楊貞妮 楊桂清

(沈陽(yáng)感光化工研究院有限公司 遼寧 沈陽(yáng) 110141)

一種高效純化輔酶Q10的新工藝

楊貞妮 楊桂清

(沈陽(yáng)感光化工研究院有限公司 遼寧 沈陽(yáng) 110141)

通過(guò)兩次重結(jié)晶和一次硅膠柱層析純化精制輔酶Q10粗品，產(chǎn)品純度達(dá)到99.0％以上。實(shí)驗(yàn)討論了柱層析中高徑比、洗脫液的種類、配比對(duì)提純的影響；結(jié)果表明，最佳條件為高徑比為1.5:1、正己烷:異丙醚為7:1，得到的產(chǎn)品純度為99.3％，有望用于工業(yè)上。

輔酶Q10；純化精制；硅膠柱層析

1 引言

輔酶Q10（Coenzyme Q10）純品為黃色或橘黃色的晶體，熔點(diǎn)為48.0-52.0℃，易溶于正己烷、苯、氯仿，微溶于乙醇，不溶于水和甲醇等強(qiáng)極性有機(jī)溶劑，對(duì)光不穩(wěn)定易分解為微紅色的物質(zhì)，對(duì)濕度和溫度不敏感，較穩(wěn)定。輔酶Q10可存在牛肉、豆油、花生、鯖魚等食物及動(dòng)物的肝、腎組織中[1]。

輔酶Q10具有自由基清除、改善細(xì)胞內(nèi)呼吸、保護(hù)線粒體及增強(qiáng)免疫等功能。因此，輔酶Q10在醫(yī)藥和化妝品等行業(yè)有著廣泛而重要的應(yīng)用?？捎糜谛呐K病、高血壓、子癇、帕金森及酒精肝等疾病的輔助治療[2-6]；添加到化妝品中，淡化細(xì)紋，細(xì)膩肌膚，起到美容養(yǎng)顏的效果。因此，輔酶Q10深受廣大消費(fèi)者的青睞[7]。

輔酶Q10的生產(chǎn)多采用微生物發(fā)酵法，生產(chǎn)產(chǎn)量高。因此制約輔酶Q10工業(yè)化的主要因素是下游提取純化工藝?，F(xiàn)行的輔酶Q10的提純方法有∶活性氧化鋁柱層析、硅膠柱層析及大孔吸附樹(shù)脂法。這些方法存在以下問(wèn)題∶活性氧化鋁價(jià)格較高使其工業(yè)化應(yīng)用成本上升；硅膠柱層析次數(shù)較多且硅膠重復(fù)利用率低，導(dǎo)致工業(yè)操作復(fù)雜，使后續(xù)成本增加。大孔吸附樹(shù)脂法較為先進(jìn)，目前僅適合處于實(shí)驗(yàn)室小試階段。

本文以純度為50％-60％的輔酶Q10粗提物（外標(biāo)法測(cè)）為原料，通過(guò)兩次重結(jié)晶和一次硅膠柱層析精制后，產(chǎn)品純度達(dá)到99％以上；探討了柱層析過(guò)程中洗脫液的種類、配比等條件對(duì)提純效果的影響。

2 實(shí)驗(yàn)

2.1 材料與儀器

正丁醇（AR）正己烷（AR）異丙醚（AR）400目層析硅膠（青島海洋化工有限公司）Q10粗品；純度為50％-60％的Q10粗品由神州生物科技有限公司提供。

Agilent 1100 型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；層析柱φ5 cm× 20cm（玻璃）；

2.2 HPLC檢驗(yàn)方法

色譜柱∶SB-C18; φ4.6mm×150mm（Agilent公司生產(chǎn)）；檢測(cè)波長(zhǎng)275nm；柱溫∶30℃；流動(dòng)相∶甲醇∶乙醇=65∶35（V/V）；流速∶1mL/ min；進(jìn)樣∶2μL；停止時(shí)間∶18min；Q10的保留時(shí)間∶14min。

分析方法∶在上述的色譜條件下,依次進(jìn)Q10標(biāo)準(zhǔn)品、樣品的接收液各2μL，平行進(jìn)樣兩次，用外標(biāo)法進(jìn)行定量。

2.3 輔酶Q10粗品的純化

2.3.1 重結(jié)晶提純粗品

稱取20g含量為57％的Q10粗品（外標(biāo)法測(cè)定）置于250ml四口瓶中，加入一定量的正丁醇，慢攪拌加熱至45℃，固體全部溶解，然后加入少量晶種降溫使其慢慢析出晶體；當(dāng)溫度自然降至24℃-25℃時(shí)有晶體析出，自然放置一夜后干燥即可得到Q10一晶。利用同樣的方法，提純Q10一晶得到Q10二晶，純度為95％左右。

2.3.2 硅膠柱層析提純輔酶Q10二晶

1) 稱取硅膠45g，將其裝入直徑為5cm的玻璃柱中，壓實(shí)后放置一宿自然沉降后柱高為7.5cm，次日上樣。

2) 采用濕法上樣。將5gQ10二晶樣品（純度為95％）置于少量展開(kāi)劑中，利用磁力攪拌器使其充分溶解；樣品溶解后，再用膠頭滴管將溶液沿著層析柱內(nèi)壁慢慢加入。

3) 采用正己烷∶異丙醚為7∶1的混合溶液洗脫輔酶Q10，控制流出液的流速為90d/min，每15 mL接收一次流出的洗脫液；根據(jù)薄層檢驗(yàn)結(jié)果分段合并流出液，然后將其干燥，取出Q10粉體待測(cè)。

