毛福超，郁 川，韓 璐，韓于佩，劉文慧，劉 靜

(河南科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院 動(dòng)物疫病與公共安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 洛陽(yáng) 471003)

豫西地區(qū)禽源大腸桿菌的分離鑒定與耐藥性分析

毛福超，郁 川*，韓 璐，韓于佩，劉文慧，劉 靜

(河南科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院 動(dòng)物疫病與公共安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 洛陽(yáng) 471003)

為了解豫西地區(qū)禽源大腸桿菌的耐藥情況，從豫西地區(qū)養(yǎng)雞場(chǎng)采集130份疑似大腸桿菌病料樣品，按常規(guī)方法分離細(xì)菌，對(duì)分離菌株進(jìn)行生化試驗(yàn)、PCR鑒定、血清型鑒定及藥敏試驗(yàn)。結(jié)果顯示，共分離鑒定出98株雞源大腸桿菌，確定86株細(xì)菌分屬14個(gè)血清型，其中以O(shè)14、O141、O78、O88血清型為主，分別占分離菌株的20.93%、16.28%、13.95%、9.30%。利用K-B 法藥敏試驗(yàn)檢測(cè)大腸桿菌對(duì)20種抗生素的耐藥性，結(jié)果表明，分離菌對(duì)復(fù)方新諾明的耐藥性最高(95.92%)，其次為四環(huán)素(83.67%)、氨芐西林(81.63%)、萘啶酸(77.55%)、恩諾沙星(69.39%)，對(duì)亞胺培南和多黏菌素B敏感。大部分菌株具有多重耐藥性，耐藥種類最多的菌株對(duì)18種抗生素耐藥，9～14重耐藥菌株有76株，占77.55%。可見，豫西地區(qū)禽源大腸桿菌耐藥現(xiàn)象十分嚴(yán)重，嚴(yán)重影響了禽類大腸桿菌病的防治。

大腸桿菌； 分離鑒定； 藥敏試驗(yàn)； 耐藥性分析

禽大腸桿菌病是由某些血清型大腸埃希氏桿菌引起的一類疾病的總稱[1-5]。禽大腸桿菌血清型復(fù)雜，常與多種細(xì)菌或病毒混合感染，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)危害嚴(yán)重[6-7]。近年來(lái)，禽大腸桿菌病已成為養(yǎng)雞業(yè)生產(chǎn)中主要細(xì)菌性疾病之一，發(fā)病率和死亡率居高不下，給養(yǎng)雞業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。臨床上抗生素的濫用，不僅造成藥物殘留和畜產(chǎn)品品質(zhì)下降，而且導(dǎo)致大腸桿菌耐藥菌株不斷增加和耐藥譜擴(kuò)大[8]。此外，耐藥大腸桿菌能以人類和動(dòng)物相重疊的共生菌為載體，轉(zhuǎn)移抗生素耐藥性基因，威脅著人類的健康[9]。豫西地區(qū)(洛陽(yáng)、三門峽、平頂山等地區(qū))是河南省家禽主要養(yǎng)殖區(qū)之一，但目前對(duì)該區(qū)域禽大腸桿菌病流行病學(xué)研究較少。為此，本研究對(duì)該區(qū)域部分養(yǎng)雞場(chǎng)進(jìn)行了大腸桿菌的病原分離鑒定及藥物敏感性試驗(yàn)，以期了解該病的流行情況，旨在為指導(dǎo)臨床用藥、制定科學(xué)的防治措施提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣品來(lái)源

