張 弦金曉瀅

吳茱萸堿誘導(dǎo)人胃癌SGC7901細(xì)胞凋亡及機(jī)制研究

張 弦1金曉瀅2

目的觀察吳茱萸堿對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞的抑制作用，探討其可能的分子機(jī)制。方法體外培養(yǎng)人胃癌SGC7901細(xì)胞，用不同濃度的吳茱萸堿作用于SGC7901細(xì)胞24h。MTT比色法觀察吳茱萸堿對(duì)SGC7901細(xì)胞增殖活性的影響；倒置相差顯微鏡及熒光電鏡觀察細(xì)胞凋亡狀態(tài)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)SGC7901細(xì)胞凋亡情況；用RT-PCR檢測(cè)不同濃度的吳茱萸堿干預(yù)24h后SGC7901細(xì)胞Survivin和Caspase-3mRNA表達(dá)。結(jié)果吳茱萸堿能抑制SGC7901細(xì)胞增殖，呈劑量依賴性；倒置相差顯微鏡及熒光電鏡下均觀察到典型的細(xì)胞凋亡狀態(tài)；吳茱萸堿可誘導(dǎo)SGC7901細(xì)胞凋亡,且隨劑量增加作用增強(qiáng)；隨吳茱萸堿濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)Survivin基因表達(dá)強(qiáng)度逐漸降低，Caspase-3表達(dá)強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。結(jié)論吳茱萸堿能抑制人胃癌SGC7901細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，SGC7901細(xì)胞中Survivin mRNA表達(dá)水平顯著降低，從而可能下調(diào)其對(duì)Caspase-3的抑制作用，使細(xì)胞凋亡增加。

人胃癌SGC7901細(xì)胞；吳茱萸堿；凋亡；Survivin；Caspase-3

吳茱萸堿為蕓香科植物吳茱萸近成熟干燥果實(shí)，其主要化學(xué)成分為揮發(fā)油類及生物堿類，其中吳茱萸堿為主要活性物質(zhì)。近年來(lái)，吳茱萸堿的抗腫瘤活性被陸續(xù)報(bào)道，但作用機(jī)制仍有待深入研究。凋亡是在基因調(diào)控下的細(xì)胞程序化死亡。正常細(xì)胞的增殖、分化和凋亡存在一種平衡，故誘導(dǎo)凋亡是腫瘤治療的一條重要途徑。本文采用不同濃度的吳茱萸堿體外干預(yù)SGC7901胃癌細(xì)胞，觀察其對(duì)胃癌的抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡作用，并對(duì)其機(jī)制作初步研究。

1 材料與方法

1.1 藥品及細(xì)胞 吳茱萸堿標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma公司；人胃癌細(xì)胞株SGC7901購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.2 試 劑 RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，噻唑藍(lán)購(gòu)自Sigma公司；Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Becman Coulter公司。

1.3 方 法 將SGC7901細(xì)胞株接種于無(wú)菌培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞單層貼壁培養(yǎng)，每2～4天傳代1次。細(xì)胞傳代時(shí)用0.25%胰酶，在37℃條件下消化2～3min，適量培養(yǎng)基吹打成細(xì)胞懸液后接種。

1.3.1 MTT法檢測(cè)不同濃度吳茱萸堿對(duì)SGC7901細(xì)胞的抑制作用[1]取生長(zhǎng)狀態(tài)好，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞系，常規(guī)胰酶消化后培養(yǎng)液吹打成細(xì)胞懸液。血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后將細(xì)胞密度調(diào)整為（4～5）×104/mL的細(xì)胞懸液。孔板每孔加入細(xì)胞懸液100μL，培養(yǎng)液100μL，調(diào)零孔加入200μL培養(yǎng)液。細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的吳茱萸堿，使其終濃度分別為3μmol/L、6μmol/L、12μmol/L、24μmol/L、48μmol/L，對(duì)照組則加等量不含藥物的培養(yǎng)液。每個(gè)劑量5個(gè)平行孔。于24h后取96孔培養(yǎng)板，每孔加入新鮮配制的濃度為5g/L的MTT 20μL。繼續(xù)培養(yǎng)3h后取出培養(yǎng)板，小心吸棄培養(yǎng)基，每孔加DMSO 150μL，輕輕震蕩10min后，用酶聯(lián)儀于490nm處測(cè)出各孔吸光度值，按下式計(jì)算細(xì)胞抑制率：細(xì)胞抑制率=（1-給藥孔平均OD值/對(duì)照孔平均OD值）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2 細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察

