蘭亞莉

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002)

鄭州市寵物源大腸桿菌生物被膜表型與耐藥譜型分析

蘭亞莉

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002)

為分析鄭州市寵物源大腸桿菌的生物被膜表型與耐藥譜型，分別采用微量肉湯稀釋法和改良結(jié)晶紫法對194株寵物源大腸桿菌進(jìn)行耐藥率和生物被膜形成能力檢測。結(jié)果表明，弱生物被膜表型菌株比例最高，占63.4%；耐藥譜多樣性是造成生物被膜形成能力差異的主要原因，但耐藥譜中抗菌藥物種類對生物被膜表型能力的影響不明顯。

大腸桿菌； 生物被膜表型； 耐藥譜型

大腸桿菌是人和動物的主要共生菌之一，抗原性復(fù)雜，血清型多樣，已經(jīng)成為寵物最主要的感染病原，其造成的感染分為腸道感染和腸道外感染，大腸桿菌腸道外感染引起的疾病臨床癥狀和病理變化多樣，如尿道感染、腹膜炎、傷口感染、肺炎、敗血癥等。隨著廣譜抗生素的廣泛應(yīng)用，甚至是濫用，大腸桿菌的耐藥現(xiàn)象呈逐年加重趨勢，給臨床大腸桿菌感染疾病的治療帶來了很大困難，導(dǎo)致感染持續(xù)發(fā)展。在獸醫(yī)臨床領(lǐng)域，越來越多的感染如手術(shù)感染、呼吸系統(tǒng)感染和泌尿生殖系統(tǒng)感染都與生物被膜的形成有關(guān)。Fletcher等[1]研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌能夠形成生物被膜，使得大腸桿菌能夠利用自身分泌的多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂蛋白等多糖蛋白的復(fù)合物，使其相互粘連并將其自身克隆聚集纏繞其中，以對抗不利的環(huán)境，逃避抗生素的殺死或機(jī)體免疫系統(tǒng)的清除作用，從而造成機(jī)體的持續(xù)性感染[2-3]。本試驗(yàn)通過藥物敏感性試驗(yàn)和生物被膜形成能力分析，探討寵物源性大腸桿菌的耐藥性及其與生物被膜形成的相關(guān)性，為獸醫(yī)臨床正確選擇和使用抗菌藥物提供參考和指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 樣本來源、培養(yǎng)基和抗菌藥物

215個試驗(yàn)樣本于2013年1月—2014年6月期間采自鄭州市3家動物醫(yī)院就診的犬只(其中包括肛門拭子145個、尿液樣本63個和鼻咽拭子7個)。 質(zhì)控大腸桿菌菌株ACTT25922為西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院獸醫(yī)藥理實(shí)驗(yàn)室保存。MH肉湯、LB肉湯、15e腸桿菌科細(xì)菌生化編碼鑒定管均購自杭州天和微生物試劑有限公司，試驗(yàn)中使用的抗菌藥物購自中國獸藥監(jiān)察所。

1.2 方法

1.2.1 樣本分離培養(yǎng)及鑒定 按照常規(guī)大腸桿菌分離方法對臨床采集的215個樣本進(jìn)行大腸桿菌的分離、培養(yǎng)和生化鑒定。

1.2.2 藥敏試驗(yàn) 按照美國臨床試驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法操作程序進(jìn)行[4]。

1.2.2.1 抗菌藥物的配制 根據(jù)CLSI推薦的微量肉湯稀釋法中抗菌藥物的配制方法進(jìn)行，試驗(yàn)前根據(jù)各抗菌藥物的理化性質(zhì)將其配置成母液質(zhì)量濃度均為工作質(zhì)量濃度的10倍備用(其中恩諾沙星、頭孢噻呋母液質(zhì)量濃度為640 μg/mL，阿莫西林、多西環(huán)素、氟苯尼考、鏈霉素、卡那霉素、氨芐西林的母液質(zhì)量濃度為5 120 μg/mL，阿米卡星、安普霉素、慶大霉素、新霉素的母液濃度為5 120 U/mL)。

1.2.2.2 菌液的制備 將已純化并鑒定的大腸桿菌在麥康凱瓊脂平板上劃線，培養(yǎng)12～16 h后，挑取3～5個相同的單菌落接種于3 mL LB肉湯，37 ℃靜止培養(yǎng)過夜后，將菌液調(diào)到0.5麥?zhǔn)媳葷岫?，備用?/p>

1.2.2.3 藥敏試驗(yàn) 用多通道移液槍將滅菌MH肉湯加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，除第1列每孔180 μL，其余各孔100 μL，然后將配制好的抗菌藥工作液分別加入第1列的各孔，每孔20 μL，之后反復(fù)吹打，混勻藥物后取100 μL移至第2列，依次稀釋至第11列，這樣每列的藥物分別依次進(jìn)行2倍稀釋，第12列為陽性對照，每種藥物做3個重復(fù)。將濃度相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)媳葷岫鹊木鷳乙?，?jīng)MH肉湯1∶1 000稀釋后向每孔加100 μL。密封后置于恒溫培養(yǎng)箱中，37 ℃孵育12～16 h后判斷結(jié)果。

