倪市毛姜昌浩陳智理駱高江黃檢英楊 劍

辛伐他汀對(duì)血管緊張素II誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷模型大鼠心肌細(xì)胞ACE2的影響

倪市毛1姜昌浩1陳智理1駱高江1黃檢英2楊 劍3

目的觀察辛伐他?。⊿IM）對(duì)血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導(dǎo)心肌損傷模型大鼠心肌細(xì)胞ACE2的影響。方法制備AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷大鼠模型，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、AngⅡ組、小劑量他汀組+AngⅡ組、中劑量他汀組+AngⅡ組、高劑量他汀組+AngⅡ組。應(yīng)用Western blot、PCR技術(shù)檢測(cè)各組大鼠心肌細(xì)胞ACE2蛋白和基因表達(dá)。結(jié)果與空白對(duì)照組比較，心肌損傷模型組（AngII組）ACE2蛋白和基因表達(dá)下降（0.21比0.74，0.333±0.122比1.000±0.149），兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與AngⅡ組比較，小劑量他汀組ACE2蛋白（0.39）和基因表達(dá)（0.399±0.054）略升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；中劑量他汀組ACE2蛋白（0.45）和基因表達(dá)（0.644±0.135）、高劑量他汀組ACE2蛋白（0.61）和基因表達(dá)（0.952±0.090）與AngⅡ組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且ACE2蛋白和基因表達(dá)隨著辛伐他汀濃度的升高而上升。結(jié)論AngⅡ刺激心肌細(xì)胞致ACE2蛋白、ACE2基因表達(dá)下降，而辛伐他汀可抑制該作用，使受AngⅡ損傷的心肌細(xì)胞ACE2蛋白、ACE2基因表達(dá)升高，其作用隨藥物濃度升高而增加。

大鼠；心肌細(xì)胞損傷；辛伐他??；血管緊張素II；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶

心衰患者腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)（RAAS）過度激活，體內(nèi)血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）表達(dá)大量增加導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷[1]。研究表明，他汀類藥物能通過其抗氧化機(jī)制減少因AngⅡ升高而引起的心肌細(xì)胞凋亡和壞死。目前他汀類藥物除了被廣泛用于降脂穩(wěn)定斑塊外，還被應(yīng)用于心功能衰竭患者以達(dá)到改善心肌重構(gòu)的治療目的。2000年Donoghue[2]和Tipnis[3]發(fā)現(xiàn)ACE2（血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的同系物），研究證實(shí)ACE2可降解AngⅡ生成Ang-（1-7）作用Mas受體，具有拮抗細(xì)胞增殖、抗炎、減少心肌細(xì)胞損傷的作用，它的過表達(dá)對(duì)衰竭的心臟具有保護(hù)作用，可改善心衰患者的臨床預(yù)后。多年來他汀類藥物能減輕AngⅡ?qū)π募〖?xì)胞的損傷已得到廣泛認(rèn)可，其機(jī)制多被解釋為抗炎、抗氧化。然而在AngⅡ損傷心肌細(xì)胞過程中他汀類藥物對(duì)ACE2是否有影響，目前確鮮有報(bào)道。本研究通過在AngII損傷大鼠心肌細(xì)胞中加入不同濃度的辛伐他汀，觀察其對(duì)ACE2基因及蛋白表達(dá)的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞來源 出生1～3天新生SD大鼠乳鼠40只，上海斯萊克試驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（滬）2012-002，SPF級(jí)。

1.2 試 劑 試劑FBS（hyclone公司），DME培養(yǎng)基（GIBCO），胰酶（GIBCO）青霉素-鏈霉素（GIBCO），AngII（北京達(dá)科），辛伐他?。⊿IM）（Sigma，363529）。0.45μmPVDF膜（Millipore公司），0.2μmPVDF膜（Bio-Rad公司），SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、ECLPlus試劑盒、PMSF、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天公司）、Western及 IP細(xì)胞裂解液，GAPDH （BIOWORLD，AP0063），ACE2（santa，sc-20998）。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 RevertAidFirstStrandcDNAsynthesisKit （Fermentas公司；貨號(hào)#K1622；批號(hào)00141145）；qPCR試劑 SuperRealPreMixPlus（withSYBRGreenI）（TIANGEN公司）（貨號(hào)cat#FP205-02；批號(hào)#M2029）。

