼兒各種不同程度的視力損害,大多數(shù)男性患者合并感音神經(jīng)性耳聾。該基因編碼的蛋白Norrin是多種受體的配體,參與Wnt和Wnt依賴的信號系統(tǒng),它在眼睛和內(nèi)耳血管發(fā)育的過程中發(fā)揮重要作用。在發(fā)育和成熟的耳蝸,Ndp在血管紋與螺旋神經(jīng)節(jié)之間的毛細(xì)血管叢表達(dá),推測Norrin在視網(wǎng)膜和耳蝸以外有發(fā)育和/或自身穩(wěn)定功能[19]。在基因敲除的小鼠模型中,發(fā)現(xiàn)其視網(wǎng)膜血管生成障礙和深層毛細(xì)血管完全缺失,以及進(jìn)行性的耳蝸血管喪失而致眼盲和耳聾[20]。本研究爆震后耳蝸組織中Ndp表達(dá)升高可能是組織修復(fù)的反應(yīng)。

表3 噪聲暴露后耳聾基因表達(dá)變化情況Table 3 Variations of gene expression after noise exposure

Smpx基因(small muscle protein,X-linked)編碼X連鎖小肌肉蛋白,其在心臟肌和骨骼肌等橫紋肌中高表達(dá),哺乳動(dòng)物中SMPX高度保守,在骨骼肌受到被動(dòng)伸展時(shí)SMPX表達(dá)上調(diào)[21]。顯然Smpx基因并不是非綜合征型耳聾的首先候選基因。但近期采用下一代測序技術(shù)在2個(gè)不相關(guān)的X連鎖非綜合征耳聾家系中檢測到Smpx基因突變(p.Glu72X和P. Glu44ArgfsX37),兩個(gè)突變均是明確的致病突變,采用RT-PCR技術(shù)在人類胚胎8周的內(nèi)耳標(biāo)本可明確擴(kuò)增出SMPX mRNA序列并通過測序證實(shí)。通過RNA原位雜交技術(shù)在小鼠胚胎14.5天亦在內(nèi)耳中亦發(fā)現(xiàn)有高表達(dá)。以上研究首次證實(shí)Smpx基因參與耳聾的發(fā)病[22,23]。目前SMPX蛋白的功能尚不明確,研究表明肌細(xì)胞膜骨架蛋白將肌細(xì)胞內(nèi)的肌原纖維和細(xì)胞外的基質(zhì)通過costameres區(qū)域連接起來,SMPX蛋白定位于這個(gè)區(qū)域,能夠增加integrins的粘附功能,提示SMPX蛋白在機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮間接作用[24]。

本實(shí)驗(yàn)通過在爆震小鼠模型進(jìn)行常見耳聾基因的表達(dá)分析,發(fā)現(xiàn)噪聲引起6個(gè)基因的表達(dá)發(fā)生變化,其中4個(gè)基因表達(dá)下調(diào)(Col4a5、P2rx2、Tmc1、Tprn);2個(gè)基因表達(dá)上調(diào)(Ndp和Smpx)。這些基因在噪聲性耳聾的發(fā)病機(jī)制中可能發(fā)揮作用,對這些基因的進(jìn)一步研究將有助于更好的了解噪聲性耳聾的分子致病機(jī)制。

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The responses of hereditary hearing loss genes to acoustic injury

YANG Shuzhi1,3,CAI Qunfeng3,DONG Youyi3,YANG Weiping2,3,HU Bohua3
1 Department of Otolaryngology,The First Affiliated Hospital to the Chinese PLA general Hospital,Beijing,100048,China
2 Department of Otolaryngology and Head&Neck Surgery,Institute of Otolaryngology,Chinese PLA General Hospital, Beijing,100853 China
3 Center for Hearing and Deafness,State University of New York at Buffalo,Buffalo,NY 14214,USA

ObjectiveTo determine the response of hereditary hearing loss genes to acoustic injury in mice.Methods Eight C57BL/6J mice(4 males and 4 females,4 weeks old)were randomly divided into a control and a noise group.The noise group subjects were exposed to a broadband noise at 120 dB SPL for 1 hour.ABR thresholds were measured and missing outer hair cells were quantified to determine the level of cochlear damage 1 day after noise exposure.qRT-PCR arrays were used to determine the expression levels of 92 genes that have been identified in human as hereditary hearing loss genes. Results ABR measurements showed a significant increase in threshold after the noise exposure(P<0.001)and pathological assessment revealed outer hair cell lesions in the basal turn of the cochlea.Gene expression analysis identified 6 genes that displayed significant expression changes.Among these genes,four(Col4a5,P2rx2,Tmc1,and Tprn)were down-regulated, and two(Ndp and Smpx)were up-regulated.These genes participate in various cellular functions.Conclusion Noise-induced cochlear damage is a complex degenerative process and multiple deafness genes are involved in its etiology.

Acoustic injury,Hereditary hearing loss,Gene,Mouse,mRNAexpression.

R764

A

1672-2922(2016)06-719-6

2016-09-03)

10.3969/j.issn.1672-2922.2016.06.005

美國國立衛(wèi)生院耳聾和其他交流障礙國立研究所RO1項(xiàng)目(RO1DC010154 to BH Hu)

楊淑芝,博士,副教授,研究方向:耳聾的遺傳學(xué)研究。

胡博華,Email:bhh@buffalo.edu

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