何薇 吳菁 盧建 尹愛華

(廣東省婦幼保健院 醫(yī)學遺傳中心，廣東 廣州 510010)

探討染色體微陣列分析在無明顯表型異常成年人中的臨床應(yīng)用

何薇 吳菁 盧建 尹愛華*

(廣東省婦幼保健院 醫(yī)學遺傳中心，廣東 廣州 510010)

目的 探討染色體微陣列分析(CMA)技術(shù)在無明顯表型異常成年人中的臨床應(yīng)用。方法 選取2014年1月至2016年5月在廣東省婦幼保健院醫(yī)學遺傳中心進行的，無明顯表型異常成人外周血CMA病例，共計136例進行回顧性分析,所有病例均進行了染色體G顯帶核型分析及CMA檢測。結(jié)果 33例因產(chǎn)前診斷胎兒CMA陽性進行外周血CMA檢測，外周血CMA檢測結(jié)果陽性有10例，占總病例的30.3%，占家庭數(shù)的52.6%；76例因不良生育史進行外周血CMA檢測，外周血CMA檢測結(jié)果陽性有9例，占總病例的11.8%，占家庭數(shù)的16%；25例因夫婦一方染色體異常進行外周血CMA檢測，外周血CMA檢測結(jié)果陽性有3例，占總病例的12%；2例因特殊家族史進行外周血CMA檢測的，外周血CMA均未見明顯異常。結(jié)論 對于無明顯表型異常的成年群體可以有針對性地選擇CMA檢測，可以明確其遺傳學病因，從而提供更全面詳細的細胞遺傳學信息及遺傳咨詢。

無表型異常成年人；染色體微陣列分析技術(shù)；染色體核型分析

染色體微陣列技術(shù)(chromosomal microarray analysis, CMA)代表所有以微陣列為技術(shù)基礎(chǔ)的基因組拷貝數(shù)分析技術(shù)，包括基于比較基因組雜交的微陣列( array-based comparative genomic hybridization，aCGH)和基于單核苷酸多態(tài)性的微陣列( single nucleotide polymorphism arrays，SNP arrays)。染色體微陣列技術(shù)有高分辨率、高敏感性、高通量、快速準確、易于自動化、樣品用量少等優(yōu)點，基于以上這些優(yōu)點，該項技術(shù)現(xiàn)已廣泛地應(yīng)用于生物醫(yī)學的各個領(lǐng)域，特別是對產(chǎn)前遺傳性疾病的診斷[1-5]。

對于超聲異常胎兒孕期產(chǎn)前診斷首選CMA，美國婦產(chǎn)科醫(yī)師協(xié)會(ACOG)和母胎醫(yī)學協(xié)會(SMFM)提供的指南中指出，對于只要了解介入性產(chǎn)前診斷風險、CMA檢測意義及局限性者，產(chǎn)前超聲沒有任何異常也可進行胎兒CMA檢查[6]。無明顯表型異常的成人，并不代表CMA檢測結(jié)果無異常，即便是檢測出特定疾病，其在不同患者間臨床表現(xiàn)可能存很大變異以及對后代的影響不盡相同，原因可能與累及基因的表現(xiàn)度和外顯率不同有關(guān)，因此CMA檢測在該類群體中有一定的意義。目前暫無指南對無明顯表型異常的成人群體提供明確指導性的檢測建議，本文章旨在通過回顧性分析本中心在2014年1月至2016年5月無明顯表型異常成人外周血CMA病例，探討CMA在無明顯表型異常成年人群中的臨床應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象 分析2014年1月至2016年5月在廣東省婦幼保健院醫(yī)學遺傳中心進行外周血CMA檢測，且年齡≥18歲以上的病例，年齡在18～57歲，平均(29.57±5.96)歲，共計136例，包括33例產(chǎn)前診斷胎兒CMA陽性，76例不良生育史，25例因夫婦一方染色體異常及2例特殊家族史進行外周血CMA檢測。