1.3.2.1 倒置相差顯微鏡下觀察形態(tài)學(xué)變化[2]取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人胃癌細(xì)胞，胰蛋白酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.2×104/mL，以每孔2mL細(xì)胞懸液接種于6孔板（各孔內(nèi)預(yù)先放置無(wú)菌蓋玻片1張），十字晃動(dòng)使細(xì)胞分布均勻，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，棄去舊培養(yǎng)液，各孔加入含 0μmol/L、3μmol/L、6μmol/L、12μmol/L、24μmol/L、48μmol/L吳茱萸堿培養(yǎng)液2mL，置于37℃、5%CO2的培箱中，于24h后倒置相差顯微鏡下觀察形態(tài)學(xué)變化。

1.3.2.2 熒光電鏡下觀察形態(tài)學(xué)變化（Hochest染色）

將1.2×104個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，每孔2mL，過(guò)夜，待細(xì)胞貼壁，棄去培養(yǎng)基，加入含0μmol/L、3μmol/L、6μmol/L、12μmol/L、24μmol/L、48μmol/L吳茱萸堿培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h，收集培養(yǎng)基留作備用，0.25%胰酶EDTA消化，加入收集培養(yǎng)基吹打成細(xì)胞懸液，1000rpm離心5min，留少許上清重懸沉淀，4%多聚甲醛室溫固定5min，PBS離心洗滌2次，每次3min，留少許上清約100μL，加入10μL Hochest染液室溫避光染30min，再用PBS洗兩遍，滴1滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋玻片封片，盡量避免氣泡產(chǎn)生。熒光顯微鏡下觀察，拍照。每個(gè)樣品隨機(jī)計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，計(jì)算凋亡細(xì)胞百分率。

1.3.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 分別消化收集以0μmol/L、3μmol/L、6μmol/L、12μmol/L、24μmol/L、48μmol/L藥物處理24h的胃癌細(xì)胞。收集細(xì)胞后，調(diào)整濃度至1×106/mL，3000rpm離心5min，吸棄上清，保留細(xì)胞，PBS重懸細(xì)胞離心2次，加入預(yù)冷的結(jié)合緩沖液100μL重懸細(xì)胞，置冰浴，加入5μL Annexin V/FITC和10μL PI于細(xì)胞懸液中，輕輕混勻，將試管至于室溫避光染色15min，補(bǔ)加400μL結(jié)合緩沖液混懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，分析細(xì)胞凋亡百分比。

1.3.4 RT-PCR檢測(cè)凋亡調(diào)節(jié)基因mRNA表達(dá)

1.3.4.1 總RNA抽提 收集細(xì)胞于1.5mL Ennerdorf管（無(wú)RNA酶、無(wú)菌），加入1mL Trizol，充分混勻后，室溫靜置15min。加200μL氯仿，充分混勻，4℃，15000rpm，離心8min。取上清（約500μL），至1.5mL Eppendorf管（同上），加500μL異丙醇，混勻，4℃，15000rpm，20min。棄上清，用75%乙醇1mL沖洗沉淀，高速離心5min。棄上清，RNA沉淀于空氣中干燥（2～3min）。將干燥后的RNA溶解于DEPC處理水中。將總RNA作適當(dāng)稀釋（DEPC水）后，分光光度計(jì)測(cè)OD260/OD280的比值，并定量。定量公式：RNA濃度（μg/mL）=OD260值×40×稀釋倍數(shù)（本實(shí)驗(yàn)為400倍）。結(jié)果顯示OD260/OD280比值在1.8～2.0之間，表示RNA無(wú)降解。

