張 露，王繼華，解瑋佳，蔡艷飛，宋 杰，彭綠春，李樹(shù)發(fā)，李世峰

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所，國(guó)家觀賞園藝工程技術(shù)研究中心， 云南省花卉育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650205)

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基于系譜和SSR標(biāo)記的高山杜鵑雜交種親緣關(guān)系分析

張 露，王繼華，解瑋佳，蔡艷飛，宋 杰，彭綠春，李樹(shù)發(fā)，李世峰*

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所，國(guó)家觀賞園藝工程技術(shù)研究中心， 云南省花卉育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650205)

該研究對(duì)高山杜鵑(RhododendronL.)的總DNA提取方法進(jìn)行了改良，然后綜合利用高山杜鵑EST數(shù)據(jù)庫(kù)和該實(shí)驗(yàn)室的馬纓杜鵑高通量測(cè)序數(shù)據(jù)，引用已發(fā)表文獻(xiàn)的SSR引物，從154對(duì)SSR引物中篩選出了26對(duì)多態(tài)性高、重復(fù)性好、條帶清晰的SSR引物。再?gòu)闹须S機(jī)選擇10對(duì)SSR引物進(jìn)行熒光標(biāo)記，對(duì)69份不同高山杜鵑的種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果表明，平均有效等位基因數(shù)6.959 2個(gè)；位點(diǎn)多態(tài)性信息含量(PIC)、觀測(cè)雜合度(HO)、期望雜合度(HE)和Nei’s基因多樣性(H)分別為0.795 2、0.543 5、0.826 5和0.820 2；雜交種間的非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均(UPGMA)聚類結(jié)果與其譜系分析結(jié)果基本一致，可實(shí)現(xiàn)對(duì)一些未知來(lái)源的育成品種資源進(jìn)行祖先親本類型的推測(cè)。

高山杜鵑；DNA提??；SSR引物篩選；系譜；親緣關(guān)系

杜鵑花(RhododendronL.)為世界著名的園林觀賞花卉，是中國(guó)傳統(tǒng)十大名花和云南八大名花之一。高山杜鵑是一些常綠闊葉杜鵑原種及其雜交后代的總稱，因其株型優(yōu)美、花大色艷，四季常綠，逐漸成為中國(guó)年宵花和高檔園林綠化的新秀，在西方素有“沒(méi)有杜鵑不成園林”的說(shuō)法[1]。中國(guó)西南部及毗鄰的東喜馬拉雅地區(qū)為常綠杜鵑亞屬的分布中心和分化起源中心[2]，有杜鵑屬植物320余種，占世界杜鵑屬植物的1/3[3]。歐美國(guó)家對(duì)中國(guó)杜鵑的引進(jìn)及培育利用已有300多年歷史[4]，已培育出上萬(wàn)園藝品種并廣泛應(yīng)用到城市園林中，而作為杜鵑資源大國(guó)的中國(guó)卻相形見(jiàn)絀，不僅選育的品種很少，城市園林建設(shè)中也鮮見(jiàn)杜鵑屬植物的蹤影[5]。由于高山杜鵑育種工作的滯后，導(dǎo)致中國(guó)高山杜鵑種質(zhì)利用率低下，產(chǎn)業(yè)發(fā)展受制于人的問(wèn)題日益凸顯[6]，挖掘和引入本土種質(zhì)資源進(jìn)行育種開(kāi)發(fā)對(duì)于產(chǎn)業(yè)發(fā)展與提升具有重要意義?，F(xiàn)如今，高山杜鵑的雜交育種研究工作將面臨以下兩大問(wèn)題：1)高山杜鵑雜交育種歷史悠長(zhǎng)，諸多品種資源的系譜關(guān)系混亂不清，造成對(duì)其進(jìn)一步的利用存在很大程度上的盲目性；2)中國(guó)高山杜鵑的野生種質(zhì)資源雖豐富多樣化，但極度缺乏對(duì)優(yōu)異種質(zhì)資源的搜集和研究關(guān)注度，導(dǎo)致在進(jìn)一步擴(kuò)寬種質(zhì)遺傳基礎(chǔ)的實(shí)際工作中缺乏科學(xué)的理論指導(dǎo)，對(duì)優(yōu)異新種質(zhì)的評(píng)價(jià)及利用程度非常低。在解決此兩大問(wèn)題的基礎(chǔ)上，中國(guó)有關(guān)高山杜鵑的雜交育種研究將迎來(lái)一個(gè)全新的局勢(shì)。本研究針對(duì)已搜集到的國(guó)外引進(jìn)高山杜鵑種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，對(duì)未來(lái)高山杜鵑的雜交育種研究具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及樣品采集