1.3 儀 器 細(xì)胞培養(yǎng)箱3111型（Thermo公司），微量加樣器（Thermo公司），臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)H1650R（上海盧湘儀），熒光顯微鏡BX-43型（Olympus公司），超凈工作臺(tái)（蘇州凈化），渦旋振蕩儀QL-861型（海門市其林貝爾儀器制造有限公司），凝膠成像儀（Bio-RAD公司），酶標(biāo)儀SPECTRAmaxPlus384 （MolecularDevices公司），臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)H1650R（上海盧湘儀），電泳系統(tǒng)（Bio-RAD公司），OD值測(cè)量?jī)x器為MerintonSMA4000；定量PCR儀為CFXconnectReal-TimePCRSystem，配套分析軟件為BIO-RADCFXManager。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 心肌細(xì)胞原代培養(yǎng) 取40只乳鼠心臟，置于預(yù)冷的PBS中漂洗1遍；取心室，置于預(yù)冷的PBS中漂洗1遍；將心室剪碎至糊狀，預(yù)冷的PBS中漂洗1遍，置15mL離心管，1500rpm，5min。收集組織沉淀，加入0.1%胰酶10mL重懸，37℃水浴鍋中震蕩消化5min。劇烈震蕩30s，待組織自然沉降，小心吸棄消化液上清。向組織沉淀中加入新的0.1%胰酶5mL重懸，37℃水浴鍋中震蕩消化5～10min。劇烈震蕩30s，待組織自然沉降，小心吸取消化液上清（含消化下來的細(xì)胞）置于新的15mL離心管中，并加入5mL DMEM完全培養(yǎng)基終止消化。向管中剩余組織中加入新的0.1%胰酶5mL重懸，重復(fù)上述步驟8～10遍，至無明顯組織塊殘留。收集細(xì)胞懸液，200目過篩，收集懸液，1500rpm，5min，收集細(xì)胞沉淀，以DMEM完全培養(yǎng)重懸，接種于10cm培養(yǎng)皿中，37℃，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)2h，收集未貼壁細(xì)胞（差速貼壁，2h內(nèi)心肌成纖維細(xì)胞先貼壁，心肌細(xì)胞未貼壁）為心肌細(xì)胞，1500rpm，5min，收集心肌細(xì)胞沉淀，以DMEM完全培養(yǎng)重懸，接種于6孔板中，37℃，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)。

2.2 分 組 將培養(yǎng)48h后的心肌細(xì)胞進(jìn)行分組，空白對(duì)照組（不加任何藥物），AngII組（加入10～7mol/L的AngⅡ），各辛伐他汀治療組（10-7mol/L AngⅡ刺激48h后再分別加入小劑量（10-7mol/L）、中劑量（10-6mol/L）、大劑量（10-5mol/L）的辛伐他汀，各組加藥完畢后37℃，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)48h后分別對(duì)各組進(jìn)行ACE2基因和ACE2蛋白檢測(cè)。

2.3 ACE2基因的QPR檢測(cè) Trizol-離心柱法提取細(xì)胞總RNA搜集細(xì)胞樣本后，用1mL大小的針筒抽吸Trizol裂解液15～20次，剪切基因組DNA。按200μL氯仿/mL Trizol的比例加入氯仿，震蕩30s混勻，在12 000rpm條件下離心5min。將試管上層液吸至另一離心管中，加入無水乙醇約150μL，稍震蕩混勻，將上述溶液轉(zhuǎn)移至放置于2mL收集管內(nèi)的Gen-Clean柱中，放置室溫下2min，12 000rpm離心1min。去除廢液，加入450mL RPESolution后，室溫條件下12 000rpm離心30min。上述溶液離心后全部再次轉(zhuǎn)移到套放于2mL收集管內(nèi)的GenClean柱中，放置室溫下2min，12 000rpm再離心1min。去除廢液，將GenClean柱放回收集管，室溫10 000rpm，離心30min。將GenClean柱轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，Gen-Clean柱中央加入40μL EPC-H2O，放置于55～80℃條件下2min，室溫12000rpm離心1min。

