王金章 翁育偉 嚴(yán)延生

350001福州，福建省疾病預(yù)防控制中心福建省人獸共患病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

登革2型病毒E基因DⅢ區(qū)的原核表達(dá)及血清學(xué)診斷應(yīng)用

王金章 翁育偉 嚴(yán)延生

350001福州，福建省疾病預(yù)防控制中心福建省人獸共患病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

目的表達(dá)登革2型病毒E基因DⅢ區(qū)重組蛋白并應(yīng)用于血清登革病毒IgM抗體檢測。方法構(gòu)建包含登革2型病毒E基因DⅢ區(qū)片段的重組表達(dá)質(zhì)粒，并在E．coli BL21（DE3）中表達(dá)，利用重組蛋白建立間接ELISA法用于血清登革病毒IgM抗體檢測。結(jié)果成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒并表達(dá)重組蛋白，純化的重組蛋白用于血清登革病毒IgM抗體檢測，以IFTA作為參照標(biāo)準(zhǔn)，靈敏度為93.75%，特異度為91.25%；與Panbio Dengue IgM Capture ELISA試劑盒檢測結(jié)果相比，二者具有較高的一致性（χ2＝0.214，P＞0.05；Kappa＝0.825）。結(jié)論在大腸桿菌中成功表達(dá)登革2型病毒E基因DⅢ區(qū)重組蛋白，并能夠應(yīng)用于血清登革病毒IgM抗體檢測。

Fund programs：National High?tech R＆D Program of China（863 Program）（2011AA02A114）；National Science and Technology Major Project of China（2012ZA10004?210）；Fujian Provincial Medical Innovation Project（2015?CXB?13）

登革熱（Dengue fever，DF）是一種經(jīng)蚊媒傳播的急性自然疫源性傳染病。人體感染4種血清型的登革病毒（DENV）后多數(shù)病例癥狀和體征較輕，但少數(shù)病例可發(fā)展成為嚴(yán)重的、病死率高的登革出血熱、登革休克綜合征［1］。近年來隨著商旅活動的頻繁和全球氣候條件的變化，DF病例不斷擴(kuò)散，已有128個(gè)國家和地區(qū)約39億人口受到DENV的威脅［2］。自1978年我國廣東省佛山市首次報(bào)告DF暴發(fā)疫情以來，近幾十年DF在我國的分布范圍逐漸擴(kuò)大，但主要集中在廣東、廣西、福建、云南、海南等東南沿海地區(qū)［3，4］。由于DF的輸入不確定性、突發(fā)性等原因易導(dǎo)致誤診、漏診，從而導(dǎo)致疫情發(fā)現(xiàn)和處理不及時(shí)造成疫情的蔓延，因此，實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果成為發(fā)現(xiàn)DF疫情的關(guān)鍵，通過快速準(zhǔn)確的早期檢測技術(shù)及時(shí)發(fā)現(xiàn)并控制傳染源是有效開展DF防治的重要基礎(chǔ)［5］。

由于DF的病毒血癥期很短，抗原檢測方法受采樣時(shí)間限制較大，血清抗體診斷方法成為目前的主要早期診斷方法［6］。近年來，已有多家國內(nèi)外試劑公司成功研制并推出了相應(yīng)的商品化試劑盒，但這些試劑盒要么靈敏度和特異度不夠理想，要么價(jià)格昂貴、采購困難，難以在基層普及。本研究旨在通過在大腸桿菌（Escherichia coli，E．coli）中表達(dá)登革2型病毒（DENV2）E基因DⅢ區(qū)截短多肽，獲得高表達(dá)量、高免疫反應(yīng)性的重組蛋白，以純化后的重組蛋白為抗原建立登革病毒IgM抗體的間接ELISA檢測方法，應(yīng)用于DF的早期診斷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株、表達(dá)載體、菌毒株和標(biāo)本：E．coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自大連TAKARA公司，C6／36細(xì)胞、載體質(zhì)粒pET?30a（＋）、E．coli BL21（DE3）、DENV2（NGC）病毒株和待檢血清標(biāo)本（包括80份正常人血清、80份DF、6份乙腦、9份流行性出血熱、10份恙蟲病、15份瘧疾、5份黃熱病、8份甲肝患者血清）均為本實(shí)驗(yàn)室所保存。

1.1.2 主要試劑、耗材：細(xì)胞培養(yǎng)所用試劑購自美國HyClone公司；One step RT?PCR試劑盒、QIAamp Viral RNA Mini Kit購自德國QIAGEN公司；NdeI和XhoI限制性內(nèi)切酶、DNA Ligation Kit購自大連TAKARA公司；蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)（低）、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒均購自北京TIANGEN公司；空白的酶標(biāo)板條、封閉液、樣品稀釋液、酶標(biāo)二抗及酶稀釋液由廈門英科新創(chuàng)公司提供。Dengue IgM Capture ELISA試劑盒（以下簡稱Panbio試劑盒）購自澳大利亞Panbio公司。