2014年于豫西地區(qū)規(guī)?；u場(chǎng)采集疑似大腸桿菌感染的病死雞肝臟和脾臟等臟器，共130份樣品。

1.2 主要菌株、試劑和培養(yǎng)基

大腸埃希氏菌ATCC2592、大腸桿菌的標(biāo)準(zhǔn)O血清均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。氨芐西林、氯霉素、復(fù)方新諾明、多黏菌素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、萘啶酸、恩諾沙星、諾氟沙星、四環(huán)素、慶大霉素、卡那霉素、阿米卡星、鏈霉素、安曲南、亞胺培南、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢他啶、阿莫西林20種藥敏紙片及各種生化試劑購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂、革蘭氏染色液及微量生化試驗(yàn)管及試劑購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.3 禽源大腸桿菌的分離鑒定

1.3.1 細(xì)菌的分離純化 無(wú)菌采取病死雞的病料，接種于肉湯培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，然后劃線接種于麥康凱培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，然后挑取單個(gè)紅色、光滑菌落劃線接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18～24 h。按常規(guī)方法涂片、革蘭氏染色、鏡檢，觀察菌落的形態(tài)特征。挑取單菌落劃線接種于伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基平板上，于37 ℃培養(yǎng)18～24 h，再挑取紫黑色帶金屬光澤的單菌落接種于普通肉湯，37 ℃培養(yǎng)18～24 h后，取菌落涂片、染色、鏡檢。確認(rèn)純培養(yǎng)物后，置于4 ℃冰箱保存[10]。

1.3.2 PCR鑒定 將分離純化后的菌株按照煮沸法制備細(xì)菌DNA模板，以大腸桿菌phoA基因的特異性引物進(jìn)行PCR鑒定[11]。引物序列為F： 5′-GATAAGCCCGCAGTCACCT-3′；R：5′-TCCCGTAACTCATCACCATCA-3′。擴(kuò)增片段大小約為370 bp，引物由華大基因公司合成。

1.3.3 生化試驗(yàn) 按照參考文獻(xiàn)[12]的方法進(jìn)行細(xì)菌的糖類發(fā)酵試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、MR 試驗(yàn)、VP 試驗(yàn)、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)和三糖鐵試驗(yàn)。

1.4 血清型鑒定

采用玻板凝集反應(yīng)對(duì)分離株進(jìn)行血清型鑒定[13]。取分離純化后的菌液和大腸桿菌單因子血清各10 μL 在玻板上混勻，30 s內(nèi)出現(xiàn)明顯凝集者為陽(yáng)性反應(yīng)。同時(shí)以菌液與0.5%石炭酸生理鹽水混合物作對(duì)照，觀察有無(wú)自凝現(xiàn)象。

1.5 藥敏試驗(yàn)

以大腸埃希氏菌ATCC25922為藥敏質(zhì)控菌株，參照K-B紙片擴(kuò)散法[14]，用無(wú)菌的棉簽蘸取雞大腸桿菌的肉湯培養(yǎng)物，均勻涂布到LB平板的表面。再將藥敏紙片貼到LB瓊脂平板的表面，37 ℃培養(yǎng)18 h 后，測(cè)量抑菌圈的大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌分離鑒定結(jié)果

共分離到98株大腸桿菌疑似菌株。分離菌株能夠分解乳糖、甘露醇、葡萄糖和麥芽糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，絕大部分能分解阿拉伯糖，部分能分解蔗糖，VP試驗(yàn)陰性，MR試驗(yàn)陽(yáng)性，硫化氰試驗(yàn)陰性，枸櫞酸鹽試驗(yàn)陰性，吲哚試驗(yàn)陽(yáng)性，三糖鐵瓊脂由紅色變黃色，底部沒有黑色沉淀出現(xiàn)，符合大腸桿菌的生化特征。經(jīng)大腸桿菌特異性引物PCR 鑒定，能擴(kuò)增到約372 bp大小的條帶。綜上，分離菌株均判定為大腸桿菌。