2.4 逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn) 取2mLRNA溶液于MerintonS-MA4000檢測(cè)，觀察A260/A280、A260/A230比值及連續(xù)波長吸收峰，并計(jì)算RNA溶液濃度，判斷RNA提取質(zhì)量：A260/A280＞2.0且＜2.3，則可以滿足后續(xù)RT-qPCR所需，以相應(yīng)溶劑為對(duì)照（Blank）。把隨機(jī)引物1μL、總RNA11μL加入到EP管中（總共12μL），震蕩混勻，短暫離心，65℃溫度干浴5min。在冰上冷卻，短暫離心，再放回冰上。將5xReactionBuffer 4μL、RibolockTMRNaseInhibition（20U/μL）1μL、10mMdNTP （mix）2μL、RevertAidTMM-MmLvReverseTranscriptase 1μL加入EP管中至總體積20μL，混勻后25℃干浴5min，再42℃溫度下干浴1h，70℃溫度干浴5min終止反應(yīng)。

-20℃保存cDNA。進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。引物序列如下：Ratβ-ActinForward:5‘CCCATCTATGAGGGTTACGC3’，Ratβ-ActinReverse:5‘TTTAATGTCACGCACGATTTC3’，目標(biāo)基因的GenbankIDGeneID:81822;PCR產(chǎn)物大小為150bp。RatACEForward:5‘ACCTTACGAGCCTCCTGTCAC3’RatACEReverse:5‘CTGCGTTACTTTCTCCTTTGC3’目標(biāo)基因GenbankID為 GeneID:320668；PCR產(chǎn)物大小為：182bp。

2.5 Western blot檢測(cè)ACE2蛋白 收集各組細(xì)胞，每管中加入100μL Western及IP裂解液（使用前加入PMSF，終濃度1mM），使用手術(shù)剪剪碎組織塊，組織勻漿機(jī)處理，4℃、12 000rpm，10min，取上清液-80℃儲(chǔ)存，BCA法測(cè)定蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳制膠，上樣前樣品加入5×上樣緩沖液混勻，100℃環(huán)境中停留10min后冰浴中冷卻，各泳道上樣量約為80μg。將電泳緩沖液加入到電泳槽內(nèi)后，接通電源，90V條件下恒壓電泳至溴酚藍(lán)跑完濃縮膠層，分離膠120V恒壓電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)遷移至分離膠下緣時(shí)，關(guān)掉電源，停止電泳。將PVDF膜先放置甲醇中浸泡30s，然后放入轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡10min，再與濾紙、凝膠同時(shí)浸入電轉(zhuǎn)移緩沖液中。按照夾心法將海綿、濾紙、凝膠、PVDF膜、濾紙、海綿按序放好，除去氣泡，PVDF膜放置在陽極側(cè)，凝膠放置在陰極側(cè)，插進(jìn)電泳槽，將緩沖液倒入電泳槽，200mA條件下恒流轉(zhuǎn)移，據(jù)蛋白分子量，約1min/kd。再將PVDF膜放置于封閉液中，在搖床上搖動(dòng)，在室溫條件封閉過夜。取出PVDF膜，加入一抗后室溫條件下孵育2h，浸入1×TBST緩沖液中，放置搖床上反復(fù)洗滌3次后加入二抗（每次洗滌15min），在室溫?fù)u床上再次孵育1h，將PVDF膜浸于1×TBST緩沖液中，于搖床上再洗滌3次（每次15min），將PVDF放置保鮮膜上，取適量ECL試劑盒中等體積的A液和B液混合，混勻后加在膜的表面，移入凝膠成像分析儀中，化學(xué)光敏模式曝光顯影。照片以TIFF格式導(dǎo)出后在Image允軟件下分析各條帶光密度。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件分析統(tǒng)計(jì)，所收集的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 熒光定量PCR檢測(cè)ACE2基因表達(dá) 與空白對(duì)照組比較，AngⅡ組ACE2基因表達(dá)明顯減少（P＜0.05）；小劑量辛伐他汀治療組ACE2基因表達(dá)較AngⅡ組稍高但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），中、高劑量辛伐他汀治療組ACE2基因表達(dá)較AngII組和小劑量辛伐他汀治療組明顯增加（P＜0.05）。見表1。