本研究采用的實(shí)驗(yàn)材料均采自云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所晉寧市大春河實(shí)驗(yàn)基地杜鵑花種質(zhì)資源圃，62份高山杜鵑雜交種資源均為2013年先后引種于比利時(shí)和德國(guó)，基本信息詳見(jiàn)表1；7份野生種資源分別是大白杜鵑(R.decorum)、大喇叭杜鵑(R.excellens)、馬纓杜鵑(R.delavayi)、露珠杜鵑(R.irroratum)、云南杜鵑(R.yunnanense)、爆杖花杜鵑(R.spinuliferum)和富源杜鵑(R.fuyuanense)，樣品編號(hào)依次為A1、A2、A3、A8、A10、A14、A16。均于2014年6月采集樣品新抽枝條上的幼嫩葉片，置于變色硅膠中用自封袋密閉干燥，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方 法

1.2.1 高山杜鵑雜交種的譜系分析 根據(jù)62個(gè)高山杜鵑雜交種的系譜資料(主要參考網(wǎng)站http://hirsutum.info/，另有網(wǎng)站http://ip-173-201-58-163.ip.secureserver.net/RhododendronHybrids.htm作資料補(bǔ)充)分別列出其祖先親本，將祖先親本未知的單獨(dú)列為“未知”類型，然后參考崔章林[19]的方法計(jì)算每個(gè)雜交種的祖先親本遺傳貢獻(xiàn)值。凡由祖先親本經(jīng)自然變異選擇法育成的品種其祖先親本的遺傳貢獻(xiàn)值為1；凡由雜交育成的品種其雙親的遺傳貢獻(xiàn)均為0. 5。每一親本再按均等分割方法上推其雙親，直至終極的祖先親本，這樣每一育成品種的各祖先親本的遺傳貢獻(xiàn)值總和應(yīng)等于1。同時(shí)根據(jù)《中國(guó)花卉品種分類學(xué)》[20]中對(duì)高山杜鵑雜交種的分類方法，對(duì)62份雜交種進(jìn)行歸類。

1.2.2 高山杜鵑總DNA提取 經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，對(duì)Zeng 等[21]及王書(shū)珍等[22]的方法做了稍許修改。同時(shí)對(duì)2×CTAB法、4×CTAB法和改良的4×CTAB法的總DNA提取效果進(jìn)行比較分析。4×CTAB法主要是在2×CTAB法的基礎(chǔ)上提高CTAB濃度；改良后的4×CTAB法則是在4×CTAB法的基礎(chǔ)上增加了冰浴去多糖的步驟，其具體操作步驟如下：1)稱取約100 mg硅膠干燥葉片于液氮中研磨成粉末，立即轉(zhuǎn)移至裝有1.5 mL Buffer Ⅰ (含pH 8.0的200 mmol/L Tris-HCl、pH 8.0的50 mmol/L EDTA、250 mmol/L NaCl、1%β-巰基乙醇和1%PVP) 的2.0 mL離心管中，待溶解后渦旋混勻并冰浴10 min，期間不時(shí)搖勻；2)4 ℃、7 000 r/min離心10 min，倒掉上清液(上清液如若仍粘稠，根據(jù)情況可重復(fù)加Buffer Ⅰ 進(jìn)行冰浴處理)，加入800 μL 經(jīng)65 ℃預(yù)熱的4×CTAB裂解液(含pH 8.0的100 mmol/L Tris-HCl、pH 8.0的25 mmol/L EDTA、1.5 mol/L NaCl 和 4.0 % CTAB)，再置于65 ℃水浴40～60 min，期間不時(shí)混勻；3)加入等體積Tris飽和酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，渦旋混勻，靜置5 min后于12 000 r/min，離心8 min后用剪過(guò)槍尖的槍頭轉(zhuǎn)移上清(避免吸到下層雜質(zhì))至新離心管；4)往上清液中加入10 mg/mL RNase A 5 μL，室溫靜止處理20 min。然后再往里面加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，顛倒混勻，靜置5 min后于12 000 r/min，離心8 min。小心轉(zhuǎn)移上清至新離心管；5) 加入4 ℃預(yù)冷的異丙醇(上清液體積的2/3)上下顛倒混勻后于-20 ℃沉淀1 h以上，然后4 ℃、12 000 r/min離心10 min后棄上清；6)用75%酒精洗滌DNA沉淀2次?？馗删凭螅糜谕L(fēng)櫥內(nèi)晾干，最后加ddH2O室溫溶解5 min。所得DNA溶液經(jīng)瓊脂糖凝膠或微量核酸檢測(cè)儀(NanoDrop 2000，美國(guó)Thermo Scitific corporation)檢測(cè)后置于-20 ℃下長(zhǎng)期保存?zhèn)溆谩?/p>