1.3.4.2 逆轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng) 按下列順序在1.5mL離心管中加入下列反應(yīng)物（體積為12.5μL，總RNA體積與DEPC水的總體積是8μL，其中RNA的量是2μg）：DEPC水，RNA酶抑制劑（50U/μL）0.5μL，隨機(jī)引物（50pM/μL）2μL，RNA。在65℃水浴處理5min。室溫放置10min，高速（高于5000g）離心5s。按下列順序加在1.5mL離心管入下列反應(yīng)物（加入之后總體積為20μL）：RNA酶抑制劑（50U/μL）0.5μL，5× buffer（Promega）4μL，dNTP MIX（10mM/each）2μL，DTT 2μL，M-MLV（200U/μL）1μL，水浴37℃下反應(yīng)1h，90℃處理5～10min，冰浴5min，高速離心5s，所得cDNA作PCR。引物序列由上海捷蘭生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成，序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)所加成分（20μL體系）：H2O 12.1μL，10pM Primer1 0.2μL，10pM Primer2 0.2μL，20x sybr 0.5μL，2.5mM dNTP 0.4μL，25mM Mg2+2.4μL，10xbuffer 2μL，5u/μL Taq 酶0.2μL，模板2μL。反應(yīng)條件為：（1）94℃ 2min；（2）94℃ 40s，50～65℃ 40s，72℃ 1min，35個(gè)循環(huán)；（3）72℃ 5min。經(jīng)PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，1.2%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀上照相并進(jìn)行密度掃描分析，重復(fù)5次。以各PCR產(chǎn)物密度/GADPH來(lái)表示各檢測(cè)指標(biāo)mRNA的相對(duì)含量，進(jìn)行半定量分析[3-4]。

表1 引物序列及長(zhǎng)度

2 結(jié) 果

表2 吳茱萸堿對(duì)SGC7901細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率（±s）

表2 吳茱萸堿對(duì)SGC7901細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率（±s）

注：與對(duì)照組比較,△P＜0.05

2.1 不同濃度的吳茱萸堿對(duì)SGC7901細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用 在3～48umol/L濃度范圍內(nèi)，吳茱萸堿作用24h后，對(duì)SGC7901細(xì)胞的增殖有顯著的抑制作用（P＜0.05），并且隨著吳茱萸堿濃度的增加，對(duì)細(xì)胞的抑制率也逐漸增加（見(jiàn)表2），可見(jiàn)吳茱萸堿以劑量依賴方式抑制SGC7901細(xì)胞生長(zhǎng)。

2.2 細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察 相差倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)：正常情況下細(xì)胞生長(zhǎng)良好，形狀不規(guī)則，呈梭形或多角形，并可融合形成集落，生長(zhǎng)有巢狀現(xiàn)象，細(xì)胞核大，核異型，核質(zhì)比高，可見(jiàn)異常核分裂相。不同濃度的作用于癌細(xì)胞后可見(jiàn)懸浮細(xì)胞增多，細(xì)胞漿混濁，細(xì)胞胞體縮小、變圓、皺縮、核固縮、碎裂，細(xì)胞折光性減弱，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)顆粒樣物質(zhì)，培養(yǎng)液中有較多的細(xì)胞碎片（見(jiàn)插頁(yè)圖1）。

熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)：不同濃度吳茱萸堿作用24h后，0mmol/L吳茱萸堿作用組染色質(zhì)分布均勻，呈彌散均勻藍(lán)白色熒光；而隨著濃度增加，可見(jiàn)細(xì)胞體積縮小，胞質(zhì)濃縮，胞核固縮，染色質(zhì)邊集，核碎裂，染色質(zhì)分割成塊，細(xì)胞核成致密濃染的顆粒狀熒光和形成凋亡小體等典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)改變。3、6μmol/L吳茱萸堿作用組部分細(xì)胞染色質(zhì)呈濃染的塊狀或顆粒狀，聚集于核周邊或裂解成碎片，并出現(xiàn)凋亡小體；12、24、48μmol/L吳茱萸作用組較多細(xì)胞胞內(nèi)染色質(zhì)分布不均，形成熒光斑點(diǎn)，呈凋亡特征性（見(jiàn)插頁(yè)圖2）。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)及細(xì)胞凋亡率比較 Annexin V-PI雙染色法檢測(cè)顯示隨著吳茱萸堿濃度的增加，SGC7901細(xì)胞的早期凋亡率逐漸增加（見(jiàn)表3，插頁(yè)圖3）。

