孫海青 李俊紅 張劍 王蕻馨 朱俊萍 婁金麗

100069北京，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院（孫海青、李俊紅、張劍、王蕻馨、婁金麗）；首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系（朱俊萍）

2014年北京佑安醫(yī)院手足口病病原譜分析

孫海青 李俊紅 張劍 王蕻馨 朱俊萍 婁金麗

100069北京，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院（孫海青、李俊紅、張劍、王蕻馨、婁金麗）；首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系（朱俊萍）

孫海青與李俊紅共同第一作者

目的分析首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院2014年手足口病（hand?foot?and?mouth disease，HMFD）的病原譜組成，為HMFD的防治提供科學(xué)依據(jù)。方法利用LIS系統(tǒng)對(duì)北京佑安醫(yī)院2014年HMFD相關(guān)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分析全年HFMD病原譜特征。結(jié)合PCR測(cè)序及生物信息學(xué)分析對(duì)部分分型未知腸道病毒（enterovirus，EV）進(jìn)行核酸分型。結(jié)果2014年首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院HMFD確診病例全年2031例，男女病患比率約1.5∶1。病原譜構(gòu)成EV?A71（34.6%）、CVA16（34.6%）和其他未分型EV（30.8%）。該年度HMFD發(fā)病高峰期為4?8月，期間HFMD病原譜中EV?A71、CVA16和未分型EV的構(gòu)成比分別為：46.5%／30.8%／22.7%；41.3%／29.6%／29.1%；31.8%／38.4%／29.8%；32.6%／36.1%／31.3%和30.9%／37.4%／31.7%，各月份間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝24.866，P＝0.002＜0.05）。高發(fā)期內(nèi)HFMD患者以5歲以下兒童居多，且年齡越小發(fā)病率越高。53例未分型EV經(jīng)基因測(cè)序分析，33例鑒定出型別，其中CVA10、CVA6比例較高，且可引發(fā)重癥。結(jié)論 2014年首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院HFMD病原譜中仍以EV?A71和CVA16為主，未分型EV也占據(jù)相當(dāng)比例，且其中CVA10、CVA6檢出率較高，并可引發(fā)重癥。

Fund program：Scientific Research Project of Beijing Educational Committee（KM201410025005）

手足口?。╤and?foot?and?mouth disease，HMFD）是由多種腸道病毒（enterovirus，EV）引起的常見感染性疾病，腸道病毒71型（Enterovirus A71，EV?A71）和柯薩奇病毒A組16型（Coxsackievirus A16，CVA16）是HFMD最主要的病原體，二者常相伴引起疾病的暴發(fā)流行。HMFD多發(fā)于5歲以下嬰幼兒，主要臨床癥狀包括發(fā)熱和手、足、口等部位的皮疹、皰疹，伴或不伴口腔潰瘍，病情嚴(yán)重者可引起心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜腦炎等致命性并發(fā)癥。研究發(fā)現(xiàn)，80%以上的HFMD重癥和死亡病例與EV?A71的感染有關(guān)［1］。而EV?A71也因其與神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的發(fā)生密切相關(guān)而成為繼脊髓灰質(zhì)炎病毒之后最受關(guān)注的EV。近年來由除EV?A71和CVA16外的其他EV感染所引起的HFMD也逐漸被認(rèn)識(shí)和關(guān)注。我們對(duì)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院2014年1?12月全年HFMD確診患者資料進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，并在該年度HFMD高發(fā)期隨機(jī)抽取未分型EV感染相關(guān)的53例HFMD患者咽拭子標(biāo)本，通過核酸提取、EV基因組保守區(qū)擴(kuò)增以及測(cè)序分析進(jìn)行了EV分型。初步分析了2014年HFMD高發(fā)期的其他EV的病原譜特征，為本地區(qū)HFMD防控工作的開展提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象2014年1?12月間首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院門診及住院部確診為HFMD的病例。本研究通過首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京市佑安醫(yī)院倫理委員會(huì)通過，所有患者簽署知情書。