1.2 實驗方法

1.2.1 標本采集 抽取靜脈血5ml，所有標本均進行染色體核型分析及CMA檢測。

1.2.2 染色體核型分析 對外周血標本進行常規(guī)制片、G顯帶分析，顯微鏡下檢查20個核型，分析3個核型，若出現(xiàn)嵌合體則檢查50個或100個核型。

1.2.3 CMA檢測 本中心在2016年4月之前，采用Agilent公司生產(chǎn)的8×60k芯片進行全基因組掃描檢測，自2016年4月開始，采用美國Affymetric公司提供的高分辨率全基因組Cytoscan 750K芯片對全基因組已知基因區(qū)域的拷貝數(shù)進行分析，Affymetric平臺不僅能檢測基因組缺失、重復，還能檢測雜合性缺失和單親二體。實驗操作嚴格按照各個公司提供的操作流程。

1.3 數(shù)據(jù)分析 分析過程分別參照本中心內(nèi)部數(shù)據(jù)庫以及在線公開數(shù)據(jù)庫，如DGV數(shù)據(jù)庫、DECIPHER數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫等。

2 結(jié)果

2.1 排除11例表型異常病例，對136例無明顯表型異常者外周血CMA檢測的病例匯總分析，具體見表1。

表1 136例無明顯表型異常成人外周血CMA檢測結(jié)果

注：*夫婦對數(shù)，若夫婦雙方都進行CMA檢測，算一對夫婦，例數(shù)算2例；§百分率，括號中有兩個數(shù)值，第一個數(shù)值的是陽性病例數(shù)的百分率，第二個數(shù)值是陽性家庭數(shù)(一對夫婦算一個家庭)的百分率

2.2 2 2例外周血CMA檢測陽性病例結(jié)果匯總分析，具體見表2。

3 討論

3.1 CMA檢測結(jié)果分析 33例因產(chǎn)前診斷胎兒CMA陽性進行外周血CMA檢測，其中包括14對夫婦，外周血CMA檢測結(jié)果有10例陽性，占總病例的30.3%，占家庭數(shù)(雙親同時做則算一個家庭)的52.6%，遺傳自雙親的10例，除case1(在孕20+周，超聲提示胎兒骨骼發(fā)育異常：胸廓狹窄、四肢長骨短小、雙足內(nèi)翻、頸段及骶尾段椎體異常)、case2、case5和case7選擇終止妊娠，其余6例均選擇繼續(xù)妊娠。4例NT增厚病例，NT厚度分別為3.6mm、2.7mm、2.6mm和3.0mm，根據(jù)本中心總結(jié)NT數(shù)值與產(chǎn)前診斷陽性例數(shù)相關(guān)性及國內(nèi)外數(shù)據(jù)[7,8]，現(xiàn)已將NT≥3.0mm定義為NT增厚，尤其對于NT≥3.5mm者，更應(yīng)建議選擇介入性產(chǎn)前診斷，排除胎兒染色體異常。有4例22q11微重復綜合征，均在雙親中找到了遺傳來源，雙親攜帶者均無明顯異常。

表2 22例外周血CMA陽性病例

注：*外周血染色體G顯帶結(jié)果；§外周血CMA結(jié)果

76例因不良生育史進行外周血CMA檢測，其中包括22對夫婦，外周血CMA檢測結(jié)果有9例陽性，占總病例的11.8%，占家庭數(shù)的16%。該組病例有些是因為既往孕期發(fā)現(xiàn)胎兒超聲異常，進行了胎兒CMA檢測，但夫婦雙方拒絕CMA檢測，對于不明原因的CNV無法判斷來源及胎兒預后，選擇終止妊娠為結(jié)局，當再次備孕或妊娠時，在孕前或孕期選擇性的進行夫婦雙方或一方外周血CMA檢測。9例陽性病例均同既往引產(chǎn)胎兒染色體微缺失或微重復一致。建議在產(chǎn)前發(fā)現(xiàn)CNV時，胎兒雙親應(yīng)及時進行CMA檢測，雖然目前發(fā)現(xiàn)一些CNV在父母身上表型是正常的，下一代身上表型是異常的[9]，但進行胎兒雙親CMA檢測，仍然可對胎兒預后的評估起到不可替代的意義。Case9，患者本人既往史無特殊，無明顯表型異常，G3P0，自然流產(chǎn)3次，其中2次流產(chǎn)物FISH均提示8號三體，外周血染色體G顯帶核型分析提示：46,XX,9qh+,16qh+,外周血CMA檢測結(jié)果提示：X染色體X22.31位置發(fā)生重復，片段大小約1.5Mb。該重復區(qū)域包含HDHD1A、STS、VCX、PNPLA4基因，其中STS基因的純合性缺失可導致X連鎖魚鱗病，但該區(qū)域的重復是否致病尚存在爭議，有學者認為與發(fā)育遲緩、癲癇等有關(guān)，亦有學者認為可能是良性變異，因此該CNV的臨床意義不明，建議下次孕期行產(chǎn)前診斷。

