張彥 吳柏林

(1. 廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣東廣州 511442； 2. 哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院波士頓兒童醫(yī)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)部；3.復(fù)旦大學(xué)兒科醫(yī)院、復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院，上海 200433)

高通量測序在遺傳病臨床基因檢測中的效果評價(jià)

張彥1,2吳柏林2,3*

(1. 廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣東廣州 511442； 2. 哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院波士頓兒童醫(yī)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)部；3.復(fù)旦大學(xué)兒科醫(yī)院、復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院，上海 200433)

基于國內(nèi)外迅猛發(fā)展的高通量測序技術(shù)(第二代測序技術(shù))應(yīng)用以及精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的需求，從技術(shù)和成本角度分析高通量測序技術(shù)用于同時(shí)檢測單核苷酸變異(SNV) 和拷貝數(shù)變異(CNV) 的臨床應(yīng)用價(jià)值。

高通量測序；拷貝數(shù)變異；單核苷酸變異；基因診斷

高通量測序技術(shù)(high throughput sequencing)也叫做第二代測序或下一代測序(next generation sequencing，NGS)，由于其較高的檢測效率而得到越來越多的推廣和應(yīng)用。但由于技術(shù)發(fā)展的局限和生物信息學(xué)的限制，臨床應(yīng)用尚存在著較多的結(jié)果可重復(fù)性問題和數(shù)據(jù)解讀困難。本文就高通量測序技術(shù)在臨床應(yīng)用方面的實(shí)用性做一綜述，擬對其同時(shí)檢測拷貝數(shù)變異(copy number variation，CNV)和單核苷酸變異(single nucleotide variation, SNV)的效能進(jìn)行客觀評價(jià)。

1 NGS簡介

NGS技術(shù)的發(fā)展目前大致可歸結(jié)為3個(gè)方向。第一個(gè)方向可追溯到1990年的大規(guī)模平行測序技術(shù)(massively parallel signature sequencing, MPSS)[1]，由于其技術(shù)極其復(fù)雜而使其應(yīng)用受限。2004年與Solexa公司合并，而后者是基于1998年出現(xiàn)的另一技術(shù)-可逆染料終止技術(shù)(reversible dye-terminator technology)[2]，后來被Illumina公司兼并，最終發(fā)展為現(xiàn)在的邊合成邊測序技術(shù)；第二個(gè)方向起始于2005年的聚合酶克隆測序技術(shù)(polony sequencing)[3]，后來整合入Applied Biosystems公司的 SOLiD平臺，并最終相繼被Life Technologies和Thermo Fisher Scientific公司并購，發(fā)展為現(xiàn)在的半導(dǎo)體測序技術(shù)；第三種為焦磷酸測序技術(shù)，出現(xiàn)于2005年，后被Roche Diagnostics公司并購。

還有一些其他高通量測序技術(shù)得到過推廣，比如納米球測序技術(shù)(DNA nanoball sequencing)[4]被Complete Genomics公司利用開發(fā)，后被華大基因并購；單分子熒光測序技術(shù)由Helicos Biosciences公司開發(fā)，但該公司很快破產(chǎn)；單分子實(shí)時(shí)測序(single molecule real time sequencing)[5]由Pacific Biosciences公司開發(fā)；另外，有些高通量測序技術(shù)仍處于研發(fā)階段或初步使用，如納米孔測序技術(shù)(Nanopore DNA sequencing)、微流控Sanger測序等[6，7]。

就目前已經(jīng)在臨床應(yīng)用的幾種高通量測序技術(shù)，按其技術(shù)原理和優(yōu)缺點(diǎn)簡單歸納如表1。

2 NGS同時(shí)檢測SNV和CNV的臨床應(yīng)用嘗試

自從高通量測序技術(shù)誕生開始，科學(xué)界對于各種遺傳變異的檢測要求就在不斷提高，包括大到染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)，基因組微缺失微重復(fù)等的變異(如21-三體綜合征、貓叫綜合征)、不同長度片段拷貝數(shù)/CNV的變異(如α地中海貧血、DMD)，小到單個(gè)或數(shù)個(gè)堿基對/SNV的變異(如結(jié)節(jié)硬化癥、成骨不全癥)都可以導(dǎo)致遺傳病。因此在同一平臺同時(shí)檢測各種致病基因突變(檢測SNV) 或基因組失衡(檢測CNV) 就成為遺傳病基因診斷的必然要求，尤其對于罕見遺傳病。

表1 4種高通量測序技術(shù)比較

目前的高通量測序技術(shù)對于檢測單個(gè)或少數(shù)幾個(gè)核苷酸變異(SNV)一般不存在太多問題，各大主流測序平臺(如Proton 和Nextseq 550等)均可以檢測外顯子組或人基因組，檢測準(zhǔn)確性一般均可達(dá)到99%以上。對于拷貝數(shù)變異(CNV)和染色體微小結(jié)構(gòu)變異(structural variation, SV)等的檢測卻不盡如人意，主要問題出現(xiàn)在成本效益比太低、特定染色體區(qū)域的捕獲效率較差，以及短讀長拼接錯(cuò)誤。針對不同檢測方案的檢測效率大致可以分為如下幾類：

