高秋玉,鄧小寬,劉麗瓊,何 淼,高 平

(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院藥用天然產(chǎn)物實驗室,四川成都 610015)

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辣木葉抗氧化活性研究及活性成分含量測定

高秋玉,鄧小寬,劉麗瓊,何 淼,高 平*

(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院藥用天然產(chǎn)物實驗室,四川成都 610015)

目的:確定辣木葉抗氧化有效部位,建立HPLC測定辣木葉中新綠原酸和異槲皮苷含量的方法。方法:采用體外方法評價辣木葉提取物四個部位石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、總奎寧酸和總黃酮的抗氧化活性;采用HPLC,選擇Sepax Sapphire C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱,流動相為乙腈-0.05%磷酸溶液梯度洗脫,流速為1 mL/min,檢測波長330 nm,柱溫30 ℃。結(jié)果:以異槲皮苷為代表的黃酮類成分和新綠原酸等奎寧酸類成分清除能力最強(qiáng),二者濃度大于800 μg/mL時,對DPPH清除率達(dá)80%以上,且對DPPH和羥自由基清除率均高于石油醚和乙酸乙酯萃取物;新綠原酸和異槲皮苷在檢測范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,平均加樣回收率分別為98.84%、98.70%,RSD均小于3.0%。結(jié)論:辣木葉抗氧化有效部位為總奎寧酸和總黃酮;該方法簡便可靠,可作為辣木葉中新綠原酸和異槲皮苷的定量分析方法。

辣木葉,抗氧化活性,有效部位,HPLC,含量測定

辣木(MoringaoleiferaLam)又名鼓槌樹、馬蘿卜、不死樹等,屬十字花目辣木亞目辣木科辣木屬植物,為多年生熱帶落葉喬木[1]。研究表明辣木葉富含礦物質(zhì)、氨基酸和維生素等營養(yǎng)物質(zhì)成分[2-3]。另外,辣木葉具有的消炎抑菌[4-5]、降血糖[6]、抗氧化[7]、治療潰瘍[8]和瘧疾[9]等醫(yī)療保健功能也引起了廣泛關(guān)注。

目前,國內(nèi)外關(guān)于辣木葉抗氧化活性研究局限于粗提物上[10-11],抗氧化成分不明確,基本沒有質(zhì)量控制方面的報道[12]。為進(jìn)一步確定辣木葉抗氧化有效部位和制定其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),本研究利用萃取和柱層析方法對辣木葉提取物進(jìn)行分離純化,得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、總奎寧酸和總黃酮四個部位,采用體外方法[13-14]評價該四個部位的抗氧化活性,篩選得到有效部位,并建立HPLC測定活性成分新綠原酸、異槲皮苷含量的方法,為辣木葉的質(zhì)量評價和合理開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

七水硫酸亞鐵、水楊酸、維生素C(VC)、30%過氧化氫、乙醇、磷酸、石油醚、乙酸乙酯 均為分析純;乙腈 色譜純,成都市科龍試劑廠;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司;實驗用5批辣木葉樣品(S1.云南麗江,S2.云南昆明,S3.云南西雙版納,S4.廣西河池,S5.廣東韶關(guān)),經(jīng)四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院藥用天然產(chǎn)物實驗室鑒定為辣木科植物辣木MoringaoleiferaLam的干燥葉;新綠原酸、異槲皮苷對照品 成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司,純度大于98%。

LC3000型高效液相色譜儀 北京創(chuàng)新通恒科技有限公司,UV3000紫外檢測器,P3000高壓輸液泵;BS124S電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;KH5200E型超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司;R201D真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鞏義英峪高科儀器廠;SHZ循環(huán)水式真空泵 鞏義予華有限責(zé)任公司;UV8100型可見分光光度計 北京萊伯泰科儀器有限公司;MCI層析材料 成都科譜生物有限公司,50～70 μm。

