岳思君，李治學，范紅麗，周 娟，梁文裕，鄭 蕊*

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發(fā)狀念珠藻醛酮還原酶基因NfAKR的克隆與表達

岳思君1，李治學2，范紅麗1，周 娟1，梁文裕1，鄭 蕊1*

(1 寧夏大學 生命科學學院，西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室, 銀川750021; 2 拉薩市第一中等職業(yè)技術學校，拉薩 850000)

以發(fā)狀念珠藻細胞為試材，采用PCR技術克隆了醛酮還原酶基因的開放閱讀框(ORF)序列，命名為NfAKR。對基因序列特征進行了生物信息學分析，根據其編碼氨基酸序列預測了NfAKR蛋白的三維結構，同時探討了PEG-6000脅迫下NfAKR的表達特性。結果表明：NfAKR基因的編碼序列長912 bp，編碼304個氨基酸，預測其編碼蛋白的相對分子量為33.51 kD，理論等電點為4.94 ，具有醛酮還原酶超家族保守結構域。NfAKR蛋白主要由10個α-螺旋和11 β-折疊組成，中間形成一個疏水穴，作為酶的催化活性中心。NfAKR與點形念珠藻處在同一進化枝上，具有較近的親緣關系。qRT-PCR分析顯示，PEG-6000脅迫下NfAKR基因上調表達，當PEG-6000濃度為8%時，其相對表達量為5.66并達到峰值。依據NfAKR基因響應干旱脅迫上調表達的特性，推測醛酮還原酶可能參與發(fā)狀念珠藻抵御干旱脅迫過程。

發(fā)狀念珠藻，醛酮還原酶，基因克隆，干旱脅迫，表達分析

干旱是影響植物生長最主要的非生物脅迫之一，給植物的生長和產量等帶來諸多不利的影響。干旱、鹽和低溫等非生物逆境會誘導超氧離子、過氧離子、羥自由基等活性氧的積累，導致細胞中膜脂不飽和脂肪酸的過氧化水平增高，破壞膜結構及膜的生理完整性，對植物產生傷害[1-2]。但它們同樣會作為信號調控活性氧的清除過程和其他保護機制，其在脅迫響應過程中還可能會與其他響應機制結合，如 ABA 通路等。植物體內的抗氧化酶系統(tǒng)能有效清除活性氧，滲透調節(jié)物質能有效調節(jié)細胞滲透勢，保護細胞免受傷害[3-4]。關于植物干旱脅迫下的生理響應及耐旱機制越來越受到人們的關注。

醛酮還原酶(Aldo-Keto Reductase，AKR)在生物中廣泛存在，形成了一個具有40個成員的超家族，其功能是參與醛/酮代謝，消除細胞內的醛、酮毒害。AKR4 亞家族C(AKR4C)是植物中發(fā)現的一組AKR。一些雙子葉植物的AKR4C能夠催化活性醛代謝。在擬南芥中有 21 個該家族的基因[5]，但對該類基因的功能研究較少。大豆GmCHR基因編碼蛋白與 AKR類蛋白相似，其功能結構區(qū)具有質子供體位點、亞基結合位點以及核酸結合位點等。GmCHR基因在 NaCl 脅迫后期的上調表達可能參與鹽脅迫引起的活性氧的清除和一些過氧化物有毒物質的清除，對脅迫后的細胞穩(wěn)態(tài)修復有作用[6]。ALDH是一類依賴 NADPH 的醛酮還原酶，能特異性結合醛使其轉化為羧酸，降低細胞內活性氧毒害。過表達 Ath-ALDH3 能降低脂質過氧化反應產生的乙醛含量，其持續(xù)過表達利于植物通過解毒機制提高對脅迫的耐受性[7]。

發(fā)狀念珠藻(Nostocflagelliforme)，亦稱發(fā)狀念珠藍細菌，是生長在荒漠半荒漠地區(qū)的旱生藍藻類低等植物，不僅具有很高的營養(yǎng)價值和藥用價值，還在維持當地生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。由于生長環(huán)境惡劣，長期遭受干旱脅迫，使得發(fā)狀念珠藻表現出很強的干旱適應性，但其耐旱機理尚不清楚。因此，從分子水平研究其耐逆及適應機制、尋找其生長發(fā)育規(guī)律以及實現發(fā)狀念珠藻人工培養(yǎng)，多年來一直是研究者關注的熱點[8-9]。