2.1 基于外顯子組測序(whole exome sequencing, WES)的嘗試 針對目前已知的約2萬個(gè)基因的所有編碼外顯子及兩端側(cè)翼序列進(jìn)行捕獲后測序。該方案優(yōu)點(diǎn)是成本相對較低，而且將絕大多數(shù)已知致病基因的突變位點(diǎn)囊括在內(nèi)，可以一次性將大部分已知疾病和未知疾病進(jìn)行檢測。缺點(diǎn)之一是對某些同源性較高的基因序列(如假基因和基因簇等)、高GC含量的基因序列以及基因動態(tài)突變(如亨廷頓舞蹈病的致病基因HTT等)等情況應(yīng)對困難；另一缺點(diǎn)就是幾乎無法準(zhǔn)確檢測到CNV以及SV，因?yàn)椴贿B續(xù)的捕獲將本身短讀長的缺點(diǎn)加劇了，對于微小片段缺失或重復(fù)幾乎不具備檢測能力。雖然有許多研究報(bào)道用外顯子組測序結(jié)合特定的算法可以有效地檢測到某些較大的CNV[8-10]，但總體而言，檢測所有已知的和未知的不同大小的CNV，WES目前并不具備有效檢測能力[11]。

2.2 基于特定基因群(gene panel)的嘗試 不少的研究針對特定的染色體區(qū)域或者某些特定的基因組合設(shè)計(jì)測序方案。由于測序針對性強(qiáng)，測序范圍一般較小，因此成本相對較低，可以兼顧編碼區(qū)和非編碼區(qū)[12]。但此種模式僅能針對性地檢測某些疾病，無法大面積覆蓋已知或未知遺傳病，而且仍然需要解決特定區(qū)域的捕獲效率問題，同樣需要面對WES在特殊基因序列檢測的困難[13]。

2.3 基于全基因組(whole genome sequencing，WGS)的嘗試 針對全基因組的測序是理論上解決同時(shí)檢測CNV和SNV的最有效方案，但是目前各種研究報(bào)道并不太多，原因主要包括：①成本太高，目前數(shù)據(jù)認(rèn)為，大于20X的數(shù)據(jù)為可信數(shù)據(jù)，而30X以上比較均一的全基因組測序費(fèi)用目前仍然需要數(shù)千美金，成本高昂[14]；②特定區(qū)域數(shù)據(jù)有效性差，如著絲粒區(qū)、端粒區(qū)等異染色質(zhì)區(qū)域和某些高GC含量區(qū)屬于測序盲區(qū)，數(shù)據(jù)可信度較差。據(jù)目前研究顯示，約有16%的基因組序列屬于難測區(qū)域[15]?；诖耍m然有部分機(jī)構(gòu)用WGS的平臺檢測CNV，但大多為低深度測序(低于10X)，可信度相對較差。因此，國家食品藥品檢定研究院近期發(fā)布了《第二代測序技術(shù)檢測試劑質(zhì)量評價(jià)通用技術(shù)指導(dǎo)原則》，明確規(guī)定了“原則上全基因組測序一般不用于臨床檢測，除非有充分的技術(shù)適用性驗(yàn)證報(bào)告”[16]。

3 展望

盡管高通量測序作為目前最有可能實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測SNV和CNV的技術(shù)手段，其對臨床遺傳病基因檢測的大規(guī)模廣泛應(yīng)用尚待時(shí)日。整合SNV和CNV乃至SV于同一平臺檢測是技術(shù)發(fā)展的必然趨勢，從成本和技術(shù)原理角度，大致有兩方面的發(fā)展趨勢可以預(yù)測。

3.1 成本下降后的WGS 目前全基因組測序是技術(shù)上最接近單一平臺同時(shí)檢測SNV和CNV的技術(shù)，但成本和讀長是其受限因素。隨著測序成本的繼續(xù)降低，讀長短和拼接錯(cuò)誤多將成為限制目前幾種常用的第二代測序(Life、Illumina等)技術(shù)實(shí)現(xiàn)有效臨床檢測的主要瓶頸。

3.2 第三代長片段測序的應(yīng)用 目前已有不少研究機(jī)構(gòu)嘗試單分子測序，即俗稱的第三代測序技術(shù)。相較于第二代測序技術(shù)，其最大的優(yōu)勢在于讀長的明顯加長。第二代測序技術(shù)的單片段讀長一般不超過500bp，但目前可查到的第三代測序技術(shù)平臺，如Pacific Bioscience一般均為kb級，另有其他機(jī)構(gòu)宣稱研發(fā)的測序方法平均讀長已可達(dá)200kb，如Nanopore。