1.2 實驗方法

1.2.1 辣木葉提取物的制備 辣木葉藥材粉碎過40目篩,取500 g,加入50%乙醇連續(xù)浸提3次。合并3次浸提液濃縮至無醇味得到辣木葉提取物浸膏。得到的浸膏加水稀釋后依次用石油醚、乙酸乙酯萃取,分別得到石油醚萃取物(Petroleum ether Extraction of Leaves,記為PEL)、乙酸乙酯萃取物(Ethyl acetate Extraction of Leaves,記為EEL)。取適量萃取后的辣木葉水相經(jīng)MCI柱層析,先用水洗脫除去糖、蛋白等,再依次用3個柱體積30%甲醇、3個柱體積50%甲醇洗脫[15-16],結(jié)合HPLC檢測分段收集得到高純度的總奎寧酸和總黃酮類成分,分別記為LM1和LM2,將其減壓濃縮蒸干備用。

1.2.2 辣木葉提取物對DPPH自由基清除能力的測定 將待測樣品和維生素C用50%乙醇配成濃度為6.25、12.5、25、50、100、200、400、800、1000 μg/mL的樣品溶液,在5 mL離心管中加入2 mL0.1 mmol/L(50%乙醇配制)DPPH標(biāo)準(zhǔn)溶液和2 mL待測樣品溶液,混合均勻,室溫下避光靜置30 min后,以50%乙醇為空白對照,在517 nm波長下測定吸光值[17-18]。DPPH自由基清除率的計算公式如下:

清除率(%)=[1-(Aj-Ai)/A0]×100

式中:Aj,2 mL DPPH標(biāo)準(zhǔn)溶液和2 mL樣品溶液的吸光值;Ai,2 mL 50%乙醇和2 mL 樣品溶液的吸光值;A0,2 mL DPPH標(biāo)準(zhǔn)溶液和2 mL 50%乙醇的吸光值。

1.2.3 辣木葉提取物對羥自由基清除能力的測定 利用Fenton反應(yīng)測定辣木葉提取物清除羥自由基的能力[19-20]。取1 mL 2.5 mmol/L FeSO4于5 mL離心管中,加入1 mL 5% H2O2,混勻后立即加入待測樣品溶液1 mL,混勻靜置5 min待反應(yīng);加入1 mL 2.5 mmol/L水楊酸,于37 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)1 h后,于510 nm波長處測定吸光值,記為Am。將樣品溶液用等量50%乙醇代替,在相同條件下測定的吸光值,記為A0;用等量蒸餾水代替H2O2,在相同條件下測得的吸光值記為An。羥自由基清除率的計算公式如下:

清除率(%)=[1-(Am-An)/A0]×100

1.2.4 HPLC同時測定新綠原酸和異槲皮苷含量

1.2.4.1 色譜條件 色譜柱:Sepax Sapphire C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:乙腈(A)-0.05%磷酸水溶液(B),梯度洗脫(0～15 min,10% A;15～50 min,30% A);流速:1.0 mL/min;檢測波長:330 nm;進(jìn)樣量:5 μL;柱溫30 ℃。

1.2.4.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取新綠原酸、異槲皮苷對照品9.0 mg、5.2 mg,置于25 mL容量瓶中,加入50%乙醇超聲溶解并定容至刻度,配制成質(zhì)量濃度為新綠原酸0.360 mg/mL、異槲皮苷0.208 mg/mL的混合對照品溶液。

1.2.4.3 供試品溶液的制備 辣木葉藥材粉碎過40目篩,取約1.0 g,精密稱定,置于20 mL容量瓶中,加入50%乙醇15 mL,超聲處理30 min,放冷,加50%乙醇稀釋至刻度,搖勻,用0.45 μm有機(jī)系微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液,待用。

1.2.4.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液適量,用50%乙醇分別配制成含新綠原酸0.018、0.036、0.09、0.18、0.27、0.36 mg/mL和異槲皮苷0.0104、0.0208、0.052、0.104、0.156、0.208 mg/mL的對照品溶液,按1.2.4.1項條件下進(jìn)行測定。

1.2.4.5 精密度實驗 取配制好的濃度分別為新綠原酸0.09 mg/mL、異槲皮苷0.052 mg/mL的混合對照品溶液,按1.2.4.1項條件,連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄峰面積值。