1.2.2.4 結(jié)果判定 當(dāng)陽性對照孔(不含抗生素)內(nèi)細(xì)菌明顯生長，以不出現(xiàn)渾濁孔所對應(yīng)的最低藥物質(zhì)量濃度作為該藥物的最小抑菌濃度(MIC)。

1.2.3 大腸桿菌生物被膜形成能力半定量分析 參照文獻(xiàn)[4-7]的步驟略作改進(jìn)，具體操作步驟如下：首先在無菌96孔平底組織培養(yǎng)板中加入200 μL經(jīng)1∶100稀釋的菌液，陰性對照加入相應(yīng)量的TB肉湯。平板蓋蓋子后37 ℃培養(yǎng)24 h，之后棄去每孔內(nèi)培養(yǎng)液，分別用250 μL滅菌PBS溶液漂洗3次。在洗滌過程中要劇烈甩動以徹底棄去孔內(nèi)未粘附的浮游菌，孔壁上粘附的細(xì)菌用200 μL 99%甲醇固定15 min后棄去，室溫自然風(fēng)干。然后用200 μL 2%結(jié)晶紫染色5 min后棄去，將96孔微量培養(yǎng)板在流動的自來水下沖洗掉多余的染料。自然風(fēng)干過夜，結(jié)合在孔內(nèi)的染料用160 μL 33%冰乙酸溶解，用酶標(biāo)儀測定各孔的OD570值。每株細(xì)菌接種4孔，所有的菌株進(jìn)行3次重復(fù)并取其平均值作為最終的試驗(yàn)結(jié)果。根據(jù)OD570值的不同將生物被膜表型分為4組：OD570≤1ODC，無成膜能力(-)；1ODC4ODC，強(qiáng)成膜能力(+++)，其中界定值ODC為陰性對照孔的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離鑒定結(jié)果

采集的樣本經(jīng)過分離、純化培養(yǎng)和生化鑒定，共分離出大腸桿菌194株，其中腸源145株，鼻咽源7株，尿道源42株。

2.2 分離菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

從圖1可以看出，分離菌株對恩諾沙星、氟苯尼考、阿莫西林、氨芐西林、多西環(huán)素的耐藥比例均超過70%，其中對氨芐西林耐藥的占90.21%；對安普霉素、阿米卡星、慶大霉素、頭孢噻呋耐藥水平較低，分別占23.71%、21.13%、7.73%、36.08%。對鏈霉素、新霉素、卡那霉素耐藥水平居中，分別占57.73%、41.75%、56.19%。

圖1 分離大腸桿菌對試驗(yàn)藥物的敏感性

2.3 不同來源大腸桿菌成膜能力分析

194株大腸桿菌生物被膜表型分析結(jié)果如表1所示。從表1可以看出，除了3株尿道源大腸桿菌表現(xiàn)出強(qiáng)生物被膜形成能力外，其他大腸桿菌主要呈現(xiàn)弱生物被膜表型，且在腸源大腸桿菌中，弱生物被膜表型菌株比例最高，占71.0%。而在腸源和鼻咽源分離的大腸桿菌中，沒有表現(xiàn)出強(qiáng)生物被膜形成能力的菌株。

表1 不同來源大腸桿菌生物被膜形成能力

注：括號外為菌株數(shù)，括號內(nèi)為百分比。

2.4 耐藥譜分布與成膜能力表型相關(guān)性分析

強(qiáng)成膜能力組3株菌的耐藥譜是4耐、7耐、9耐；中等成膜能力組的28株大腸桿菌耐藥譜主要分布在7～10耐，7、8、9、10耐分別占中等成膜能力表型的17.86%、21.43%、14.29%、17.86%，共占71.43%；弱成膜能力組123株大腸桿菌耐藥譜主要分布在5～10耐，5、6、7、8、9、10 耐藥譜菌株分別占弱成膜能力表型的13.82%、13.01%、14.63%、12.20%、14.63%、13.82%，共占82.11%；無成膜能力組的40株大腸桿菌耐藥譜主要分布在5～9耐，5、6、7、8、9耐藥譜占無成膜能力表型的比例均在15%及以下，共占60.00%。

此外，本研究結(jié)果顯示，強(qiáng)成膜能力菌株數(shù)的耐藥譜比較分散，另外3個成膜表型的菌株耐藥譜主要集中在5～10耐，其中，弱成膜能力和無成膜能力耐藥譜型的菌株所占比例均不超過15%?？梢?，耐藥譜多樣性是造成生物被膜形成能力差異的主要原因，但耐藥譜中抗菌藥物種類對生物被膜表型能力的影響不明顯。