1.1.1 病例：診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2010年《手足口病診療指南》［2］及經(jīng)分子診斷為EV陽(yáng)性的病例（熒光探針法）。①普通病例：手、足、口、臀部皮疹，伴或不伴發(fā)熱。②重癥病例：出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)受累表現(xiàn)。精神差、嗜睡、易驚、譫妄；頭痛、嘔吐；肢體抖動(dòng)，肌陣攣、眼球震顫、共濟(jì)失調(diào)、眼球運(yùn)動(dòng)障礙；無力或急性弛緩性麻痹；驚厥。體征可見腦膜刺激征，腱反射減弱或消失。③危重型：癥狀：①頻繁抽搐、昏迷、腦疝。②呼吸困難、紫紺、血性泡沫痰、肺部啰音等。③休克等循環(huán)功能不全表現(xiàn)。

1.2 儀器與試劑檢驗(yàn)科分子診斷采用的病毒采樣管購(gòu)自友康生物科技（北京）有限公司，熒光定量PCR擴(kuò)增儀（CFX96）為美國(guó)Bio?Rad公司產(chǎn)品，EV核酸檢測(cè)試劑盒為廣州達(dá)安生物有限公司產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)室采用的病毒RNA提取試劑盒QIAamp Viral RNA Kit購(gòu)自Qiagen公司、逆轉(zhuǎn)錄酶SuperScriptⅡ購(gòu)自Invitrogen公司、隨機(jī)引物購(gòu)自Promega公司、RNA酶抑制劑，高保真DNA聚合酶，dNTP和DTT購(gòu)自TaKaRa公司。普通PCR儀為美國(guó)Bio?Rad公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 檢驗(yàn)科EV分子診斷分析：按照達(dá)安公司試劑盒說明書提取樣本RNA，逆轉(zhuǎn)錄和利用其自帶的EV通用型引物，EV?A71和CVA16特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，反應(yīng)條件：40℃25 min，1個(gè)循環(huán)；94℃3 min，1個(gè)循環(huán)；93℃15 s，55℃45 s，40個(gè)循環(huán)，在55℃時(shí)收取熒光。讀取結(jié)果，檢測(cè)樣本無典型S型曲線或Ct值＞35為陰性，樣本呈典型S型曲線且Ct值≤35則為陽(yáng)性。

1.3.2 未分型EV實(shí)驗(yàn)室核酸檢測(cè)及比對(duì)分析：按QIAamp Viral RNA Kit操作指南提取標(biāo)本中的病毒RNA；逆轉(zhuǎn)錄獲得病毒基因組cDNA。逆轉(zhuǎn)錄體系包括病毒RNA 11 μl、隨機(jī)引物1 μl、dNTP 1 μl、5倍濃度的反應(yīng)緩沖液4 μl、0.1 mmol／L的DTT 2 μl、RNA酶抑制劑0.5 μl。反應(yīng)條件：65℃5 min后加入逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μl，25℃，10 min；42℃1 h；70℃10 min。以此cDNA為模板，應(yīng)用EV通用引物擴(kuò)增，正向引物5′CAAGCACTTCTGTTTCCCCGG3′；反向引物5′ATTGTCACCATAAGCAGCCA3′［3］；PCR產(chǎn)物全長(zhǎng)435 bp。PCR反應(yīng)體系為25 μl，包括水18.5 μl、10倍濃度的反應(yīng)緩沖液2.5 μl，dNTP2 μl，上下游引物各1 μl（100μg／ml），病毒cDNA2 μl，高保真DNA聚合酶0.5 μl。PCR反應(yīng)條件：94℃2 min，94℃30 s，50℃30 s，72℃1 min，39個(gè)循環(huán)；72℃5 min，1個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物以1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。PCR產(chǎn)物測(cè)序由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成。EV保守區(qū)序列經(jīng)在線比對(duì)后進(jìn)行EV分型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)性分布采用R×C列聯(lián)表χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.001為差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料2014年全年HFMD確診病例共2031例，男性1 233例，女性798例，男女之比約為1.5∶1。病原檢測(cè)結(jié)果：EV?A71陽(yáng)性703例（34.6%），CVA16陽(yáng)性703例（34.6%）和EV分型不明（unkonwn）625例（30.8%）。