1.2 方法

1.2.1 引物合成：E蛋白DⅢ區(qū)片段RT?PCR擴(kuò)增引物引入NdeI和XhoI酶切位點(diǎn)（劃線部分）并由TAKARA公司合成，正向引物序列5′?TTTCATATG GCAGAAACACAA?3′，反向引物序列5′?TATCTCG AGTTGGCCGATAGA?3′。

1.2.2 病毒培養(yǎng)及抗原片制作：C6／36細(xì)胞在含10%胎牛血清（FBS）的1640培養(yǎng)液中于5%CO2、28℃條件下培養(yǎng)至單層后，接種DENV2 NGC病毒株，靜置吸附1 h，加入含2%FBS的1640培養(yǎng)液，置于5%CO2、28℃條件下培養(yǎng)至出現(xiàn)細(xì)胞病變，收集培養(yǎng)上清，細(xì)胞用以制作抗原片備用，方法參照文獻(xiàn)［7］。

1.2.3 E蛋白DⅢ區(qū)基因片段的獲得：取140 μl培養(yǎng)上清提取病毒RNA，提取方法參照QIAGEN公司QIAamp Viral RNA Mini Kit說明書；E蛋白DⅢ區(qū)基因片段RT?PCR擴(kuò)增方法參照QIAGEN公司One step RT?PCR試劑盒說明書；擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化方法參照TIANGEN公司瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書。

1.2.4 E蛋白DⅢ區(qū)基因重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建：純化后E蛋白DⅢ區(qū)基因片段及表達(dá)載體pET30a（＋）經(jīng)NdeI、XhoI雙酶切后，按TAKARA公司DNA Ligation Kit說明書連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E．coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布含50 μg／ml卡那霉素（Kan）的LB培養(yǎng)皿，置于37℃培養(yǎng)箱過夜孵育后挑取單菌落，于含Kan 50 μg／ml的LB培養(yǎng)液37℃搖床160 rpm振蕩孵育過夜后，提取質(zhì)粒并做NdeI、XhoI雙酶切鑒定。鑒定正確的重組質(zhì)粒送TAKARA公司測序，測序結(jié)果分析用LaserGene軟件包進(jìn)行。

1.2.5 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及免疫反應(yīng)性鑒定：重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E．coli BL21（DE3），待重組菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期時(shí)，加入1 mmol／L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)15%SDS?PAGE分析鑒定，然后經(jīng)電洗脫純化，以15%SDS?PAGE評價(jià)重組蛋白的純化效果，用Western blot對其進(jìn)行免疫反應(yīng)性鑒定，SDS?PAGE電泳、電洗脫純化及Western blot操作參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》［8］進(jìn)行。

1.2.6 間接免疫熒光（IFTA）檢測臨床血清：利用1.2.2中制成的抗原片，80份DF感染者血清和80份正常人血清標(biāo)本用0.01 mmol／L PBS按1∶100稀釋后作為一抗，以FITC標(biāo)記的羊抗人IgM做為二抗，操作步驟參見文獻(xiàn)［6，9］。

1.2.7 重組蛋白建立ELISA檢測待檢血清并對結(jié)果進(jìn)行分析：用100 ng／孔的純化重組蛋白作為抗原建立間接ELISA檢測方法（以下簡稱iELISA）對待測血清進(jìn)行檢測，具體操作參見文獻(xiàn)［7，10］。以IFTA結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)比較，計(jì)算iELISA檢測登革病毒IgM抗體的靈敏度和特異度；與Panbio試劑盒檢測登革病毒IgM抗體結(jié)果比較，計(jì)算Kappa值，判斷兩種ELISA法檢測結(jié)果的一致性，差異性比較用χ2檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)取α＝0.05。通過對53份確診其他疾病的血清抗體進(jìn)行檢測，了解iELISA與其他病原體相關(guān)抗體的交叉反應(yīng)情況。

2 結(jié)果

2.1 E基因DⅢ區(qū)的擴(kuò)增及構(gòu)建的重組質(zhì)粒酶切鑒定E基因DⅢ區(qū)的擴(kuò)增片段（D2E?DⅢ）長度264 bp，NdeⅠ／XhoⅠ雙酶切后D2E?DⅢ與載體pET30a（＋）構(gòu)成的重組質(zhì)粒命名為pET30a?D2E?DⅢ，pET30a?D2E?DⅢ用NdeⅠ／XhoⅠ雙酶切后電泳，D2E?DⅢ片段插入載體pET30a（＋）前后的位置一致。同時(shí)對插入片段的測序結(jié)果表明，其序列與DENV2（NGC）株相應(yīng)位置的序列完全相符，表明目標(biāo)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功（圖1）。