表2 不同生物被膜形成能力大腸桿菌的耐藥譜型分析 株

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果初步反映了寵物治療過程中大腸桿菌的耐藥現(xiàn)象。大腸桿菌已經(jīng)成為動物尿道炎性疾病的主要病原，而泌尿道感染也是進(jìn)一步形成尿道結(jié)石的主要誘因[8-10]。在本研究采集的尿道炎癥疾病的63個寵物尿樣中，42例分離到大腸桿菌，占66.7%，應(yīng)該引起臨床重視。同時，在臨床診療的過程中借助藥敏試驗(yàn)篩選出敏感藥物，可增加疾病的治愈率。試驗(yàn)結(jié)果表明，在采集樣本的3家寵物醫(yī)院，由于長期使用常用抗菌藥物，使得70%以上分離的大腸桿菌對恩諾沙星、阿莫西林、氨芐西林等耐藥，特別是對氨芐西林的耐藥比例高達(dá)90.21%，提示在今后治療大腸桿菌感染的過程中應(yīng)避免使用耐藥率較高的藥物，盡量使用敏感藥物，以提高治療效果[11-13]。本研究結(jié)果表明，中等、弱、無成膜能力表型的大腸桿菌的耐藥譜型數(shù)量無明顯差異，耐藥譜多樣性可能是造成生物被膜形成能力差異的主要原因，但耐藥譜中抗菌藥物種類對生物被膜的表型能力的影響不明顯。

[1] Fletcher M.The physiological activity of bacteria attached to solid surfaces[J].Adv Microbiol Physiology,1991,32(6):53-85.

[2] Patel R.Biofilms and antimicrobial resistance[J].Clin Orthop Relat Res,2005,437:41-47.

[3] Naves P,Delprado G,Hueives L,etal.Correlation between virulence factors andinvitrobiofilm formation byEscherichiacolistrains [J].Microb Pathog,2008,45:86-91.

[4] 陳國強(qiáng),曹華英,姚振國,等.重癥監(jiān)護(hù)病房鮑氏不動桿菌的耐藥性調(diào)查[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2011,21 (4):794-795.

[5] Stepanovic S,Cirkovic I,Ranin L,etal.Biofilm formation bySalmonellaspp.andListeriamonocytogeneson plastic surface[J].Letters Applied Microb,2004,38(5):428-432.

[6] 陳朝喜,廖曉平,朱恒乾,等.百余株寵物源性大腸桿菌的生物被膜表型與耐藥譜型分析[J].中國獸醫(yī)科學(xué),2010,40(9):886-889.

[7] 陳朝喜,朱恒乾,廖曉萍,等.大腸埃希菌耐藥譜型、基因型和生物膜表型關(guān)系研究[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2011,32(4):59-62.

[8] Stewart P S.Antimicrobial tolerance in biofilms[J].Microbiol Spectr,2015,3(3).Doi:10.1128/microbiolspec.

[9] Cao B,Christophersen L,Thomsen K,etal.Antibiotic penetration and bacterial killing in aPseudomonasaeruginosabiofilm model[J].Antimicrob Chemother,2015,70(7):2057-2063.

[10] Araújo PA,Mergulh?o F,Melo L,etal.The ability of an antimicrobial agent to penetrate a biofilm is not correlated with its killing or removal efficiency[J].Biofouling,2014,30(6):675-683.

[11] Lebeaux D,Ghigo J M,Beloin C.Biofilm-related infections:Bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics[J].Microbiol Mol Biol Rev,2014,78(3):510-543.

[12] Vrany J D,Stewart P S,Suci P A.Comparison of recalcitrance to ciprofloxacin and levofloxacin exhibited byPseudomonasaeruginosabiofilms displaying rapid-transport characteristics[J].Antimicrob Agents Chemother,1997,41(6):1352-1358.

[13] Nikaido H.Multiple antibiotic resistance and efflux[J].Curr Opin Microbiol,1998,1(5):516-523.

Study on Biofilm Phenotype and Drug Resistance Pattern in Pet-broneE.coliin Zhengzhou

LAN Yali

(Insititute of Animal Husbandry and Veterinary Research,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China)

To study biofilm phenotype and drug resistance pattern in pet-broneE.coliin Zhengzhou,broth microdilution method and improved crystal violet method were used for antimicrobial agent susceptibility testing and biofilm-forming detection of 194 clinicalE.coliisolates.The results showed that the percentage of weak biofilm-forming ability strains was the highest,accounting for 63.4% and the diversity of drug resistance patterns was the key factor affecting biofilm-forming ability,while it was not so dramatic significant for biofilm-forming ability based on the antibiotic types in different drug resistance patterns.

E.coli; biofilm phenotype; drug resistance pattern

2015-08-20

河南省財(cái)政預(yù)算項(xiàng)目(20137919)

蘭亞莉(1966-)，女，陜西蒲城人，研究員，本科，主要從事寵物源人獸共患細(xì)菌病研究。 E-mail:yali2005haonan@sina.com

S855.1

A

1004-3268(2016)01-0135-03