通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和核酸微量檢測(cè)儀2種檢測(cè)方法進(jìn)行DNA質(zhì)量檢測(cè)。要求DNA瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)明顯主帶，無(wú)彌散，且對(duì)應(yīng)點(diǎn)樣孔中無(wú)雜質(zhì)滯留；同時(shí)OD260/280值在1.8～2.0之間， OD260/230值在1.8以上，且濃度大于100 ng/μL，即可直接用于下游的SSR擴(kuò)增。

在2016年12月7日至8日舉行的全國(guó)高校思想政治工作會(huì)議中，習(xí)近平總書(shū)記強(qiáng)調(diào)，“要堅(jiān)持不懈地培育和弘揚(yáng)社會(huì)主義核心價(jià)值觀，引導(dǎo)廣大師生做社會(huì)主義核心價(jià)值觀的堅(jiān)定信仰者、積極傳播者、模范踐行者”，“要運(yùn)用新媒體新技術(shù)使工作活起來(lái)，推動(dòng)思想政治工作傳統(tǒng)優(yōu)勢(shì)同信息技術(shù)高度融合”[1]。 新媒體具有傳播的迅速性、方式的多樣性、手段的兼容性等傳播特點(diǎn)，其方式符合大學(xué)生的生活習(xí)慣，易被大學(xué)生接受，它為社會(huì)主義核心價(jià)值觀全面深入、迅速有效地傳播帶來(lái)了機(jī)遇。

1.2.3 引物來(lái)源及設(shè)計(jì) 引物主要來(lái)源于： 1)引用文獻(xiàn)中已開(kāi)發(fā)的杜鵑屬植物SSR引物。其中來(lái)自杜鵑(R.simsii)的是14對(duì)[9-10]，來(lái)自馬纓杜鵑的是15對(duì)[12]，共29對(duì)SSR引物；2)利用NCBI上已公布的杜鵑屬植物杜鵑[23]和山石南杜鵑(R.catawbiense)[24]的EST文庫(kù)。采用SSR Hunter軟件[25]對(duì)文庫(kù)序列進(jìn)行2～6個(gè)重復(fù)堿基微衛(wèi)星序列的搜索，設(shè)置單元重復(fù)次數(shù)≥6，且上下游序列長(zhǎng)度≥150 bp作為篩選條件，得到105條微衛(wèi)星EST序列并進(jìn)行引物設(shè)計(jì)；3)利用本課題組已獲得的馬纓杜鵑基因組文庫(kù)，從中隨機(jī)選擇20條含微衛(wèi)星的DNA序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。因此，可用于本研究的SSR引物共有154對(duì)，利用軟件Primer Premier 5.0[26]進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物序列交由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2.4 SSR擴(kuò)增及檢測(cè) 從69份材料中隨機(jī)選擇12份樣品進(jìn)行引物篩選，包含A3、A10、A16等3個(gè)野生種和D1、D6、D11、D20、W5、W8、W10、W19、R1等9個(gè)雜交種。PCR擴(kuò)增試劑為2×EasyTaq PCR SuperMix for PAGE(全式金生物技術(shù)有限公司，含buffer、dNTP、Mg2+及rTaq酶)，引物終濃度為0.2 μmol/L。PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，退火溫度下退火30 s，72 ℃延伸30 s，32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min。并以PAGE膠條帶亮度和條帶特異性作為評(píng)判依據(jù)，對(duì)每對(duì)引物的DNA模板濃度和退火溫度進(jìn)行分別優(yōu)化。

引物多態(tài)性篩選時(shí)，SSR擴(kuò)增產(chǎn)物在8%PAGE膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，對(duì)照Marker為20 bp DNA Ladder(上海捷瑞生物工程有限公司生產(chǎn))。