1.2.4.6 穩(wěn)定性實驗 在室溫下,考察辣木葉中這兩種成分的穩(wěn)定性。選取新綠原酸0.18 mg/mL和異槲皮苷0.104 mg/mL的混合對照品溶液,按1.2.4.1項條件,分別于0、4、8、12、24 h進(jìn)行測定,記錄峰面積。

1.2.4.7 重復(fù)性實驗 取同一批辣木葉原料,按1.2.4.3項下方法平行制備6份供試品溶液,進(jìn)行HPLC分析。

1.2.4.8 加樣回收率實驗 取同一批已知含量的辣木葉樣品約1.0 g,精密稱定,分別精密加入一定量新綠原酸和異槲皮苷對照品溶液,按1.2.4.3項下方法制備供試品溶液,按1.2.4.1項條件測定,計算加樣回收率。

1.2.4.9 樣品含量測定 制備5批樣品溶液,平行3份,測定其新綠原酸和異槲皮苷的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣木葉提取物對DPPH自由基清除能力的測定

根據(jù)測定結(jié)果,計算各個樣品對DPPH自由基的清除率,結(jié)果見圖1。

圖1 DPPH自由基清除率折線圖Fig.1 Line charts of DPPH free radical clearance rate

由結(jié)果可知,不同樣品對DPPH自由基的清除能力依次為VC>LM1>LM2>EEL>PEL。低濃度時,LM1、LM2對DPPH的清除率明顯高于EEL和PEL,隨著樣品濃度增加,清除率呈現(xiàn)增長趨勢,最后趨于穩(wěn)定,逐漸接近VC。

2.2 辣木葉提取物對羥自由基清除能力的測定

根據(jù)測定結(jié)果,計算各個樣品對羥自由基的清除率,結(jié)果見圖2。

圖2 羥自由基清除率折線圖Fig.2 Line charts of hydroxyl radical clearance rate

由結(jié)果可知,不同樣品對羥自由基的清除能力依次為VC>LM2>LM1>EEL>PEL。低濃度時,LM1和LM2對羥自由基的清除率高于VC,隨著濃度升高,LM2清除率接近VC。結(jié)合“2.1”實驗結(jié)果,LM1、LM2均表現(xiàn)出對DPPH和羥自由基較強(qiáng)的清除能力,且二者的清除能力僅稍弱于VC,說明這兩個部位具有較強(qiáng)的抗氧化活性,具有極大的研究意義。

2.3 HPLC同時測定新綠原酸和異槲皮苷含量

2.3.1 色譜條件的選擇 分別對乙腈-0.05%磷酸水、甲醇-0.05%磷酸水等多種洗脫系統(tǒng)進(jìn)行考查,發(fā)現(xiàn)采用前者梯度洗脫時,各峰的分離度較好,保留時間適中,基線較平穩(wěn)。選擇330 nm作為檢測波長,這是基于所測化合物在該波長處吸收相對最大,且雜質(zhì)干擾較少。色譜圖見圖3。結(jié)果證明,在該色譜條件下,樣品中目標(biāo)物出峰時間和對照品的出峰時間一致,且與其他雜峰分離良好。

圖3 混合對照品(A)和供試品(B)HPLC圖Fig.3 HPLC chromatograms of the reference substances(A)and sample(B)注：1:新綠原酸;2:異槲皮苷。

2.3.2 線性關(guān)系考察 以對照品溶液濃度(X)為橫坐標(biāo),峰面積(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得新綠原酸、異槲皮苷的回歸方程分別為:Y1=1025.3582×104X1-39809,r1=0.9995;Y2=660.8132×104X2-13976,r2=0.9995。結(jié)果表明,新綠原酸、異槲皮苷分別在0.018～0.36、0.0104～0.208 mg/mL與峰面積積分值線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度實驗 測得新綠原酸、異槲皮苷峰面積的RSD分別為1.29%、1.30%,表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性實驗 計算新綠原酸、異槲皮苷的RSD分別為0.23%和1.69%,表明對照品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復(fù)性實驗 考察新綠原酸、異槲皮苷峰面積RSD分別為1.4%和1.5%,表明該方法的重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率實驗 新綠原酸、異槲皮苷的平均加樣回收率分別為98.84%、98.70%,RSD分別為2.52%、2.82%,表明上述實驗方法的準(zhǔn)確度較高。