本研究的目的是通過發(fā)狀念珠藻醛酮還原酶基因的克隆和初步的耐旱性驗證，獲得發(fā)狀念珠藻耐旱基因的相關信息，從而為實現念珠藻耐旱材料的高效篩選和改良提供基礎信息，并為創(chuàng)制耐旱轉基因材料提供有效的基因，進一步充實和完善發(fā)狀念珠藻干旱脅迫基因調控網絡和機制的研究信息。

1 材料和方法

1.1 材 料

實驗材料為發(fā)狀念珠藻懸浮培養(yǎng)細胞，保存于寧夏大學生命科學學院應用微生物學實驗室，培養(yǎng)條件為25 ℃、80 r/min光照培養(yǎng)，生長培養(yǎng)基為BG11培養(yǎng)基。8 000 r/min離心收集藻細胞，保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2 方 法

1.2.1NfAKR基因開放閱讀框的擴增 取50 mg發(fā)狀念珠藻細胞，-80 ℃速凍，液氮研磨成粉末，采用CTAB法提取發(fā)狀念珠藻基因組DNA。電泳檢測DNA質量。

根據發(fā)狀念珠藻基因組精細測序圖中醛酮還原酶基因的ORF序列，設計上游引物AKR-F(5′-CGCGGATCCATGTCTGAGTTTTATAGTGG-3′，劃線部分為BamH I酶切位點)和下游引物AKR-R(5′-CCCAAGCTTTCAACGGTTAACAGTACTCA-3′，劃線部分為HindIII酶切位點)。以發(fā)狀念珠藻總DNA 為模板，進行PCR 擴增。擴增條件為：94 ℃ 預變性5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)，72 ℃ 10 min。目的片段經回收、檢測并測序。

大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5a感受態(tài)細胞、DNA Marker、Taq DNA 聚合酶、Protein MarkerIII、質粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自北京天根公司。pGEM-T Easy 載體、T4 DNA 連接酶購自美國Promaga 公司。限制性內切酶BamHI、HindIII購自美國Fermentas公司。引物合成及基因測序由上海生工生物工程公司完成。

1.2.2NfAKR基因的生物信息學分析 其他物種的 AKR 氨基酸序列均來自于NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數據庫，采用BLAST 進行序列比對。先用ClustalX2.1軟件對序列進行多重比對，再用NJ法完成系統(tǒng)樹的構建，并用MEGA5 對系統(tǒng)樹進行測試和編輯，生成報告圖形。使用ExPASy(http://www.expasy.org)網站相關軟件完成蛋白質基本性質分析。通過SWISS-MODEL(http: //www.swissmodel. expasy.org/) 建立蛋白質空間結構模型。

1.2.3NfAKR基因qRT-PCR分析 以發(fā)狀念珠藻RPL13基因為內參，進行qRT-PCR檢測，分析NfGR基因的表達特性。NfAKR基因上下游引物分別為AKR-qF(5′-ATGTCTGAGTTTTATAGTG-3′)和AKR-qR(5′-GATACTGCTGATATGTA-3′)。RPL13基因上下游引物分別為RPL13-F(5′-TAGAGTTTGC CTGTATCAT-3′)和RPL13-R(5′-TCCGTGGTTTGTCATC-3′)。qRT-PCR擴增程序為：94 ℃預變性30 s；94 ℃變性5 s；50 ℃退火30 s；72 ℃延伸20 s，共45個循環(huán)。實驗共設3個重復，利用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量[10]。

2 結果與分析

2.1 NfAKR基因的開放閱讀框(ORF)克隆

以發(fā)狀念珠藻基因組DNA為模板，AKR-F 和AKR-R 為引物進行PCR擴增，經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增到一條900 bp左右的特異條帶(圖1)。將回收的片段連接至pMD18-T載體, 轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞后進行菌落PCR鑒定。