2.2 大腸桿菌血清型鑒定結(jié)果

對(duì)分離的98株雞源大腸桿菌菌株進(jìn)行O 因子血清鑒定，共鑒定出86株分離株的血清型，分屬于 14個(gè)血清型(表1)， 分別為：O14、O141、O78、O88、O157、O8、O147、O74、O149、O2、O1、O15、O111、O115，另外有12株因未出現(xiàn)玻板凝集反應(yīng)或自凝而未能定型。血清型鑒定結(jié)果表明，優(yōu)勢(shì)血清型為O14、O141、O78、O88，這4種血清型菌株合計(jì)52株，占血清型定型菌株的60.47%，其次為O157、O8、O147、O74、O149，其他血清型菌株數(shù)量較少。

表1 98株禽源大腸桿菌的14種血清型分布

注：括號(hào)內(nèi)為占血清型定型菌株的百分比。

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

由表2可以看出，98株大腸桿菌分離株對(duì)20種抗生素呈現(xiàn)不同程度的耐藥，其耐藥率介于2.04～95.92%。其中，對(duì)復(fù)方新諾明的耐藥性最高(95.92%)，其次為四環(huán)素(83.67%)、氨芐西林(81.63%)、萘啶酸(77.55%)、恩諾沙星(69.39%)，對(duì)亞胺培南和多黏菌素B敏感性較高。對(duì)多年來(lái)一直被推薦治療大腸桿菌病的氨芐西林、阿莫西林、四環(huán)素、氯霉素和復(fù)方新諾明抗生素的耐藥率為59.18%～95.92%。同時(shí)，大腸桿菌對(duì)同一類藥物中不同藥物的耐藥性也存在較大的差異。在頭孢類藥物中，耐藥率依次為頭孢曲松(63.26%)、頭孢他啶(51.02%)、頭孢噻肟(40.82%)。在喹諾酮類藥物中，耐藥率依次為萘啶酸(77.55%)、恩諾沙星(69.39%)、環(huán)丙沙星(55.10%)、諾氟沙星(44.89%)、氧氟沙星(38.78%)。可見，大腸桿菌對(duì)7類抗生素藥物的耐藥性存在一定的差異，對(duì)新型β-內(nèi)酰胺類藥物亞胺培南及多黏菌素B有著較高的敏感性，對(duì)磺胺類、常用β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、喹諾酮類和氯霉素類均有較高耐藥性。

表2 98株禽源大腸桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.4 耐藥譜分析結(jié)果

對(duì)分離的98株大腸桿菌的耐藥性分析發(fā)現(xiàn)，大部分菌株均以多重耐藥為主，最高可對(duì)18種抗生素耐藥[有2株(2.04%)]，耐藥9～14種的菌株最多，有76株(77.55%)， 對(duì)1～4種抗生素耐藥的菌株有6株(6.12%)，對(duì)5～8種抗生素耐藥的菌株有8株(8.16%)，對(duì)9～12種抗生素耐藥菌株有50株(51.02%)，對(duì)13～16種抗生素耐藥菌株有32株(32.65%)。