表3 吳茱萸堿誘導(dǎo)SGC7901細(xì)胞凋亡的作用（±s）

表3 吳茱萸堿誘導(dǎo)SGC7901細(xì)胞凋亡的作用（±s）

注：與對(duì)照組比較，△P＜0.05

組別對(duì)照組吳茱萸堿3μmol/L組吳茱萸堿6μmol/L組吳茱萸堿12μmol/L組吳茱萸堿24μmol/L組吳茱萸堿48μmol/L組早期凋亡0.67±0.16 8.54±1.28△13.69±2.71△20.42±3.45△31.66±5.13△44.35±7.34△晚期凋亡和壞死1.49±0.23 4.36±0.64△10.43±2.01△16.79±3.06△23.83±4.11△32.54±5.48△

2.4 吳茱萸堿對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞Survivin、Caspase-3基因表達(dá)的影響 RT-PCR產(chǎn)物電泳后，SGC7901細(xì)胞對(duì)照組可見(jiàn)明亮的Survivin擴(kuò)增條帶，半定量分析Survivin基因表達(dá)強(qiáng)度發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，吳茱萸堿各組隨吳茱萸堿濃度的增加，Survivin基因表達(dá)強(qiáng)度逐漸降低（見(jiàn)插頁(yè)圖4）。

與SGC7901細(xì)胞對(duì)照組caspase-3mRNA表達(dá)水平比較，3μmol/L、6μmol/L、12μmol/L、24μmol/L、48μmol/L吳茱萸堿作用24h后，caspase-3 mRNA表達(dá)強(qiáng)度逐漸增加（見(jiàn)圖5插頁(yè)）。

3 討論

本研究觀察了從傳統(tǒng)中藥吳茱萸中得到的天然活性成分吳茱萸堿對(duì)SGC7901增殖的影響，實(shí)驗(yàn)證明，吳茱萸堿對(duì)SGC7901細(xì)胞增殖有抑制作用，其抑制作用隨著吳茱萸堿濃度的增加而增強(qiáng)，通過(guò)倒置相差顯微鏡及熒光電鏡下觀察，隨著吳茱萸堿濃度增加，可見(jiàn)SGC7901細(xì)胞體積縮小，胞質(zhì)濃縮，胞核固縮，染色質(zhì)邊集，核碎裂，染色質(zhì)分割成塊，細(xì)胞核成致密濃染的顆粒狀熒光和形成凋亡小體等典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)改變。