回收NfAKR基因片段，連接到pGEM-T Easy載體并轉化至DH5α感受態(tài)細胞，涂布、藍白斑篩選，挑取陽性克隆轉接后，37 ℃培養(yǎng)過夜。提質粒進行PCR和酶切驗證，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶，能夠從質粒中擴增出900 bp左右的目的基因條帶(圖2)，雙酶切切出兩條帶，其中一條為900 bp左右的NfAKR基因條帶(圖3)，與預期的擴增片段大小一致 。將陽性克隆送至上海生工生物技術有限公司測序，由測序結果可知，NfAKR基因的ORF長912 bp。

N.陰性對照；1～2. PCR產物；M. DL2000圖1 NfAKR基因編碼序列的克隆N. Negative control；1～2. PCR products；M. DL2000Fig.1 Cloning of the coding sequence of NfAKR

2.2 NfAKR基因編碼蛋白的結構分析

氨基酸序列分析發(fā)現，NfAKR基因ORF可編碼304個氨基酸殘基，預測分子量為33.51 kD。NfAKR蛋白具有醛酮還原酶超家族(Aldo_ket_red_superfamliy)結構域(圖4)，此功能保守區(qū)的存在與醛酮還原酶的還原作用密切相關。

NfAKR基因編碼蛋白是醛酮還原酶超基因家族中的一員，具有氧化還原活性。經檢索發(fā)現，來源于側生藻(Fisherallesp.)、彎曲單岐藻(Tolypothrixcampylonemoides)、單歧藻(Tolypothrixsp. PCC 7601)、聚球藻(Synechococcussp. PCC 7502)、發(fā)毛針藻(CrinaliumepipsammumPCC 9333)、單歧偽枝藻(ScytonematolypothrichoidesVB-61278)、微毛藻(Microchaetesp.PCC7113)和假魚腥藻(PseudanabaenabicepsPCC 7429)等物種的AKR 蛋白與本研究克隆的NfAKR基因編碼蛋白的相似性較高。用ClustalX2.1軟件對這些物種的氨基酸序列進行比對，發(fā)現它們在保守位置具有25個活性位點，其中第32、34、57、102 位的Asp、Tyr、Lys 和His氨基酸殘基為保守的具有催化活性的部位(圖5)。

M. DL2000；N.陰性對照；1～2. PCR產物圖2 NfAKR基因陽性質粒PCR驗證M. DL2000; N. Negative control；1～2. PCR productsFig.2 PCR products from positive plasmid of NfAKR gene

M. DL2000；N.陰性對照；1～2. PCR產物; M. DL2000；1. 未酶切質粒；2. HindⅢ 單酶切；3～4.BamHI/ HindⅢ雙酶切圖3 NfAKR基因陽性質粒酶切結果M. DL2000；1. Non-digested plasmid；2.HindⅢ digested plasmid；3～4. BamHI/ HindⅢdigested plasmidFig.3 Enzyme digestion of positive plasmid of NfAKR gene

圖4 NfAKR蛋白保守結構域Fig.4 Prediction of the conserved domain of NfAKR

黑色表示序列完全相同，灰色表示部分相同，下劃線區(qū)為醛酮還原酶結構域序列；FspAKR、TspAKR、TcAKR、SspAKR、CeAKR、StAKR、PbAKR、MspAKR和NfAKR分別為側生念珠藻、單歧藻、彎曲單岐藻、聚球藻、發(fā)毛針藻、單歧偽枝藻、假魚腥藻、微毛藻和發(fā)狀念珠藻AKR氨基酸序列圖5 醛酮還原酶氨基酸序列的多重比對Black area donates the same sequence，gray area donates partial matching，the underline marks domain sequences in AKR proteins;FspAKR, TspAKR, TcAKR, SspAKR, CeAKR, StAKR, PbAKR, MspAKR and NfAKR represent amino acid sequence of AKR from Fischerella sp.PCC9605, Tolypothrix sp. PCC 7601, Tolypothrix campylonemoides, Synechococcus sp. PCC 7502, Crinalium epipsammum PCC 9333, Scytonema tolypothrichoides VB-61278, Pseudanabaena biceps PCC 7429,Microchaete sp.PCC7113 and Nostoc flaglliforme，respectivelyFig.5 Multiple alignment of the deduced amino acid sequences of AKRs