2.2 時(shí)間分布及HFMD高發(fā)期病原譜組成及變化

2014年全年各月均有HFMD發(fā)病，其中4?8月為發(fā)病高峰期，該期總發(fā)病例數(shù)為1 710，占全年發(fā)病總數(shù)的84.2%，見圖1A。EV?A71、CVA16和未分型EV三類病原構(gòu)成比在HFMD低發(fā)的1?3月和9?12月間變化較大；而在疾病高發(fā)期4?8月間呈現(xiàn)平穩(wěn)趨勢(shì)（圖1B，1C）。如圖2A所示，2014年HFMD從3月份后發(fā)病例數(shù)驟升，4?8月為發(fā)病高峰期，之后病例數(shù)驟減，11月份發(fā)病人數(shù)略有回升之后又趨于回落。4?8月間HFMD病原譜EV?A71、CVA16和未分型EV的構(gòu)成比雖呈平緩趨勢(shì)，但其間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝24.866，P＝0.002）。4月份EV?A71構(gòu)成比最高，達(dá)46.5%，之后逐漸下降至6月份的31.8%，隨后持平；而此期間CVA16則由4，5月份的30.8%、29.6%攀升至6月份的38.4%，之后趨于平緩；未分型EV從4月份的22.7%上升至5月份的29.1%之后趨于平緩?？傮w看，2014年HFMD高發(fā)期EV?A71，CVA16和其他EV檢出率比例相近。

圖1 2014年全年不同病原HFMD發(fā)病情況Fig.1 The incidence of different HFMD pathogens in 2014

2.3 年齡分布如圖3所示，2014年HFMD高發(fā)期4?8月間HFMD患者以5歲以下兒童居多，約占總病例數(shù)的85.6%（1464／1710），且隨著年齡增長(zhǎng)，發(fā)病數(shù)逐漸下降。

圖2 2014全年HFMD病原構(gòu)成比情況Fig.2 The composition ratio of HFMD pathogens in 2014

圖3 2014全年HFMD病原構(gòu)成比情況Fig.3 The composition ratio of HFMD pathogens in 2014

圖4 2014年4?8月HFMD患者年齡分布Fig.4 The age distribution of HFMD patients from April to August in 2014

2.4 53例分型未知EV基因測(cè)序分析結(jié)果 從2014年HFMD高發(fā)期隨機(jī)抽取53例確診EV陽(yáng)性但分型未知的HFMD病患進(jìn)行后續(xù)分析。男：女比例約為2：1；其中輕癥48例，重癥5例。從病患咽拭子提取病毒RNA，逆轉(zhuǎn)錄后經(jīng)EV 5′UTR區(qū)基因擴(kuò)增并測(cè)序分析EV分型。其中33例（包括輕癥29例和重癥4例），分型成功，如圖4所示：CVA10，15例（46%）；CVA6，10例（30%）；CVA4，4例（12%）；EV?A71，CVA2，CVA5和CVA12各1例（分別占3%）。

29例輕癥病例中包括CVA10，14例；CVA6，8例；CVA4，3例；EV?A71，CVA12，CVA5和CVA2各1例。4例重癥病原分型為CVA6，2例；CVA4和CVA10各1例。

圖5 33例其他EV相關(guān)HFMD患者病原譜組成Fig.5 The pathogen spectrum of 33 other EV

3 討論

自2008年以來HFMD的發(fā)病和死亡病例數(shù)一直位居我國(guó)丙類法定傳染病之首，疾病的預(yù)防和控制成為重要的公共衛(wèi)生內(nèi)容。研究發(fā)現(xiàn)HFMD可由多種EV引起。而近年我國(guó)HFMD病原譜正呈現(xiàn)日益復(fù)雜的局面。目前部分HFMD相關(guān)病原的疫苗正在研發(fā)［4］，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所的EV?A71滅活疫苗已于2016年3月22日在北京市朝陽(yáng)區(qū)正式進(jìn)行首針接種，但疫苗何時(shí)能夠?qū)崿F(xiàn)普種和實(shí)際臨床療效尚不清楚。因此持續(xù)實(shí)施流行病學(xué)監(jiān)測(cè)和病原譜特征分析對(duì)HFMD防控策略的制定仍然十分重要。