Annexin V-PI雙染色法檢測(cè)顯示0～48μmol/L處理胃癌細(xì)胞后，凋亡及壞死細(xì)胞數(shù)明顯增多，并且有濃度依賴性，而凋亡率變化比壞死更顯著，說(shuō)明在該濃度范圍內(nèi)誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡效應(yīng)要強(qiáng)于引起細(xì)胞壞死的作用，證實(shí)吳茱萸堿誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是殺傷胃癌細(xì)胞的作用機(jī)制之一。近年發(fā)現(xiàn)IAPs在抑制細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用，Survivin作為IAP基因家族成員之一，主要表達(dá)于細(xì)胞有絲分裂周期中S期及G2/M期[5]，廣泛表達(dá)于各種腫瘤組織中，而在正常組織中不表達(dá)或低表達(dá)，顯示其在癌組織中處于失控的表達(dá)狀態(tài)[6]，胃癌組織Survivin表達(dá)與胃癌凋亡指數(shù)呈負(fù)相關(guān)。本研究結(jié)果表明，在胃癌細(xì)胞SGC7901中Survivin基因表達(dá)明顯，隨著吳茱萸堿濃度的增加，Survivin mRNA表達(dá)逐漸降低，提示吳茱萸堿可能下調(diào)Survivin mRNA的表達(dá)。caspases是特異水解天冬氨酸羧基側(cè)肽鏈的半胱胺酸銨蛋白酶，它們?cè)诩?xì)胞中是一系列靜止的酶原，一旦被激活，效應(yīng)caspases就引起一系列的水解反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。目前普遍認(rèn)為caspase-3是哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵蛋白酶，是細(xì)胞凋亡兩途徑線粒體通路和死亡受體通路共同的效應(yīng)劑，它單獨(dú)或協(xié)同參與水解許多與凋亡有關(guān)的蛋白質(zhì)，它的活化必然引起caspase-3級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起細(xì)胞凋亡[7-8]。本研究結(jié)果顯示，SGC7901中caspase-3mRNA的表達(dá)水平隨著吳茱萸堿濃度的增加而逐漸增加。經(jīng)過(guò)吳茱萸堿的誘導(dǎo)作用，SGC7901細(xì)胞中Survivin mRNA表達(dá)水平顯著降低，從而可能下調(diào)其對(duì)終末效應(yīng)蛋白caspase-3的直接或間接抑制作用，使細(xì)胞凋亡增加。

吳茱萸堿誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡，是其對(duì)該細(xì)胞體外抑制增殖作用的重要分子機(jī)制。除促進(jìn)Survivin表達(dá)，下調(diào)caspase-3凋亡通路外，還可能還涉及其他的機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。本研究中不同濃度吳茱萸堿均作用于SGC7901細(xì)胞24h，后續(xù)可繼續(xù)研究不同作用時(shí)間與吳茱萸堿抑制作用之間的關(guān)系。

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（收稿：2015-08-20 修回：2015-10-10）

Effect of Evodiamine on Apoptosis of Gastric Cancer Cell SGC7901 and the Primary Mechanism

ZHANGXian1,允IN Xiaoying2. 1 Department of Traditional Chinese Medicine,Women's Hospital,Zhejiang University School of Medicine,Hangzhou(310000),China;2 Department of Traditional Chinese Medicine,the Second Afflicted Hospital,Zhejiang University School of Medicine,Hangzhou(310000),China

ObjectiveTo investigate the anti-tumor effect of evodiamine on apoptosis of human gastric cancer cell SGC7901 and to identify the underlying molecular mechanism.MethodsGastric cancer cell SGC7901 were cultured in vitro and treated by evodiamine of 0-48μmol/L concentrations for 24h.Inhibition on the proliferation of SGC7901 cells was assessed by MTT assay.The morphology of SGC7901 cells treated was observed by optical microscope.Gene transcription of survivin and caspase-3 in SGC7901 cells was also examined by RT-PCR.ResultsThe proliferation of SGC7901 cells was inhibited by evodiamine in a dose-dependent manner.Characteristic apoptosis was confirmed by optical microscope,and Hoechst 33258 staining analysis indicated that evodiamine caused typical characteristics of apoptotic programmed cell death.Flow cytometric analysis demonstrated that evodiamine caused a dose-dependent apoptosis of SGC7901 cells.The transcription of survivin gene showed decreasing tendency,and the caspase-3 gene showed increasing tendency when treated by 0-48μmol/L evodiamine for 24 h.ConclusionEvodiamine can inhibit the proliferation of SGC7901 cells and promot its apoptosis.Evodiamine down-regulated survivin mRNA levels and up-regulated the expression of caspase-3,and activated the activities of caspase-3 in the cells and eventually induced apoptosis in SGC7901 cells.

human gastric cancer cell SGC7901;evodiamine;apoptosis;survivin;caspase-3

1浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院中醫(yī)科（杭州 310000）；2浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院中醫(yī)科（杭州 310000）

張弦，Tel：13958015698