根據GOR4在線軟件預測，NfAKR蛋白二級結構由45.07%的α-螺旋(alpha helix )、9.87% β-折疊(extended strand)和45.07% 無規(guī)則卷曲(random coil)組成。其中α-螺旋和無規(guī)則卷曲是NfAKR蛋白的主要組成部分，而β-折疊則散布在蛋白序列中。三維結構以印度蛇根草醛酮還原酶(PDB ID: 3v0u _A) 為模型，通過SWISS-MODEL 進行同源建模(圖6)。整個蛋白由10個α-螺旋和11 條β-折疊組成。α-螺旋在外部，延伸主鏈在內部，中間形成1個疏水穴，構成酶的活性中心。

2.3 NfAKR基因的系統(tǒng)進化分析

為進一步分析發(fā)狀念珠藻 NfAKR 蛋白與其他物種相關蛋白的進化關系，采用MEGA 5軟件，對10種不同物種的AKR蛋白進行同源比對，構建進化樹。結果顯示，發(fā)狀念珠藻與點形念珠藻(Nostocpunctiforme)、側生藻(Fisherallesp.)、單岐藻(Tolypothrixcampylonemoides)、聚球藻(Synechococcussp.)和假魚腥藻(Pseudomonasp.)聚為一支，與點形念珠藻親緣關系最近。而藍桿藻(Cyanothecesp.)金囊藻(Gloeocapsasp.)、單歧偽枝藻(Scytonematolypothrichoides)和微毛藻(Microchaetesp.)聚類為另外一支(圖7)。

A. 二級結構預測； B. 利用SWISS-MODEL建立的三維結構圖6 NfAKR蛋白的結構分析和建模A. Secondary structure prediction; B. Three-dimensional structure based on SWISS-MODELFig.6 Structural analysis and modeling of NfAKR

節(jié)點上的數值表示Bootstrap重復1 000次的置信度；標尺表示演化距離圖7 NfAKR蛋白系統(tǒng)進化樹分析Values at nodes show the confidence level of bootstrap replication 1 000；scaleplate represents the evolution distance of these algasFig.7 Phylogenetic analysis of NfAKR protein

2.4 PEG-6000脅迫下NfAKR基因表達

圖8 PEG-6000脅迫下NfAKR基因的表達分析Fig.8 Expression analysis of NfAKR gene under PEG-6000 drought-stress

采用實時熒光定量RT-PCR技術分析了不同濃度PEG-6000模擬干旱處理下NfAKR的表達情況(圖8)。在 PEG-6000脅迫處理下，發(fā)狀念珠藻NfAKR基因隨PEG-6000濃度的增加上調表達。在PEG-6000濃度為4% 時，NfAKR基因開始誘導表達，并持續(xù)上升。 PEG-6000濃度為8%時，基因的表達量出現峰值5.66。當PEG-6000濃度為10%時，NfAKR表達量下降。說明在高濃度PEG-6000脅迫下，細胞受到損傷嚴重，NfAKR基因的表達受到抑制。

3 討 論

AKR是一類胞質蛋白，存在于原核及真核細胞中，大部分AKR家族成員都與細胞保護、腫瘤形成及診斷有關。AKR具有解毒功能，能夠把有毒的醛或酮轉變成醇，進而避免細胞受到醛、酮的毒害[11]。目前關于AKR的研究，大都集中在免疫及腫瘤方面。牛瑩瑩等[12]研究發(fā)現AKR1C3基因會抑制細胞的生長，損傷動物肝腎，可為癌癥的診斷和治療提供依據。同時也有研究發(fā)現，AKR2A在各種脅迫中起到調控脅迫蛋白的作用，當植物遭受鹽脅迫和損傷時，AKR2A表達量呈現上升趨勢[13]。這表明植物細胞中各細胞器能夠協(xié)調抗脅迫防護的能力，在遭受非生物脅迫，如鹽、氧化脅迫及損傷脅迫時。AKR可通過表達量的增加或活性的升高對緩解脅迫起積極作用。