1：100?6 000 bp Wide Range DNA Marker；2：酶切后的D2E?DⅢ；3：酶切后的pET30a?D2E?DⅢ；4：酶切后的pET30a圖1 重組質(zhì)粒pET30a?D2E?DⅢ的NdeI／XhoI雙酶切1：100?6 000 bp Wide Range DNA Marker；2：D2E?DⅢdigested by NdeI／XhoI；3：pET30a?D2E?DⅢdigested by NdeI／XhoI；4：pET30a digested by NdeI／XhoIFig.1 Identification of the recombinant plasmid pET30a?D2E?DⅢby digestion with NdeI／XhoI

A：15%SDS?PAGE；B：Western blot免疫反應(yīng)性鑒定1：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)（低）；2：純化前的重組蛋白；3：純化后的重組蛋白；4：pET30a表達(dá)產(chǎn)物（對照）圖2 重組蛋白15%SDS?PAGE及Western blot分析鑒定A：Analysis results by 15%SDS?PAGE；B：Immune reactivity by Western blot1：Protein Molecular Weight Marker（Low）；2：recombinant protein before purification；3：purified recombinant protein；4：expression of pET30a（control）Fig.2 Analysis of the recombinant proteins by 15%SDS－PAGE and Western blot

2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與Western blot免疫反應(yīng)性鑒定重組質(zhì)粒pET30a?D2E?DⅢ及pET30a分別轉(zhuǎn)化于BL21（DE3）經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，用15%SDS?PAGE電泳，結(jié)果如圖2（A）所示：10kDa附近有一條明顯的蛋白帶，與預(yù)期分子量9.75 kDa相符；另在20kDa附近也同時(shí)出現(xiàn)一條明顯的蛋白帶，切取10kDa附近蛋白電洗脫純化后的15%SDS?PAGE電泳結(jié)果也同樣在20 kDa附近出現(xiàn)這一蛋白帶，表明這一蛋白帶是重組蛋白所形成的多聚體。重組蛋白Western blot免疫反應(yīng)性鑒定在10 kDa和20 kDa附近均有特異性反應(yīng)帶出現(xiàn)，位置與15%SDS?PAGE電泳結(jié)果相一致（圖2），說明重組蛋白具有較好的免疫反應(yīng)性，且在經(jīng)電洗脫純化后仍保留相應(yīng)的免疫反應(yīng)性。

2.3 重組蛋白的應(yīng)用

2.3.1 重組蛋白應(yīng)用于檢測登革病毒IgM抗體：構(gòu)建的iELISA、IFTA及Panbio試劑盒檢測80份DF感染者血清、80份正常人血清登革病毒IgM，具體結(jié)果見表1。以IFTA為金標(biāo)準(zhǔn)，iELISA檢測登革病毒IgM的靈敏度為93.75%，特異度為91.25%；以Panbio試劑盒為參比試劑對照，iELISA與其檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝0.214，P＞0.05），且兩檢測方法具有較高的一致性（Kappa＝0.825）；所有DF感染者待檢血清中經(jīng)PCR分型確認(rèn)型別的標(biāo)本分別有DENV1型11份、DENV2型13份、DENV3型8份，這些血清經(jīng)iELISA與Panbio試劑盒檢測IgM抗體均為陽性，提示iELISA無法用于血清分型。

表1 iELISA、IFTA及Panbio試劑盒檢測160份待測血清登革病毒IgMTab.1 Detection of anti?dengue virus IgM in 160 serum specimens by the iELISA，IFTA and Panbio Dengue IgM Capture ELISA

2.3.2 重組蛋白與其他病原體相關(guān)抗體的交叉反應(yīng)：本研究另收集了乙腦、流行性出血熱、恙蟲病、瘧疾、黃熱病、甲肝患者血清共53份，通過iELISA與Panbio試劑盒同時(shí)對這些標(biāo)本進(jìn)行檢測，結(jié)果如表2所示，iELISA未發(fā)現(xiàn)對流行性出血熱的交叉反應(yīng)；兩個(gè)檢測方法均對恙蟲病和瘧疾存在交叉反應(yīng)。