顯著延長的讀長可以極大地減少第二代測序技術(shù)的拼接錯(cuò)誤，而且可以避開基因組復(fù)雜結(jié)構(gòu)對捕獲和測序的影響，從而大幅度地提高檢測準(zhǔn)確性。雖然各種第三代測序技術(shù)還有各種各樣的問題，但假以時(shí)日仍有較大的發(fā)展空間。

在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)和出生缺陷防控的政策支持和不斷提高的優(yōu)生優(yōu)育的需求推動下，整合SNV、CNV甚至SV檢測技術(shù)至同一平臺是大勢所趨。在兒科領(lǐng)域，諸多遺傳病，尤其是罕見遺傳病存在診斷困難，目前的遺傳學(xué)檢測往往需要結(jié)合多種技術(shù)進(jìn)行(如高通量測序和芯片等)；在產(chǎn)科和產(chǎn)前診斷領(lǐng)域，針對孕期超聲異常的胎兒的遺傳學(xué)原因排查也常需要多種方法結(jié)合進(jìn)行(如核型分析、芯片等)。如能將SNV、CNV和SV檢測在同一平臺進(jìn)行，將明顯提高檢測效率、減少患兒/胎兒父母等待時(shí)間、減少溝通成本、節(jié)省檢測成本以及緩減實(shí)驗(yàn)室壓力，極大地有利于出生缺陷的防控。

[1] Brenner S, Johnson M, Bridgham J, et al. Gene expression analysis by massively parallel signature sequencing (MPSS) on microbead arrays[J]. Nat Biotechnol, 2000, 6: 630-634.

[2] Bentley DR, Balasubramanian S, Swerdlow HP, et al. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry[J]. Nature, 2008, 7218: 53-59.

[3] Shendure J, Porreca GJ, Reppas NB, et al. Accurate multiplex polony sequencing of an evolved bacterial genome[J]. Science, 2005, 5741: 1728-1732.

[4] Drmanac R, Sparks AB, Callow MJ, et al. Human genome sequencing using unchained base reads on self-assembling DNA nanoarrays[J]. Science, 2010, 5961: 78-81.

[5] Eid J, Fehr A, Gray J, et al. Real-time DNA sequencing from single polymerase molecules[J]. Science, 2009, 5910: 133-138.

[6] Ammar R, Paton TA, Torti D, et al. Long read nanopore sequencing for detection of HLA and CYP2D6 variants and haplotypes[J]. F1000 Res, 2015, 4:17.

[7] Kan CW, Fredlake CP, Doherty EA, et al. DNA sequencing and genotyping in miniaturized electrophoresis systems[J]. Electrophoresis, 2004, 25(21-22): 3564-3588.

[8] D'Aurizio R, Pippucci T, Tattini L, et al. Enhanced copy number variants detection from whole-exome sequencing data using EXCAVATOR2[J]. Nucleic Acids Res, 2016. [Epub ahead of print]

[9] Fromer M, Purcell SM. Using XHMM software to detect copy number variation in whole-exome sequencing data[J]. Curr Protoc Hum Genet, 2014, 81:7.23.1-21.

[10] Jiang Y, Oldridge DA, Diskin SJ, et al. CODEX: a normalization and copy number variation detection method for whole exome sequencing[J]. Nucleic Acids Res, 2015, 6: e39.

[11] Hong CS, Singh LN, Mullikin JC, et al. Assessing the reproducibility of exome copy number variations predictions[J]. Genome Med, 2016, 1: 82.

[12] Zhang X, Ma D, Zou W, et al. A rapid NGS strategy for comprehensive molecular diagnosis of Birt-Hogg-Dube syndrome in patients with primary spontaneous pneumothorax[J]. Respir Res, 2016, 1: 64.

[13] Wang Y, Yang Y, Liu J, et al. Whole dystrophin gene analysis by next-generation sequencing: a comprehensive genetic diagnosis of Duchenne and Becker muscular dystrophy[J]. Mol Genet Genomics, 2014, 5: 1013-1021.

[14] Plothner M, Frank M, von der Schulenburg JG. Cost analysis of whole genome sequencing in German clinical practice[J]. Eur J Health Econ, 2016.[Epub ahead of print]

[15] Telenti A, Pierce LC, Biggs WH, et al. Deep sequencing of 10,000 human genomes[J]. Proc Natl Acud Sci U S A, 2016,113(42):11901-11906.

[16] 中國食品藥品檢定研究院. 第二代測序技術(shù)檢測試劑質(zhì)量評價(jià)通用技術(shù)指導(dǎo)原則[EB/OL].2016.http://www.nicpbp.org.cn/CL0149/8495.html

編輯：熊詩詣

10.13470/j.cnki.cjpd.2016.04.002

R714.55

A

2016-09-21)

*通訊作者：吳柏林，E-mail：bai-lin.wu@childrens.harvard.edu