4) 對(duì)通過(guò)硅膠柱層析分離過(guò)的輔酶Q10流份進(jìn)行液相色譜分析（歸一化百分率法），即得99％以上的純品。將其中雜質(zhì)含量與二晶樣品雜質(zhì)含量對(duì)比，發(fā)現(xiàn)保留時(shí)間為9.00min的雜質(zhì)大幅度減少；保留時(shí)間為10.11min和11.58min雜質(zhì)完全消失，特別是11.58min雜質(zhì)與12.30minQ10極性特別相近，重結(jié)晶方法無(wú)法除去，利用硅膠柱層析可以完全除去，因而使樣品純度大大提高。

2.3.3 洗脫液的種類對(duì)提純的影響

取400目硅膠（處理過(guò)的）3份，每份45g，分別裝入3個(gè)尺寸相同的層析柱中，用不同種類的洗脫液對(duì)同一純度的Q10二晶樣品進(jìn)行純化，將所得的樣品烘干后利用HPLC測(cè)純度（外標(biāo)法），并計(jì)算樣品收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3.4 洗脫液的配比對(duì)提純的影響

取400目硅膠（處理過(guò)的）4份，每份45g，分別裝入4個(gè)尺寸相同的層析柱中，用不同配比的洗脫液對(duì)同一純度Q10二晶樣品進(jìn)行純化，將所得的樣品烘干后利用HPLC測(cè)純度（外標(biāo)法），并計(jì)算樣品收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同配比洗脫液下的輔酶Q10提純情況Purification of Coenzyme Q10in differentproportion of the elution liquid

2.3.5 不同高徑比對(duì)提純的影響

取400目硅膠(處理過(guò)的)5份，每份45g，分別裝入5個(gè)直徑不同的層析柱中，裝實(shí)層析柱后測(cè)量柱子的高度，計(jì)算出柱子的高徑比；用配比為7∶1的洗脫液對(duì)同一純度Q10二晶樣品進(jìn)行提純，測(cè)量樣品的純度（外標(biāo)法），并計(jì)算洗脫液消耗量及樣品收率。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同高徑比下的輔酶Q10提純情況Purification of Coenzyme Q10in differentheight-diameter ratio

3 結(jié)果與討論

3.1 洗脫液的選擇

我們采用了不同種類的溶劑配成洗脫液對(duì)樣品進(jìn)行提純，根據(jù)表1的結(jié)果可看出正己烷和異丙醚混合作為洗脫液的提純效果明顯優(yōu)于其它兩種洗脫液，可以將Q10純度從95％提高至99.3％，樣品重量收率為82％，均為三種洗脫液中最高。因此，洗脫液的最佳選擇為正己烷和異丙醚混合。

3.2 洗脫液配比對(duì)分離效果的影響

我們采用了不同極性的洗脫液對(duì)樣品進(jìn)行分離，根據(jù)表2的結(jié)果可得出，洗脫液的最佳配比為正己烷∶異丙醚=7∶1（V/V）。洗脫液極性過(guò)大或過(guò)小都不利于分離，使過(guò)多的雜質(zhì)與輔酶Q10共流出，降低了輔酶Q10的純度。

3.3 柱高徑比對(duì)分離效果的影響

我們選擇了5種不同高徑比的層析柱對(duì)樣品進(jìn)行提純，根據(jù)表3的結(jié)果可得出，當(dāng)高徑比為1.5∶1時(shí)，洗脫液的用量大大降低了，單耗為182ml/g，同時(shí)樣品的純度和收率均為最高，分別為99.19％和89％。因此，柱高與柱徑的最佳比為1.5∶1，可以大大節(jié)約洗脫液的消耗，利于該工藝工業(yè)化時(shí)降低能耗，節(jié)約成本。

4 結(jié)論

硅膠柱層析方法可以將輔酶Q10二晶樣品進(jìn)一步提純，達(dá)到99％以上。洗脫液選用正己烷與異丙醚混合，最佳配比為7∶1，層析柱高徑比最佳為1.5∶1，可以將樣品提純到99％以上，樣品的提純效果最佳，同時(shí)又降低了洗脫液的消耗。本文總工藝為兩次重結(jié)晶和一次硅膠柱層析提純輔酶Q10粗品，所得產(chǎn)品純度較高，工藝操作簡(jiǎn)便，硅膠使用量小，有利于環(huán)保，適合于工業(yè)化。

[1]張鴻，吳玉荷。148類維生素物質(zhì)——輔酶Q10的研究進(jìn)展[J]。國(guó)外醫(yī)學(xué)衛(wèi)生學(xué)分冊(cè)，2002，29(6): 370-373.

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AEfficientPurification Process of Coenzyme Q10YANG Zhen-ni YANG Gui-qing

(Shenyang and research institute of the photographic materials & chemical industry,Shenyang 110141China)

Coenzyme Q10 crude product was purified by two recrystallization and a silica gel chromatography，product purity was more than 99.0 ％.Height-diameter radio、eluent species and ratio were discussed for the impact on the purification by testing; The results showed the optimum condition were height-diameter radio of 1.5:1、n-hexane: isopropyl ether of 7:1，the purity of product was 99.3％，It is expected to be used in industry.

Coenzyme Q10; Purification; Silica gel chromatography

TQ46

A

1009-5624-（2016）01-0029-03