本研究對(duì)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院2014年全年2 031例確診HFMD患者資料進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)HFMD全年發(fā)病，男女比例約1.5∶1。對(duì)發(fā)病高峰期4?8月間病例進(jìn)行年齡分析發(fā)現(xiàn)：5歲以下兒童為主要發(fā)病人群，且年齡越小發(fā)病率越高。這些數(shù)據(jù)均與之前和近期流行病學(xué)報(bào)告相似［5?7］。2014年全年HFMD病原譜構(gòu)成為：EV?A71（34.6%），CVA16（34.6%）和未分型EV（30.8%）。自3月份HFMD病例數(shù)明顯攀升，EV?A71從所占比例最高，經(jīng)4?6月逐漸降低趨于平緩，而此期間CVA16的比例逐漸攀升，呈現(xiàn)此消彼長(zhǎng)的態(tài)勢(shì)。其他EV在HFMD高發(fā)期早期的病原譜構(gòu)成中略有增長(zhǎng)，隨后趨于平緩。ZHU等報(bào)告［8］，2007?2009三年中北京地區(qū)HFMD病原譜構(gòu)成經(jīng)歷了EV?A71構(gòu)成比由低（19%）到高（56%）再降低（29%）的波動(dòng)。CVA16和EV?A71交替成為年度主要病原。而其他EV構(gòu)成比則呈現(xiàn)6%到22%及16%的增高及波動(dòng)。田樹萍［9］研究首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院HFMD病原譜構(gòu)成中，發(fā)現(xiàn)相較2011和2012年，2013年中EV?A71、CVA16檢出率降低，而未分型EV檢出率明顯升高。我們將2014年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)與前兩年比較發(fā)現(xiàn)：3年間HFMD患者EV?A71，CVA16和未分型EV構(gòu)成比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝653.4，P＜0.001）：2014年EV?A71檢出率（34.6%）高于2013年（18.5%）但低于2012年（35.3%），CVA16檢出率（34.6%）高于2012（22.6%）、2013年（11.5%），未分型EV檢出率（30.8%）則低于2012（42.1%）、2013年（70%）（P均＜0.001）。提示近3年來北京地區(qū)HFMD病原譜構(gòu)成波動(dòng)明顯，總體仍以EV?A71和CVA16檢出為主，與國(guó)內(nèi)大部分地區(qū)HFMD主要病原分布趨勢(shì)相符，但未分型EV占據(jù)較大比例，尤其2013年未分型EV出現(xiàn)占比高峰。

中國(guó)大陸有記錄的HFMD散發(fā)和流行從80年代起，早期階段以CVA16為主要病原，后來CVA16和EV?A71伴行，到2008年全國(guó)范圍內(nèi)的HFMD大流行以EV?A71為主要病原。HFMD流行過程中，除CVA16和EV?A71以外，其他類型EV在HFMD病原譜中的占比日益凸顯。例如：2001?2004年深圳地區(qū)HFMD病原譜中CVA16，EV?A71和其他EV三者比例約為2：1.2：1。2007年山東臨沂HFMD大流行中其他型別EV僅占病原譜的2%［10］，而該地區(qū)2009?2011年其他型別EV比例從21%升至49%［11］。不僅如此，在近年HFMD流行中其他EV的種類也明顯增加，包括：CVA2、4?6、9、10、12，CVB1、3?5和ECHO6、7、11、13、19、25、30等［10?13］。柴青等［14］發(fā)現(xiàn)，2010?2012年青島地區(qū)HFMD病原除主要的EV?A71和CVA16外，其他共流行EV中CVA10檢出率明顯增高。深圳2009?2013年HFMD數(shù)據(jù)［15］顯示，2010年以后輕癥HFMD主要由CVA6感染引起，EV?A71、CVA16逐漸被取代。而Wei等［16］發(fā)現(xiàn)浙江醫(yī)科大學(xué)兒童醫(yī)院2010?2012年間HFMD病原中由其他未分型EV引起病毒性腦炎和皰疹性咽峽炎的病例逐漸上升。提示未分型EV在HFMD發(fā)病中的作用不容忽視，明確EV分型也愈發(fā)重要。為此我們選取2014年HFMD高發(fā)期部分未分型EV進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該時(shí)段內(nèi)未分型EV病原中以CVA10為主，占可分型病例的46%；其次是CVA6，占30%；再次是CVA4，占12%；另有少量CVA2，CVA5和CVA12等。初步顯示北京佑安醫(yī)院2014年HFMD發(fā)病高峰期未分型EV呈現(xiàn)一定多樣性，且以柯薩奇病毒A組成員為主，尤其是CVA10和CVA6。其中4例重癥的EV分型分別為：CVA6，2例；CVA4和CVA10各1例。提示2014年北京佑安醫(yī)院由其他EV引起的HFMD不僅占據(jù)一定比例（30.8%），且在疾病高發(fā)期呈現(xiàn)多樣性，其中為主的CVA10、CVA6還可引起重癥。2013年北京地壇醫(yī)院的報(bào)告［17］指出，HFMD病原譜中CVA6占43%，成為最主要的病原體，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過EV?A71（14.8%）和CVA16（3.9%）。與近年CVA6在我國(guó)多地HFMD暴發(fā)流行中成為主要病原趨勢(shì)相仿［18，19］。綜上提示近年北京地區(qū)及全國(guó)范圍內(nèi)HFMD持續(xù)高發(fā)期間病原譜變化明顯，非EV?A71和CVA16的其他EV病原比例及多樣性日益增加，并與重癥發(fā)生有關(guān)，應(yīng)引起足夠重視。尤其在疾病高發(fā)期，多種病原共流行的狀況可為EV間的重組變異提供有利條件。近年來，HFMD相關(guān)EV種內(nèi)或種間發(fā)生基因重組的報(bào)道屢見不鮮［20］。