隨機(jī)選擇的10對(duì)多態(tài)性SSR引物序列交由上海捷瑞生物工程有限公司進(jìn)行熒光標(biāo)記的合成，并分別在69份樣品DNA中進(jìn)行多態(tài)性擴(kuò)增， SSR擴(kuò)增產(chǎn)物則由碩擎生物科技有限公司進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)(機(jī)型為3730XL)分析，機(jī)器自動(dòng)化判讀條帶。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 1)多態(tài)性SSR引物篩選。根據(jù)擴(kuò)增條帶的遷移率，以20 bp DNA ladder作為Marker參照，統(tǒng)計(jì)每個(gè)位點(diǎn)在12個(gè)樣品DNA中擴(kuò)增片段大小。片段大小相同則認(rèn)為無(wú)多態(tài)性，大小不同則視為等位基因，組成共顯性標(biāo)記數(shù)據(jù)矩陣。然后采用軟件DataFormater 2.7[27]進(jìn)行格式統(tǒng)一，再利用POPGENE version 1. 32軟件[28]計(jì)算各個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀察雜合度(HO)、期望雜合度(HE)、香農(nóng)多樣性指數(shù)(I)及Nei’s 基因多樣度(H)等指標(biāo)；各位點(diǎn)的多態(tài)性信息含量(PIC)則由軟件PowerMarker version 3. 25[29]進(jìn)行計(jì)算；2) 遺傳多樣性分析。按照軟件DataFormater 2.7的格式要求，在Excel表格中統(tǒng)計(jì)整理10對(duì)熒光標(biāo)記引物在69份樣品中的擴(kuò)增條帶數(shù)據(jù)，然后同上分別采用POPGENE version 1. 32軟件和PowerMarker version 3. 25軟件計(jì)算以上各多樣性信息指標(biāo)，最后采用軟件NTSYS 2.10e[30]進(jìn)行非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法(UPGMA)的聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 62份高山杜鵑雜交種的譜系分析

采用Excel表記錄每個(gè)雜交種的各祖先親本遺傳貢獻(xiàn)值(所有祖先親本的遺傳貢獻(xiàn)值總和為1)，然后根據(jù)各祖先親本在62份雜交種中的遺傳貢獻(xiàn)值大小，取遺傳貢獻(xiàn)值排名在前十二的12個(gè)祖先親本作為本研究的重要祖先親本(“未知” 類型除外)。表1中依次列出了12個(gè)重要祖先親本在62個(gè)高山杜鵑雜交種中的遺傳貢獻(xiàn)值，12個(gè)重要祖先親本分別是：土耳其杜鵑(R.ponticum，A)、黃杯杜鵑(R.wardii，B)、高加索杜鵑(R.caucasicum，C)、山石南杜鵑(R.catawbiense，D)、兩色杜鵑(R.dichroanthumspp.dichroanthum，E)、東石楠杜鵑(R.degronianumspp.yakushimanum，F(xiàn))、朱紅大杜鵑(R.griersonianum，G)、不丹杜鵑(R.griffithianum，H)、云錦杜鵑(R.fortuneispp.fortunei，I)、樹(shù)形杜鵑(R.arboreum，J)、似血杜鵑(R.haematodesspp.haematodes，K)和綿毛房杜鵑(R.facetum，L)，遺傳貢獻(xiàn)值總和為30.813 75，遺傳貢獻(xiàn)值從高到低依次為：D(7.593 75)>A(3.75)、F(3.75)>G(3.062 5)>H(2.907 5)>I (2.625)>E(2.125)>B(1.875)>C(1.375)>J(0.875)>L (0.625) >K(0.25)。

根據(jù)《中國(guó)花卉品種分類學(xué)》中對(duì)高山杜鵑雜交種的分類方法，62份高山杜鵑雜交種主要?dú)w類于美國(guó)山石南杜鵑花雜種群(Catawba Hybrids Group)、高加索杜鵑花雜種群(Caucasicum Hybrids Group)、云錦杜鵑花雜種群(Fortunei Hybrids Group)和腺柱杜鵑花雜種群(Griffithianum Hybrids Group)等4個(gè)雜種群。另外，本研究還將以R.degronianumspp.yakushimanum為親本雜交而得的雜種群暫定名為‘東石楠杜鵑花雜種群’(Degronianum Hybrids group)，其余則定為‘其它雜交種群’或‘親本不詳?shù)碾s交種群’，具體歸類情況見(jiàn)表2。