3 結(jié)論與討論

本研究對(duì)豫西地區(qū)禽源大腸桿菌進(jìn)行分離鑒定及藥敏試驗(yàn)，初步了解了豫西地區(qū)的禽大腸桿菌病的流行狀況及大腸桿菌的耐藥情況。分離到98株禽源大腸桿菌菌株，共鑒定出86株分離株的血清型(14種)，優(yōu)勢(shì)血清型為O14、O141、O78、O88，占定型菌株的60.47%，其次為O157、O8、O147、O74、O149。白靜等[15]報(bào)道的河南省禽源大腸桿菌優(yōu)勢(shì)血清型O78、O1、O2等；盧曉輝等[16]報(bào)道，河南省禽源大腸桿菌主要血清型為O141、O147、O149、O88、O78；劉遠(yuǎn)升等[17]報(bào)道，周口地區(qū)禽源大腸桿菌主要血清型為O1、O2、O20、O45、O78、O138。本研究試驗(yàn)結(jié)果與白靜等[15]、盧曉輝等[16]報(bào)道的主要優(yōu)勢(shì)血清型結(jié)果不一致。由此可見，河南省大腸桿菌血清型比較復(fù)雜，且各地血清型種類存在差異，不同年份的流行菌株血清型不一致。因此，需要對(duì)大腸桿菌的流行情況和流行特征所產(chǎn)生的影響進(jìn)行長(zhǎng)期而深入的監(jiān)測(cè)研究。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，豫西地區(qū)臨床分離的禽源大腸桿菌存在嚴(yán)重的耐藥問題，且表現(xiàn)為普遍的交叉耐藥和多重耐藥。對(duì)多年來(lái)一直被推薦治療大腸桿菌病的氨芐西林、阿莫西林、四環(huán)素、氯霉素和復(fù)方新諾明等抗生素耐藥率為59.18%～95.92%，這與汪洋等[18]報(bào)道的洛陽(yáng)地區(qū)雞源大腸桿菌的耐藥性結(jié)果基本一致。其中，復(fù)方新諾明、四環(huán)素、氨芐西林、萘啶酸、恩諾沙星對(duì)大部分大腸桿菌分離株基本已失去防治作用。這可能是由于這些抗生素價(jià)格低廉，抗菌譜廣，養(yǎng)殖戶長(zhǎng)期大量使用這些藥物進(jìn)行預(yù)防和治療，造成了對(duì)此類藥物的廣泛耐藥。對(duì)亞胺培南和多黏菌素B有著較高的敏感性，主要是由于這類藥物為近年來(lái)新研制藥物，且價(jià)格較高，在獸醫(yī)領(lǐng)域較少使用。

分離菌株多重耐藥性嚴(yán)重，最多的耐18種抗生素，對(duì)9～14種抗生素耐藥的菌株最多，占77.55%。導(dǎo)致大腸桿菌耐藥性的原因主要是豫西地區(qū)大部分養(yǎng)殖戶飼養(yǎng)規(guī)模小，飼養(yǎng)水平相對(duì)較低，使用抗菌藥物不合理，甚至是濫用抗菌藥物，再加上藥物不規(guī)范等因素，造成大腸桿菌耐藥質(zhì)粒在自然界的復(fù)制和水平傳播，產(chǎn)生越來(lái)越多的耐藥菌株。因此，在飼養(yǎng)過程中必須禁止濫用抗生素，減輕對(duì)細(xì)菌的選擇性壓力，延緩細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的速度。在治療大腸桿菌病時(shí)，可先篩選高效敏感的藥物進(jìn)行治療，以提高對(duì)本病的治愈率，同時(shí)要注意科學(xué)合理用藥，在抗菌藥物的選擇上應(yīng)考慮聯(lián)合用藥、交叉用藥、輪換用藥；建立健全大腸桿菌耐藥性監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，定期對(duì)臨床分離菌株進(jìn)行抗菌藥物敏感性監(jiān)測(cè)，以便及時(shí)掌握大腸桿菌耐藥性變化趨勢(shì)，根據(jù)耐藥性監(jiān)測(cè)結(jié)果為臨床上合理選用最佳抗菌藥物、最佳劑量和最適療程提供理論依據(jù)。

[1] 陳溥言.獸醫(yī)傳染病學(xué)[M].5版.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2006：111-119.

[2] 杜風(fēng)蘭,許國(guó)賓.雞大腸桿菌病和新城疫混合感染的診斷與防治[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2014(22): 265-266.

[3] 石玉祥,王綏華,張永英,等.規(guī)模化雞場(chǎng)空氣致病性大腸桿菌分離鑒定及其耐藥性觀察[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,43(2):126-128.

[4] 薛俊龍,張李俊,王采先,等.雞大腸桿菌多價(jià)復(fù)合佐劑滅活苗的研制[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009,37(11):50-53,57.

[5] 王冠玉,譚艾娟,呂世明,等.貴州雞源大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性測(cè)定[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,19(2):26-28.