表1 各組ACE2基因PCR檢測(cè)結(jié)果比較（±s）

表1 各組ACE2基因PCR檢測(cè)結(jié)果比較（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05；與AngⅡ組和AngⅡ+小劑量他汀組比較，△P＜0.05

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3.2 Western bolt檢測(cè)ACE-2蛋白表達(dá) 與空白對(duì)照組比較，AngⅡ組ACE2蛋白表達(dá)明顯減少（P＜0.05）；小劑量他汀治療組ACE2蛋白表達(dá)較AngⅡ組稍高但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），中、高劑量他汀治療組ACE2蛋白表達(dá)均高于AngⅡ組（P＜0.05）。見圖1。

4 討論

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）是2000年由Donoghue、Tipnis新發(fā)現(xiàn)的腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）新成員，是已知的第一個(gè)ACE同系物，ACE2 mRNA在人類的心臟、腎臟等72種組織中廣泛分布，它位于染色體Xp22（5）上，由18個(gè)外顯子組成。其編碼的蛋白含有805個(gè)氨基酸。對(duì)于其生物學(xué)作用目前已有較多研究，研究人員發(fā)現(xiàn)ACE2與ACE作用相反，對(duì)心血管系統(tǒng)有保護(hù)作用，在一些RAS激活過度的疾病中（如高血壓、心力衰竭、冠心?。〢CE2高表達(dá)對(duì)疾病的發(fā)生發(fā)展有明顯的抑制作用[4]。

ACE2的生理學(xué)功能主要體現(xiàn)在兩點(diǎn)[5]：（1）將Ang I轉(zhuǎn)化為Ang（1-9），后者再經(jīng)過ACE的作用變成Ang（1-7）；（2）將AngⅡ直接水解為Ang（1-7），該作用是前者的400倍。Ang（1-7）是一種心血管保護(hù)性多肽，它作用于其特異性受體mas，在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)因子水平上拮抗AngⅡ，其具有利鈉利尿、抗細(xì)胞凋亡和增殖以及舒張血管的效應(yīng)，其作用顯示了它是對(duì)抗血管緊張素Ⅱ的最強(qiáng)活性成分之一。在心力衰竭的病理過程中，RAS系統(tǒng)過度激活，AngⅡ水平也相應(yīng)增高，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡壞死增加，隨之心功能下降。研究發(fā)現(xiàn)心力衰竭時(shí)心臟組織ACE2 mRNA明顯增加，增加的ACE2多肽水解AngⅡ致Ang（1～7）水平也相應(yīng)增高，ACE2、Ang（1～7）兩者的增高可擴(kuò)張血管、降低血壓、并能阻止心力衰竭發(fā)展。在ACE2基因敲除模型中，研究者觀察到左心室變薄、收縮力下降（EF值下降），提示ACE2對(duì)心功能的調(diào)節(jié)起到重要作用[6]。研究[7]推測(cè)其機(jī)制可能與如下有關(guān)：（1）ACE2抑制了AngⅡ誘導(dǎo)的氧自由基的產(chǎn)生；（2）抑制了蛋白激酶C、c-Src、ERK-p38及Ang Ⅱ-ROS-NF-kB信號(hào)通路及上調(diào)PI3K-Akt信號(hào)通路。