2.2 總DNA提取

圖1為3種提取方法效果對(duì)比，可以看出：由2×CTAB法提取所得DNA對(duì)應(yīng)泳道點(diǎn)樣孔中有明顯雜質(zhì)殘留；提高CTAB濃度至4×CTAB可在一定程度上提高DNA得率，但仍有雜質(zhì)殘留；改良4×CTAB法所得DNA主帶明亮、無(wú)彌散，點(diǎn)樣孔干凈，表明DNA完整且純度高；OD260/280值均在1.8～2.0之間，OD260/230值均大于1.9，濃度大于300 ng/μL，濃度和純度上均能滿足下一步SSR實(shí)驗(yàn)要求。

表2 62份高山杜鵑雜交種的分類情況

注：雜交種編號(hào)同表1

Note： Codes of 62 alpine same as Table 1

2.3 多態(tài)性SSR引物的篩選

采用優(yōu)化的SSR體系，在12個(gè)樣品中對(duì)154對(duì)SSR引物進(jìn)行篩選，根據(jù)SSR擴(kuò)增條帶的有無(wú)、特異性、多態(tài)性和可重復(fù)性原則，最終從154對(duì)SSR引物中篩選出26對(duì)條帶清晰、特異性好、重復(fù)性好、多態(tài)性較高的SSR引物。其中從山石南杜鵑(R.catawbiense)的99個(gè)EST序列中篩選得14對(duì)SSR引物；從杜鵑(R.simsii)的6個(gè)EST序列中篩選出了1對(duì)SSR引物；從馬纓杜鵑的20個(gè)基因組DNA序列中篩選出了6對(duì)SSR引物；從29對(duì)文獻(xiàn)引用的SSR引物中篩選得5對(duì)多態(tài)性SSR引物[9-10]。26對(duì)引物的基本信息詳見(jiàn)表3；各位點(diǎn)的多態(tài)性分析結(jié)果詳見(jiàn)表4。

隨機(jī)選取一份DNA樣品作為SSR擴(kuò)增模板，對(duì)篩選的26對(duì)SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，圖2，A展示了26份擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果，表現(xiàn)為條帶清晰、特異性好，基本無(wú)雜帶。從26對(duì)SSR引物中隨機(jī)選擇2對(duì)引物(Rho-13和Rho-26)對(duì)課題組高山杜鵑資源圃內(nèi)的21份高山杜鵑(含以上所用12份材料)的DNA樣品進(jìn)行多態(tài)性擴(kuò)增，從圖2，B可以看出它們?cè)?1份不同樣品中均呈現(xiàn)出較高的多態(tài)性。

M1. 15K DNA marker；M2. 2K Plus DNA marker; Ⅰ.2×CTAB法；Ⅱ.4×CTAB法；Ⅲ.改良4×CTAB法圖1 3種不同CTAB法提取高山杜鵑總DNA瓊脂糖凝膠電泳M1 represents 15K DNA marker; M2 represents 2K Plus DNA marker; Ⅰ. 2×CTAB method;Ⅱ. 4×CTAB method; Ⅲ. Improved 4×CTAB method; The description texts on the top white line represent the corresponding extracting methodFig.1 Agarose gel image showing Rhododendron total DNA samples extracted by three different CTAB methods

M.20 bp DNA ladder; A.26對(duì)SSR引物擴(kuò)增結(jié)果； B.1～21.引物Rho-13 擴(kuò)增條帶；22～42.引物Rho-26擴(kuò)增條帶圖2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的PAGE膠圖M. 20 bp DNA ladder; A. Amplified PCR bands using 26 SSR primer pairs; B. 1～21. PCR bands of primer Rho-13; 22～42. PCR bands of primer Rho-26Fig.2 PAGE image of PCR products