25例因夫婦一方染色體異常進行外周血CMA檢測，外周血CMA檢測結(jié)果有3例陽性，占總病例的12%。值得說明的，染色體G顯帶對CMA檢測是有效補充，特別在染色體提示數(shù)目異常，結(jié)構(gòu)異常等情況下。因此，在條件允許情況下，盡量選擇染色體G顯帶及CMA同時檢測。該25例夫婦一方染色體異常，均不屬于染色體數(shù)目異常，其中2例是嵌合體，23例是無法確認異常片段的來源和性質(zhì)。Case1外周血CMA結(jié)果發(fā)現(xiàn)15號染色體15q11.1-q11.2發(fā)生重復，增加了2個拷貝，提示marker染色體可能來源于15號染色體，目前尚無證據(jù)表明該區(qū)域重復可以致病。

2例因特殊家族史進行外周血CMA檢測的，均是家族中有2名或2名以上先天性智障者，其外周血CMA未見明顯異常。

在2014年1月至2016年5月期間，有11例成年表觀異常者選擇外周血CMA檢測，共有2例陽性，占總病例數(shù)的18.1%。與其他幾組數(shù)據(jù)比較，除“因產(chǎn)前診斷胎兒CMA陽性”組(30.3%，52.6%)，成年表觀異常組的CMA陽性率均較其他幾組高。在歐美國等發(fā)達國家CMA檢測已被廣泛應(yīng)用于智力障礙、兒童早期發(fā)育遲緩、新生兒出生缺陷、孤獨癥譜系障礙等[10,11]，CMA檢測應(yīng)用于表型異常者，即應(yīng)用于先證者時陽性檢出率明顯增加。在遺傳咨詢時，若家族中存在先證者，應(yīng)建議先證者先進行檢測，根據(jù)檢測結(jié)果，咨詢者再相應(yīng)的選擇檢查項目。

3.2 CMA檢測的局限性 CMA是一種基于基因芯片技術(shù)的染色體病診斷方法，可以檢測染色體核型分析不能診斷的小片段缺失或重復(限于所選平臺檢測范圍內(nèi)的)，但是無法檢出染色體平衡易位(相互易位、羅伯遜易位)、倒位等不存在片段缺失或重復的染色體結(jié)構(gòu)異常、也不適合檢測染色體多倍體(如三倍體、四倍體)、異常比率較低(≤20%)的嵌合體以及其他拷貝數(shù)沒有變化的染色體畸變、基因重組和點突變則無法檢測。單獨選擇CMA，不進行外周血染體G顯帶檢測時會遺漏部分染色體結(jié)果異常的病例。