[6] 劉玉濤,吳學(xué)敏,陳如敬,等.福建省雞源大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2014,30(2):65-68.

[7] 齊鳳云,孫少麗.雞大腸桿菌病的臨床特征及防控[J].山東畜牧獸醫(yī),2012,33(6):36-37.

[8] 張曉紅.雞大腸桿菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫,2013,30(1):65-66.

[9] 崔澤林,郭曉奎.食物鏈中抗生素耐藥性基因的轉(zhuǎn)移[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志,2011,23(1):89-92.

[10] 姚火春.獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].2版.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2003：43-45.

[11] 譚燕玲,朱瑞良,王慧,等.雞胚胎性病原菌多重PCR檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2011,33(5):374-377.

[12] 陸承平.獸醫(yī)微生物學(xué)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2007：215-223.

[13] 中國(guó)農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所.獸醫(yī)微生物學(xué)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,1998：583-585.

[14] 賈艷華,李鳳娟,劉建華,等.雞源大腸桿菌生物被膜的耐藥性分析[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2008,23(2):191-197.

[15] 白靜,王宇.河南省雞致病性大腸桿菌血清型、耐藥性的研究[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2007(10):105-107.

[16] 盧曉輝,李祥瑞,孫清蓮,等.河南省部分地區(qū)雞源大腸桿菌分離及其生物學(xué)特性[J].畜牧與獸醫(yī),2009,41(2):69-72.

[17] 劉遠(yuǎn)升,徐萍,劉麗艷,等.周口地區(qū)雞源致病性大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J].河南科技學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2011,39(1):68-71.

[18] 汪洋,王育娜,易力,等.洛陽(yáng)地區(qū)雞源大腸桿菌的耐藥性研究[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2011(2):124-125.

Isolation,Identification and Drug Resistance Analysis ofEscherichiacolifrom Chickens in Western Henan Province

MAO Fuchao,YU Chuan*,HAN Lu,HAN Yupei,LIU Wenhui,LIU Jing

(The Key Laboratory of Animal Disease and Public Security,College of Animal Science and Technology,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)

In order to investigate the resistance ofEscherichiacoliisolated from chickens in western Henan province,a total of 130 samples of suspect ofEscherichiacoliwere examined for the presence ofEscherichiacolispecies.All bacteria were isolated by a conventional method,identificated via biochemical testing,PCR,serotyping and antimicrobial susceptibility test.98 strains ofE.coliwere separated and 86 strains were confirmed as belonging to 14 serum types.The chief serum types were O14,O141,O78and O88with the percentage of 20.93%,16.28%,13.95% and 9.30% respectively.The isolates were evaluated for antimicrobial sensitivity by K-B disc diffusion method against 20 antimicrobial drugs.AmongE.coliisolates,95.92%,83.67%,81.63%,77.55%,69.39% were resistant to sulfamethoxazole,tetracycline,ampicillin,nilidixic acid and enrofloxacin,respectively.Almost isolates ofE.coliwere susceptible to polymyxin B,imipenem.Most of isolates were multiple resistant strains.77.55% of the isolates (76) were resistant to 9—14 antimicrobial agents.This study revealed that the drug resistance of all isolates was a severe problem in western Henan province,which would seriously affect diagnosis and prevention ofE.coliin poultry.

E.coli; isolation and identification; antimicrobial susceptibility testing; antimicrobial resis-tance analysis

2015-07-10

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31302059)；河南科技大學(xué)SRTP項(xiàng)目(2015143)；河南科技大學(xué)博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目(4025-13480064)

毛福超(1991-)，男，河南周口人，在讀本科生，研究方向：動(dòng)物疫病防控。E-mail:1798119803@qq.com

*通訊作者：郁 川(1985-)，男，河南安陽(yáng)人，講師，博士，主要從事動(dòng)物疫病防控研究。E-mail:yu_chuan1985@163.com

S855.1

A

1004-3268(2016)01-0127-04