2.3.7 樣品含量測定 測定結(jié)果見表1。

表1 不同產(chǎn)地辣木葉中新綠原酸和異槲皮苷含量(n=3)
Table 1 Content determination results of neochlorogenic acid and isoquercitrin inMoringaoleiferaLamleaves from different regions(n=3)

樣品編號新綠原酸(mg/g)異槲皮苷(mg/g)S10048±00010027±0003S20035±00020030±0002S30035±00010031±0001S40038±00040033±0002S50040±00030049±0003

3 結(jié)論

實驗過程中,辣木葉提取物用石油醚、乙酸乙酯萃取后得到的水相經(jīng)分離純化,鑒定得到其中主要化學(xué)成分為新綠原酸、隱綠原酸等奎寧酸類和異槲皮苷、紫云英苷等黃酮類化合物,據(jù)此結(jié)果在MCI柱層析過程分段收集得到總奎寧酸LM1和總黃酮LM2。采用體外方法對得到的辣木葉提取物四個部位進(jìn)行活性評價,結(jié)果LM1、LM2對DPPH和羥自由基的清除率大大高于EEL、PEL,表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性,僅稍弱于VC,從而得出辣木葉抗氧化有效部位為總奎寧酸和總黃酮,但還需對其中的抗氧化活性單體成分繼續(xù)追蹤研究。

基于抗氧化實驗結(jié)果,選取辣木葉中奎寧酸成分新綠原酸和黃酮成分異槲皮苷作為質(zhì)量控制指標(biāo)成分。本實驗建立了HPLC同時測定不同產(chǎn)地辣木葉中新綠原酸和異槲皮苷含量的方法,該法簡便、準(zhǔn)確,為制定辣木葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

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Research of antioxidative activity and determination of active ingredients in Moringa oleifera Lam leaves

GAO Qiu-yu,DENG Xiao-kuan,LIU Li-qiong,HE Miao,GAO Ping*

(Laboratory of Medicinal Natural Products,College of Life Sciences,Sichuan University,Chengdu 610015,China)

Objective:To determine antioxidant effective parts and develop a HPLC method for simultaneous determination of neochlorogenic acid and isoquercitrin inMoringaoleiferaLamleaves. Methods:The antioxidant potency of four extracts ofMoringaoleiferaLamleaves,which are petroleum ether extraction,ethyl acetate extraction,total quinic acids and flavonoids,was evaluatedinvitrosystems. HPLC analysis was successfully conducted by using a Sepax Sapphire C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)column,eluted with a gradient of acetonitrile -0.05% phosphoric acid with a flow rate of 1 mL/min,and detected at 330 nm. The column temperature was set at 30 ℃. Results:Quinic acids like neochlorogenic acid and flavonoids represented by isoquercitrin showed strongest scavenging capability. It showed that their scavenging activity of DPPH free radical reached 80%,when the concentration was greater than 800 μg/mL. And both of them showed higher scavenging rate for DPPH and hydroxyl radicals than petroleum ether and ethyl acetate extraction. Neochlorogenic acid and isoquercitrin showed good linearity within the test ranges. The recoveries were 98.84%,98.70%,respectively and RSD was less than 3%.Conclusions:The antioxidant effective parts inMoringaoleiferaLamleaves were total quinic acids and flavonoids. The method is simple and accurate,and could be used to identify and evaluate the quantitative determination of neochlorogenic acid and isoquercitrin inMoringaoleiferaLamleaves.

MoringaoleiferaLamleaves;antioxidant activity;effective parts;HPLC;quantitative determination

2016-07-08

高秋玉(1991-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：天然藥物化學(xué)，E-mail：848893521@qq.com。

*通訊作者:高平(1963-)，女，博士，教授，研究方向：天然藥物化學(xué)，E-mail：gaop@scu.edu.cn。

TS202.1

A

1002-0306(2016)23-0324-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.23.052