表4 各位點(diǎn)信息

位點(diǎn)Locus等位基因數(shù)Na有效等位基因數(shù)Ne多態(tài)性信息含量PIC觀測(cè)雜合度HO期望雜合度HE基因多樣度HRho18．00005．76330．80580．58330．82230．8264Rho210．00005．33330．79740．58330．84780．8125Rho36．00004．15380．72710．33330．80390．7593Rho49．00006．54050．83050．54550．88740．8471Rho55．00003．45710．67210．00000．74460．7107Rho66．00004．26320．72970．44440．81050．7654Rho75．00003．66670．68500．63640．76190．7273Rho84．00003．66670．67810．0000．76190．7273Rho94．00002．88000．59940．00000．68120．6528Rho105．00004．44440．73860．50000．81580．7750Rho119．00005．23640．78710．91670．84420．8090Rho128．00006．26090．82120．58330．87680．8403Rho1310．00006．05000．81600．45450．87450．8347Rho144．00003．94520．69920．58330．77900．7465Rho1510．00007．38460．85000．83330．90220．8646Rho1610．00006．00000．81840．33330．86960．8333Rho1710．00007．71430．85671．00000．92160．8704Rho186．00003．51220．67191．00000．74640．7153Rho195．00002．91570．60760．81820．68830．6570Rho207．00005．40540．78970．30000．85790．8150Rho218．00006．45160．82610．60000．88950．8450Rho224．00003．84620．69180．00000．77890．7400Rho235．00002．76920．57240．33330．66670．6389Rho245．00003．09680．63750．50000．70650．6771Rho2513．00009．60000．88740．66670．93480．8958Rho2612．00009．00000．87910．33330．92750．8889Mean7．2308±2．67295．1290±1．88110．7491±0．09110．4955±0．29170．8170±0．07970．7798±0．0758

2.4 種質(zhì)遺傳多樣性分析

2.4.1 SSR引物多態(tài)性分析結(jié)果 統(tǒng)計(jì)10對(duì)熒光標(biāo)記SSR引物在69份高山杜鵑種質(zhì)中的擴(kuò)增條帶數(shù)據(jù)，計(jì)算各位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)、多態(tài)性信息含量、觀測(cè)雜合度、期望雜合度及基因多樣度等指標(biāo)，其平均值分別為6.959 2、0.795 2、0.543 5、0.826 5和0.820 2(表5)。

2.4.2 SSR聚類結(jié)果 對(duì)69份高山杜鵑種質(zhì)進(jìn)行UPGMA聚類分析，結(jié)果分為三大支(圖3)：第一大支(Clade Ⅰ)主要由常綠杜鵑組中的3個(gè)野生種(A01、A03、A08)和云錦杜鵑花雜種群(D2、D14、W20、W29、W19、W31)所組成；第二大支(Clade Ⅱ)主要由同屬糙葉杜鵑亞屬的2個(gè)野生種(A14和A16)和同屬杜鵑花組的2個(gè)野生種(A2、A10)及東石楠杜鵑花雜種群(D04、D19、 D23)組成；第三大支(Clade Ⅲ)的聚類成員最多，主要包含美國(guó)山石南杜鵑花雜種群(W35、D5、W5、W16、W22、W21、W23、W01、W06、W37、W02、W03、W27)、高加索杜鵑花雜種群(W08、W09、W10)、腺柱杜鵑花雜種群(D06、D13、D16、D24、W17、W18、W34、W33)和東石楠杜鵑花雜種群(D17、D18、D20、D25)。

從聚類結(jié)果可以看出，系譜資料與聚類結(jié)果間的一致性較好，提示聚類結(jié)果可靠。親本未知類群在系統(tǒng)樹(shù)上的聚類位置，可以作為我們推測(cè)其祖先親本類型的科學(xué)依據(jù)。D12和D15作為外類群分支到三大支之外，推測(cè)它們的祖先親本可能為常綠杜鵑亞屬、杜鵑亞屬及糙葉杜鵑亞屬之外的杜鵑屬某亞屬內(nèi)的杜鵑種類。

表5 10對(duì)熒光標(biāo)記SSR引物的多態(tài)性分析結(jié)果

圖中高山杜鵑樣品編號(hào)所指同文中表1圖3 基于SSR分子標(biāo)記的69份高山杜鵑種質(zhì)資源系統(tǒng)樹(shù)圖Sample codes in this image represent the same Rhododendron samples as Table 1Fig.3 Dendrogram of 69 alpine Rhododendron germplasms based on SSR markers