另外，該研究中發(fā)現(xiàn)的2014年北京地區(qū)HFMD流行病學(xué)的時(shí)間分布特征與之前報(bào)告基本相符，春夏高發(fā)，同一年不同月份及不同年份中優(yōu)勢(shì)流行毒株此消彼長(zhǎng)，交替成為病原譜中的主要流行毒株。尤其值得關(guān)注的是2014年HFMD春夏高發(fā)期過后，9月和12月出現(xiàn)兩次病原譜中其他EV構(gòu)成比的高峰。推測(cè)秋冬季的儲(chǔ)備可能為來年其他EV多樣性的增加提前做了準(zhǔn)備。因此應(yīng)持續(xù)觀察該其他EV相關(guān)的構(gòu)成比小高峰是否持續(xù)穩(wěn)定存在，尤其不能忽視對(duì)其他EV多樣性的持續(xù)監(jiān)測(cè)。鑒于病原譜的復(fù)雜多變及EV重組現(xiàn)象的普遍存在，適時(shí)建立精確、全面的EV分型及重組監(jiān)測(cè)的方法，檢測(cè)相關(guān)病原的分子進(jìn)化對(duì)HFMD的有效防控是非常必要的。

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The pathogen spectrum analysis of HFMD in 2014 in Beijing Youan Hospital，

Sun Haiqing，Li Junhong，Zhang Jian，Wang Hongxin，Zhu Junping，Lou Jinli

Beijing Youan Hospital，Capital Medical University，Beijing 100069，China（Sun HQ，Li JH，Zhang J，Wang HX，Lou JL）；Department of Medical Microbiology，School of Basic Medical Sciences，Capital Medical University，Beijing 100069，China（Zhu JP）

Sun Haiqing and Li Junhong，are the first author who contributed equally to the article

Zhu Junping，Email：jpzhu＠ccmu．edu．cn；Lou Jinli，Email：13718641405＠163．com

ObjectiveTo analyze the pathogen spectrum of hand?foot?and?mouth disease（HMFD）in 2014 in Beijing Youan Hospital for providing scientific basis for the prevention of HFMD.MethodsThe related data of HFMD in 2014 was analyzed by LIS system，including the characteristics of pathogen spectrum.The other enterovirus（EV）was partially identified by DNA sequencing analysis.ResultsThe number of confirmed HMFD cases in 2014 was 2031，and the proportion of male and female patients was about 1.5∶1.The pathogen spectrum of HMFD was EV?A71（34.6%），CVA16（34.6%）and other EV（30.8%）.The HMFD peak of incidence was from April to August in 2014.During the period，the compositionratios of EV?A71，CVA16 and other enterovirus were respectively 46.5%／30.8%／22.7%；41.3%／29.6%／29.1%；31.8%／38.4%／29.8%；32.6%／36.1%／31.3%和30.9%／37.4%／31.7% in each month.The difference among them was statistically significant（chi?square＝χ2＝24.866，P＝0.002＜0.05）.During the period of high incidence of HFMD，the predominant patients were the children under five years old，the younger the age，the higher the incidence rate.ConclusionsThe major causitive agents of HFMD in 2014are still EV?A71 and CVA16.The other EV encounters a considerable proportion and the incidence of CVA10 and CVA6is relatively higher，which could cause severe cases of HFMD.

Hand?foot?and?mouth disease；Epidemiology；Pathogen spectrum

朱俊萍，email：jpzhu＠ccmu.edu.cn；婁金麗，Email：13718641405＠163.com

10.3760／cma.j.issn.1003?9279.2016.06.000

手足口??；流行病學(xué)；病原譜

北京市教委科研計(jì)劃項(xiàng)目（KM201410025005）

2016?04?26）