本試驗對分離到的發(fā)狀念珠藻NfAKR基因編碼氨基酸序列分析發(fā)現，該蛋白在保守位置有25個活性位點，這與醛酮還原酶超基因家族的成員特征相符[14-16]。在三維結構分析中發(fā)現，該蛋白由10個α-螺旋和11條β-折疊主鏈組成。α-螺旋在外部，β-折疊在內部，中間形成1 個疏水穴，形成酶的催化活性中心。通過進化分析發(fā)現，發(fā)狀念珠藻與點形念珠藻、側生藻、單岐藻等物種親緣關系較高，從進化樹中所處的位置看它們可能是從一個祖先分化而產生的多重分支。

發(fā)狀念珠藻NfAKR基因受干旱脅迫誘導，隨PEG-6000脅迫濃度增加，表達量增加并達到峰值。但隨脅迫濃度繼續(xù)增加，細胞相關組分受到干旱傷害，以致NfAKR基因表達量在高濃度PEG-6000模擬干旱脅迫時降低，這可能因為高濃度PEG-6000模擬干旱增加了細胞生長環(huán)境的干旱程度，細胞內成分因嚴重缺水而損傷，基因的表達呈下降趨勢。這和本實驗室研究的NfPrx[17]和NfGR基因受干旱脅迫時的表達特性一致。表明植物耐旱能力的形成是由多個基因協(xié)同參與形成的，耐逆性調節(jié)基因的上調表達在一定程度上提高了植物的耐逆能力。在抵御外界干旱環(huán)境過程中，NfAKR發(fā)揮一定作用。有關受逆境脅迫時, NfAKR與其他相關蛋白協(xié)同參與清除活性氧、參與跨膜運輸和信號傳導的具體的耐逆機制，需要進一步研究。

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(編輯:宋亞珍)

Gene Cloning and Expression ofNfAKRfromNostocflagelliforme

YUE Sijun1, LI Zhixue2, FAN Hongli1, ZHOU Juan1, LIANG Wenyu1, ZHENG Rui1*

(1 College of Life Sciences, Ningxia University, Key Lab of Ministry of Education for Protection and Utilization of Special Biological Resources in Western China, Yinchuan 750021, China; 2 First Medium Occupation Technical School of Lhasa City，Lhasa 850000，China)

Full-length of open reading frame sequence encoding aldo-keto reductases was cloned fromNostocflagelliformecells with PCR. The gene was named asNfAKR. Sequence analysis showed that the complete open reading frame ofNfAKRwas 912 bp, which encoded 304 amino acids residues. The relative molecular mass of NfAKR was 33.51 kD, and its isoelectric point was 4.94. NfAKR protein had the aldo ket red superfamliy domain, and the three-dimension structure was composed by 10 α-helices and 11 β-sheets，among which there was a hydrophobic cavity as catalytic active site. Phylogenetic analysis showed that aldo-keto reductase fromN.flagelliformeandN.punctiformehad high similarity. Quantitative real-time PCR analysis showed that the expression ofNfAKRgene was up-regulated under drought stress of PEG-6000.When the concentration of PEG-6000 was 8%, the relative expression was 5.66, reaching the peak value. TheNfAKRexpression was upregulated, suggesting that aldo-keto reductase plays a certain role in the process of resisting drought stress inN.flagelliforme.

Nostocflagelliforme; aldo-keto reductase; gene cloning; drought stress; expression analysis

1000-4025(2016)12-2370-06

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.12.2370

2016-07-11;修改稿收到日期:2016-10-10

國家自然科學基金(31360025，31360361，31360054)；寧夏大學研究生創(chuàng)新項目(GIP201611)

岳思君(1972-)，男，博士，副教授，碩士研究生導師，主要從事微生物學研究。E-mail: sijunyue@126.com

*通信作者:鄭 蕊，博士，副教授，碩士研究生導師，主要從事植物生物技術研究。E-mail: xlzheng@126.com

Q785;Q786

A