3 討 論

3.1 DNA提取方法的優(yōu)化改良

高山杜鵑植物體內(nèi)的次生代謝物質(zhì)豐富，為典型的多糖多酚植物類型。從多糖多酚植物類群中提取高質(zhì)量的DNA是許多研究領(lǐng)域例如居群生物學(xué)、生物多樣性、分子標(biāo)記輔助育種等研究中遇到的普遍難題。本實(shí)驗(yàn)室的前期實(shí)驗(yàn)表明，高山杜鵑的DNA 質(zhì)量關(guān)乎下游SSR-PCR實(shí)驗(yàn)的成敗。有關(guān)改良的關(guān)鍵步驟和效果主要有：1)利用去多糖buffer I有效地洗去了植物細(xì)胞勻漿中大部分多糖和多酚等次生代謝物質(zhì)；2) 提高細(xì)胞裂解液中的CTAB濃度，可以使植物細(xì)胞裂解更加充分，在一定程度上提高DNA得率；3)先將細(xì)胞裂解混合液進(jìn)行高速離心后取上清，再對(duì)上清液進(jìn)行抽提，可有效地提升抽提效果，提高DNA得率；4)對(duì)進(jìn)行了1次抽提后的上清液中加入Rnase A處理，可基本去除RNA的污染。以上改良方法有效解決了用常規(guī)方法提取高山杜鵑DNA的雜質(zhì)較多、純度較低、DNA完整性較差等技術(shù)問(wèn)題。此改進(jìn)方案簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、可靠、針對(duì)性強(qiáng)，DNA不需純化可直接用于下游的分子實(shí)驗(yàn)，可能也適用于內(nèi)源次生代謝物質(zhì)豐富的其他植物種類。

3.2 多態(tài)性SSR引物的篩選

本研究用于引物篩選的12份材料包括3份高山杜鵑野生種和9份高山杜鵑雜交種，材料間來(lái)源差異較大，涉及不同野生種和品種。因此，篩選得的微衛(wèi)星標(biāo)記將具有更好的種間通用性，可應(yīng)用于更大范圍內(nèi)的杜鵑屬植物的遺傳多樣性等研究?？傮w引物篩選比率達(dá)17%(26/154)，其中已發(fā)表引物的篩選比率約為17%(5/29)，EST序列所設(shè)計(jì)引物篩選比率約為14%(15/105)，基因組文庫(kù)中的DNA序列所設(shè)計(jì)引物篩選比率最高達(dá)30%(6/20)。由此筆者認(rèn)為，來(lái)源于基因組文庫(kù)的DNA序列較EST序列更適合用于遺傳多樣性分析的SSR引物開(kāi)發(fā)。

3.3 系譜關(guān)系與聚類結(jié)果間的比照分析

從69份高山杜鵑種質(zhì)的UPGMA聚類結(jié)果來(lái)看，各分支中的野生種和雜交種的聚類結(jié)果與其分類地位或系譜資料間基本吻合。通過(guò)二者之間的比照分析，可以對(duì)系譜資料不完全或缺失的高山杜鵑雜交種的祖先親本來(lái)源作出科學(xué)性解釋或推測(cè)。

第一大支中(Clade Ⅰ)分屬不同的常綠杜鵑組亞組的3個(gè)野生種(大白杜鵑、馬纓杜鵑和露珠杜鵑)聚在了一起，此結(jié)果可以通過(guò)它們之間存在頻繁自然雜交現(xiàn)象的分子證據(jù)來(lái)解釋[31-32]；其它則主要為云錦杜鵑花雜種群類型(D2、D14、W20、W29、W19、W31)?；诖耍m然雜交種D2和W31基于祖先親本的遺傳貢獻(xiàn)值應(yīng)歸類到六大類之外，但是云錦杜鵑(R.fortunei)作為其祖先親本之一，在兩品種中的遺傳貢獻(xiàn)值均達(dá)到了0.25，且根據(jù)聚類結(jié)果來(lái)看，它們確與其它云錦杜鵑花雜種群聚在了一起。同理，雜交種D24和W33在系譜資料和SSR聚類間也存在此類矛盾。筆者認(rèn)為遺傳貢獻(xiàn)值的計(jì)算方法在親緣關(guān)系分析上僅具有一定的參考價(jià)值，畢竟遺傳貢獻(xiàn)值只是一個(gè)理想的假設(shè)，并未考慮到性狀連鎖遺傳和細(xì)胞質(zhì)遺傳等情況。

第二大分支(Clade Ⅱ)則主要集結(jié)了常綠杜鵑亞屬之外的杜鵑亞屬和糙葉杜鵑亞屬內(nèi)的4個(gè)野生種，分別為大喇叭杜鵑(A2)、云南杜鵑(A10)、爆杖花杜鵑(A14)和富源杜鵑(A16)，其它主要為東石楠杜鵑花雜種群(D04、D19、 D23)。據(jù)此，我們推測(cè)R.degronianumspp.yakushimanum也可能是D09或D11的祖先親本之一。