表2 iELISA交叉反應(yīng)分析Tab.2 Cross reaction analysis of iELISA constructed

3 討論

登革病毒E蛋白包含了3個(gè)結(jié)構(gòu)域（DomainⅠ?Ⅲ），其中DⅢ區(qū)含有多個(gè)中和表位和宿主細(xì)胞受體識別位點(diǎn)，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生有效的中和抗體［11］，因此國內(nèi)外的研究者常把E蛋白DⅢ區(qū)作為檢測試劑研發(fā)的候選抗原。Simmons等成功表達(dá)了登革病毒DIII區(qū)重組蛋白并建立了具有較高的敏感性和特異性的登革病毒抗體間接ELISA檢測方法［12］。以大腸桿菌為宿主的原核表達(dá)系統(tǒng)具有成本低，繁殖快等優(yōu)點(diǎn)，但由于密碼子使用偏好等原因可導(dǎo)致某些基因無法在大腸桿菌中表達(dá)［13］，為了減少稀有密碼子對表達(dá)過程的影響，本研究選擇E基因DⅢ區(qū)的截短片段，通過原核表達(dá)系統(tǒng)獲得高產(chǎn)量的重組蛋白，應(yīng)用于血清學(xué)檢測。

IFTA具有敏感性高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，能夠較正確的對血清中登革病毒IgM抗體進(jìn)行判斷，本研究選用IFTA作為金標(biāo)準(zhǔn)能較準(zhǔn)確的判斷iELISA的靈敏度和特異度。另外澳大利亞Panbio公司試劑盒是目前國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室常用的登革病毒IgM抗體檢測試劑盒，以該試劑盒作為參比對照，能夠較為直觀的了解本研究ELISA方法的應(yīng)用前景。將兩種方法與iELISA方法對既往保存80份的DF陽性血清及80份正常人血清進(jìn)行登革病毒IgM檢測，結(jié)果顯示iELISA具有較高的靈敏度和特異度，通過χ2檢驗(yàn)顯示其與Panbio試劑盒的檢測差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，檢測結(jié)果具有效高的一致性。因此，本研究所獲得的重組蛋白及所建立的間接ELISA檢測方法能在DF早期檢測有良好的應(yīng)用前景。

從iELISA檢測結(jié)果上看，所獲得的重組蛋白將無法應(yīng)用于血清學(xué)分型，但由于其對多個(gè)血清型的DF均能產(chǎn)生免疫反應(yīng)，這也為研制通用型的DF檢測試劑提供了便利；為了解重組蛋白與其他傳染病血清抗體之間交叉反應(yīng)的情況，收集53份此類標(biāo)本對進(jìn)行檢測方法的進(jìn)一步驗(yàn)證，該重組蛋白可對瘧疾、恙蟲病產(chǎn)生交叉反應(yīng)，但并不明顯；在未來的研究中還需對試劑的組裝條件、檢測流程等進(jìn)行優(yōu)化，并通過進(jìn)一步增加檢測標(biāo)本量來評估檢測方法的可靠性。

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Prokaryotic expression and serological diagnosis application of the domainⅢregion of Dengue virus type 2 envelope glycoprotein

Wang Jinzhang，Weng Yuwei，Yan Yansheng

Fujian Provincial Center for Disease Control and Prevention，F(xiàn)uzhou 350001，China

Yan Yansheng，Email：yysh＠fjcdc．com．cn

ObjectiveTo express the domainⅢof Dengue virus type 2 envelope glycoprotein in Escherichia coli．a(chǎn)nd establish an in?house diagnostic assay for IgM antibodies against dengue viruses.MethodsThe DNA fragment for domainⅢof the envelope glycoprotein was amplified bv RT?PCR and cloned into vector pET?30a（＋），so as to construct the expression plasmid pET30a?D2E?DⅢ.The recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli competent cells BL2l（DE3）and induced by IPTG.The expressed products were analyzed by SDS?PAGE and Western blot.Purified by electroelution，the recombinant protein was attempted to establish an indirect ELISA assay for IgM antibody against dengue viruses.in?house ELISA assay was assessed by conventional IFTA or Panbio Dengue IgM Capture ELISA.ResultsThe 264 bp in length DNA fragment for domainⅢwas amplified and the expression plasmid pET30a?D2E?DⅢwas successfully constructed and expressed in E．coli BL2l（DE3）.The indirect ELISA assay obtained a sensitivity of 93.75%and a specificity of 91.25%by comparing with IFTA.Furthermore，the in?house ELISA assay was consistent with results by using Panbio Dengue IgM Capture ELISA（χ2＝0.214，P＞0.05，Kappa＝0.825）.ConclusionsThe expression plasmid pET30a?D2E?DⅢis stably expressed in E．coli BL2l（DE3）and the recombinant protein is suitalbe as a component antigen in serum diagnosis of dengue virus infection.

Dengue virus；DomainⅢ；Recombinant protein；Gene expression

嚴(yán)延生，Email：yysh＠fjcdc.com.cn

10.3760／cma.j.issn.1003?9279.2016.06.000

登革病毒；DⅢ區(qū)；重組蛋白；基因表達(dá)

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）（2011AA02A114）；國家科技重大專項(xiàng)（2012ZA10004?210）；福建省醫(yī)學(xué)創(chuàng)新課題（2015?CXB?13）

2016?07?07）