CMA能夠在全基因組水平進行掃描，可檢測染色體不平衡的拷貝數(shù)變異 (copy number variant, CNV)尤其是對于檢測染色體組微小缺失、重復等不平衡性具有突出優(yōu)勢。因 CMA 得到的檢測結(jié)果信息量大，健康個體普遍存在拷貝數(shù)多態(tài)性，需要結(jié)合 CNV 片段的大小、位置和基因含量，并查閱相關(guān)數(shù)據(jù)庫來判斷 CNV 的性質(zhì)。按照指引的分類[12,13]，CNV可分為致病CNV、可能致病CNV、臨床意義不明CNV(variants of unknown significance，VOUS)、可能良性CNV和良性CNV，焦點在“VOUS”，值得探討的在“可能致病的CNV、可能良性的CNV”。VOUS其中部分情況是罕見的新生突變，部分與突變基因的外顯率有關(guān)，即胎兒有罹患某種遺傳病的易感性，但并不一定發(fā)病。一些CMA陽性結(jié)果的發(fā)現(xiàn)不能確定其是否有臨床價值，需要對先證者雙親進行相應(yīng)的檢測來協(xié)助判斷，如因“產(chǎn)前診斷胎兒CMA陽性”組，有10例CMA陽性，在先證者雙親中的一方外周血CMA檢查結(jié)果中發(fā)現(xiàn)與胎兒類似CNV，說明該CNV為家族性變異。很多良性或者致病 CNV 雖已被證實，但由于表達的不穩(wěn)定性和個體差異不完全的外顯率，很多檢測結(jié)果仍然不能被準確的解釋。

3.3 CMA檢測的遺傳咨詢 隨著科技的發(fā)展，越來越多的分子遺傳學檢測項目應(yīng)用于臨床，如一代測序、二代測序等，所有遺傳檢測項目都應(yīng)經(jīng)過有豐富臨床經(jīng)驗的醫(yī)學遺傳醫(yī)師進行評估和咨詢，針對咨詢者的實際情況建議合適的檢查。CMA檢測亦是如此，在檢查前，應(yīng)充分告知檢測者該項檢查的范圍、意義和局限性，在解釋結(jié)果時，因很多基因變異的臨床意義尚未明確，檢測結(jié)果的相關(guān)結(jié)論是基于目前科學研究和數(shù)據(jù)庫資料的基礎(chǔ)上而得到，必要時需雙親，甚至家族成員進行相關(guān)檢測，應(yīng)充分解釋。

3.4 容易忽略的咨詢 CMA并不能檢出所有的CNV，CMA探針的設(shè)計是關(guān)鍵基因區(qū)探針覆蓋，例如，1、9、16號及Y染色體次縊痕區(qū)域和D組、E組染色體短臂等區(qū)域，這些區(qū)域并未設(shè)置檢測探針，因此CMA檢測結(jié)果未見異常，實際表明沒有檢測出關(guān)鍵基因在200kb以上的缺失或重復；對于低于檢測分辨率的CNV也無法檢出；CMA無法檢測單基因遺傳病的點突變異常、基因表達異常和甲基化異常；此外，CMA檢測結(jié)果會帶有預測性質(zhì)的告知今后可能發(fā)生的疾病即成人期遲發(fā)型疾病，可能會帶來恐慌和家庭糾紛，因在選擇CMA檢測時應(yīng)充分告知，并使夫婦作出合理的決定；應(yīng)用不同的平臺及分辨芯片，針對同一樣本進行檢測有可能會出現(xiàn)差異性結(jié)果，這是由于檢測本身的技術(shù)特點所決定，而并非醫(yī)務(wù)人員造成誤診或漏診。

3.5 無明顯表型異常成人CMA檢測的適用 建議在有資質(zhì)及經(jīng)驗的醫(yī)學遺傳醫(yī)師咨詢后，充分了解CMA的意義、局限性及檢測費用后，要求進行CMA檢測者；胎兒產(chǎn)前診斷CMA報告提示意義床意義不明CNV(VOUS)、可能致病的CNV、可能良性CNV和良性CNV；子代發(fā)現(xiàn)外顯率低的復發(fā)性CNV；不良生育史者(如因超聲異常引產(chǎn)或生育異?；純赫?；存在染色體嵌合體或不明原因染色體者。

CMA 技術(shù)在分子遺傳學分析中有著顯著的優(yōu)越性，總結(jié)以上經(jīng)驗，對于無明顯表型異常的成年群體可以有針對性地選擇CMA 檢測以明確其遺傳學病因，從而提供科學的生育指導。隨著 CMA技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，其檢測價格將會在一定程度上降低，相信 CMA 技術(shù)會有更加廣闊的應(yīng)用前景。

[1] Wapner RJ, Martin CL, Levy B, et al. Chromosomal microarray versus karyotyping for prenatal diagnosis[J].N Engl J Med,2012,367(23):2175-2184.