第三大支(Clade Ⅲ)主要集結(jié)了美國(guó)山石南杜鵑花雜種群(W35、D5、W5、W16、W22、W21、W23、W01、W06、W37、W02、W03、W27)、高加索杜鵑花雜種群(W08、W09、W10)、腺柱杜鵑花雜種群(D06、D13、D16、D24、W17、W18、W34、W33)及東石楠杜鵑花雜種群(D17、D18、D20、D25)?；诖私Y(jié)果，我們推測(cè)W14的母本可能為R.catawbiense而并非R.ponticum，且R.catawbiense也可能是W11、W12和XXL的親本之一；R.caucasicum可能是W13、W30和W36的親本之一；R.griffithianum可能為D01、D03、D08、W07、W24的親本之一，還可能是親本未知類群D10、W25、W04、R1的親本之一。

根據(jù)62個(gè)引進(jìn)高山杜鵑育成品種的重要祖先親本組成類型及其遺傳貢獻(xiàn)值，可以看出這些國(guó)外引進(jìn)品種的祖先親本主要來(lái)源于中國(guó)，且親本來(lái)源范圍相對(duì)狹窄，主要集中來(lái)源于常綠杜鵑亞屬(Subgen.Hynenaanthes)常綠杜鵑組(Sect. Ponticum)。比照62份高山杜鵑種質(zhì)的系譜資料和SSR聚類分析結(jié)果，二者之間基本吻合。本研究主要對(duì)系譜資料不詳?shù)木幪?hào)為D1、D03、D8、D09、D10、D11、W04、W07、W11、W12、W13、W14、W24、W25、W30、W36、R1、XXL的高山杜鵑雜交種進(jìn)行了親本類型推測(cè)，研究結(jié)果可為未來(lái)高山杜鵑雜交育種的親本選配提供科學(xué)的理論參考。

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(編輯:宋亞珍)

Ancestor Parents Speculation for AlpineRhododendronHybrids Based on the Pedigree and SSR Markers

ZHANG Lu, WANG Jihua, XIE Weijia, CAI Yanfei,SONG Jie, PENG Lüchun, LI Shufa, LI Shifeng*

(Flower Research Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, National Engineering Research Center for Ornamental Horticulture, Key Lab of Yunnan Flower Breeding, Kunming 650205, China)

In this study, the total DNA extraction method was modified based on the conventional CTAB method forRhododendron, and then many microsatellite sequences were chosen from the publishedRhododendronEST database and unpublished genome database ofR.delavayiin our lab to design SSR primer pairs. Moreover, adding many SSR primer pairs referred to the references, 154 pairs of SSR primers were used to be screened. Finally, 26 pairs of polymorphic primers were screened out, and all of PCR amplicons were specific with clearer band and better repeatability. Furthermore, 10 pairs of polymorphic SSR primer fluorescently-labeled were used to genetic diversity analysis on 69Rhododendrongermplasms. The results as following: mean effective allele number (Ne), polymophism information content (PIC), observed heterozygosity (HO) , expective heterozygosity (HE), andNei’sgene diversity(H) for 10 SSR locus are 6.959 2, 0.795 2, 0.543 5, 0.826 5 and 0.820 2, respectively. Based on the consistency between the UPGMA clustering results and their pedigree analysis ofRhododendronhybrids, a speculation of ancestor parent types will be made forRhododendronhybrids with unknown or unclear pedigree.

alpineRhododendron; DNA extraction; SSR primer screening; pedigree; genetic relationship

1000-4025(2016)12-2421-12

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.12.2421

2016-10-17;修改稿收到日期:2016-11-29

國(guó)家自然科學(xué)基金(31460217，31560225)；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃(2016FB058)；云南省花卉育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金(FKL-201501)；云南省科技計(jì)劃(2015BB013)

張 露(1984-)，女，博士，助理研究員，主要從事高山杜鵑植物的遺傳育種研究。E-mail: changjiangyulu@163.com

*通信作者:李世峰，碩士，研究員，主要從事高山杜鵑種質(zhì)創(chuàng)新及繁育研究。E-mail:452977351@qq.com

Q346+.5;Q789

A