圖1ACE-2蛋白表達(dá)

慢性心力衰竭患者心臟射血減少，腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)興奮，致AngⅡ分泌增加，心肌細(xì)胞損傷導(dǎo)致心衰加重。機(jī)制可能是AngⅡ作用于AT1受體激活磷脂酶C（PLC）、激活絲裂素活化蛋白激酶（Mitogen-ActivatedProteinKinase）[8-9]。他汀類藥物作為HMG-COA還原酶抑制劑，除了降低膽固醇，研究者對(duì)于其各種降脂外作用已經(jīng)有了廣泛而深入的研究，包括降低氧化應(yīng)激、改善內(nèi)皮功能等作用[10]。Dechend等[11]以西立伐他汀喂養(yǎng)人腎素血管緊張素轉(zhuǎn)基因小鼠4～7周，結(jié)果提示西立伐他汀喂養(yǎng)組死亡率明顯降低，小鼠血壓顯著降低，同時(shí)明顯減少了膠原、纖維蛋白的產(chǎn)生。

本研究觀察到辛伐他汀能使血管緊張素Ⅱ損傷的心肌細(xì)胞ACE2表達(dá)升高，其作用隨濃度升高而提高。推測(cè)ACE2可能在辛伐他汀保護(hù)AngII損傷心肌中起到重要作用，進(jìn)一步豐富了他汀類藥物的降脂外作用機(jī)制，為臨床正確應(yīng)用提供了理論依據(jù)。但其確切機(jī)制依然不十分清楚，尚需進(jìn)一步研究。

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（收稿：2015-04-12 修回：2015-10-18）

Effects of Simvastatin on ACE2 Cells in Rats with Angiotensin II Induced Myocardial Injury

NI Shimao1,允IANG Changhao1,CHEN Zhili1,LUO Gaojiang1,HUANG允ianying2,YANG允ian3.1 Department of Cardiology,Yiwu Central Hospital,Yiwu(322000),China;2 Department of Cardiology,the Second Hospital Affiliated to Wenzhou Medicine University,Wenzhou(325000),China;3 Department of Cardiology,the First Affiliated Hospital,Zhejiang University School of Medicine,Hangzhou(310000),China

ObjectiveTo investigate the effects of simvastatin on angiotensin converting enzyme 2（ACE2）cells in the process of angiotensin II（Ang II）induced myocardial injury in rats.MethodsMyocardial cells were cultured in vitro and pretreated with Ang II,then divided into AngII group,low-dose SIM+AngII group,mid-dose SIM+AngII group,and high-dose SIM+AngII group.Normal myocardial cells served as control group.Western Blot and PCR technique were used to detect expressions of ACE2 protein and gene in all groups.ResultsCompared with control group the ACE2 protein and gene expressions in AngII group decreased（0.21 vs 0.74,0.333±0.122 vs 1.000±0.149;P＜0.05）.Compared with AngII group,the expressions of ACE2 protein and gene in mid-dose SIM+ AngII group（0.45,0.644±0.135）and high-dose SIM+AngII group（0.61,0.952±0.090）significantly increased（all P＜0.05）,but those in low-dose SIM+AngII group slightly increased in the absence of significant difference（0.39, 0.399±0.054;P＞0.05）.The expressions of ACE2 protein and gene elevated with the increase of simvastatin concentration.ConclusionAngII decreases the expression of ACE2 protein and gene on myocardial cells.Simvastatin can inhibit this effect,by increasing the expression of ACE2 protein and gene on AngII-injued myocardial cells. This inhibition effect is in dose-dependent manner.

rats;myocardial cell injury;simvastatin;angiotensin II;angiotensin converting enzyme

浙江省義烏市科技計(jì)劃項(xiàng)目（NO.12-3-19）

1浙江省義烏市中心醫(yī)院心內(nèi)科（義烏 322000）；2溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科（溫州 325000）；3浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科（杭州 310000）

倪市毛，E-mail：nishimao@163.com