[2] Hillman SC, McMullan DJ, Hall G, et al. Use of prenatal chromosomal microarray: prospective cohort study and systematic review and meta-analysis[J].Ultrasound Obstet Gynecol,2013,41(6):610-620.

[3] Reddy UM, age GP, Saade GR, et al. Karyotype versus microarray testing for genetic abnormalities after stillbirth[J].N Engl J Med,2012,367(23):2185-2193.

[4] Dhillon RK, Hillman SC, Morris RK, et al. Additional information from chromosomal microarray analysis (CMA)over conventional karyotyping when diagnosing chromosomal abnormalities in miscarriage: a systematic review and meta-analysis[J].BJOG, 2014, 121(1):11-21.

[5] Coils P, Escudero T, Fischer J, et al. Validation of array comparative genome hybridization for diagnosis of translocations in pre-implantation human embryos[J].Reprod Biomed Online,2012,24(6):621-629.

[6] South ST, Lee C, Lamb AN, et al. ACMG standards and guidelines for constitutional cytogenomic microarray analysis, including postnatal and prenatal applications: revision 2013[J].Genet Med, 2013, 15 (11):901-909.

[7] Sahota DS, Leung WC, To WK, et al. Quality assurance of nuchal translucency for prenatal fetal down syndrome screening[J]. J Matern Fetal Neonatal Med, 2012, 25(7): 1039-1043.

[8] 周祎, 魯云涯, 陳涌珍,等.頸項透明層增厚胎兒的產(chǎn)前診斷及預后分析[J].中山大學學報醫(yī)學科學版，2013,34(6):888-893.

[9] Girirajan S, Eichler EE. Phenotypic variability and genetic susceptibility to genomic disorders[J]. Hum Mol Genet,2010,19(2):176-187.

[10] Shaffer LG, Rosenfeld JA. Microarray-based prenatal diagnosis for the identification of fetal chromosome abnormalities[J]. Expert Rev Mol Diagn,2013,13(6):601-611.

[11] Miller DT, Adam MP, Aradhya S, et al. Consensus statement: Chromosomal microarray is a first-tier clinical diagnostic test for individuals with developmental disabilities or congenital anomalies[J]. Am J Hum Genet, 2010, 86(5):749-764.

[12] Kearney HM, Thorland EC, Brown KK, et al. American College of Medical Genetics standards and guidelines for interpretation and reporting of postnatal constitutional copy number variants[J].Genet Med,2011, 13 (7):680-685.

[13] 染色體微陣列分析技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用協(xié)作組.染色體微陣列分析技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用專家共識[J].中華婦產(chǎn)科雜志,2014,49(8):570-572.

編輯：宋文穎

Objective To evaluate the contribution of chromosome microarray analysis (CMA) in adults those who with no obvious phenotypic abnormalities. Method 136 no obvious phenotypic abnormality cases between January 2014 and May 2016 were retrospectively, at Medical Genetics Center of Guangdong Women and Children’s Hospital, all of the cases were evaluated by the traditional karyotype and CMA. Results Fetal prenatal diagnosis CMA positive group have 33 cases,10 cases of peripheral blood CMA positive, accounting for 30.3% of the total cases,52.6% of the number of households; adverse reproductive history group have 76 cases, 9 cases of peripheral blood CMA positive , accounting for 11.8% of the total cases, 16% of the number of households; one of the couple chromosomal abnormalities group have 25 cases, 3 cases of peripheral blood CMA positive, accounting for 12% of the total cases; special family history group have 2 cases, peripheral blood CMA results were no significant abnormalities. Conclusions The application of CMA in adults with no obvious phenotypic abnormalities, can identify the etiology genetic, provide more comprehensive and detailed cytogenetic information and genetic counseling.

adults with no obvious phenotypic abnormalities；chromosome microarray analysis； karyotype

10.13470/j.cnki.cjpd.2016.04.007

R714.55

A

2016-09-25)

DOI: 10.13470/j.cnki.cjpd.2016.04.008

*通訊作者：尹愛華，E-mail：yinaiwa@126.vip.com