張光際，楊 凡，時(shí) 樂，尹 蓮，徐 立（南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南京 210023）

克方的急性毒性和長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)研究Δ

張光際＊，楊 凡，時(shí) 樂，尹 蓮，徐 立（#南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南京 210023）

目的：考察克方的急性毒性和長(zhǎng)期毒性，為其臨床試驗(yàn)與合理用藥提供參考。方法：將20只ICR小鼠隨機(jī)分為克方組（350 g/kg）和正常對(duì)照組（飲用水），每組10只，每天ig給藥2次（間隔8 h），連續(xù)14 d，進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)。將120只SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（飲用水）和克方高、中、低劑量組[5、2.5、1.25 g（生藥）/ml]，每組30只（♀♂各半），每天ig給藥2次（間隔8 h），連續(xù)12周，進(jìn)行長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果：克方最大耐受量為350 g/kg，相當(dāng)于臨床人用量的140倍。與正常對(duì)照組比較，克方高劑量組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢、攝食量減少（P＜0.05或P＜0.01）；雄性大鼠血中紅細(xì)胞分布寬度、血紅蛋白含量分布寬度、平均血紅蛋白濃度降低，血小板平均體積、網(wǎng)織紅細(xì)胞升高（P＜0.05或P＜0.01），但均在本實(shí)驗(yàn)室正常生理值范圍內(nèi)；克方高劑量組大鼠血中尿素氮、總膽紅素、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性升高（P＜0.05或P＜0.01），恢復(fù)期大鼠未見異常；給藥12周后，克方中、低劑量組大鼠凝血酶原時(shí)間縮短（P＜0.05或P＜0.01）；克方高劑量組發(fā)現(xiàn)8只大鼠膀胱黏膜上皮細(xì)胞輕、中度變性和壞死、脫落，恢復(fù)期無異常。結(jié)論：克方在臨床140倍用量下對(duì)小鼠未見明顯毒性作用。克方連續(xù)重復(fù)給藥12周后，對(duì)大鼠肝臟、腎臟代謝有影響；具有一定的可逆性膀胱毒性；恢復(fù)期大鼠各項(xiàng)檢查未見病變加深或遲發(fā)性病變。

克方；急性毒性；長(zhǎng)期毒性；大鼠；小鼠

國醫(yī)大師周仲瑛教授根據(jù)多年的臨床觀察與治療經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)出肺癌的關(guān)鍵癌毒因素在于痰濁、瘀血、氣逆，肺之氣陰兩虛是肺癌發(fā)生、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。因此，他確立治則重在標(biāo)實(shí)祛邪、正虛治本，治法重在化痰泄?jié)?、活血祛瘀、行氣降逆以及益氣養(yǎng)陰，進(jìn)而總結(jié)出了一種治療肺癌的臨床經(jīng)驗(yàn)方——克方。克方由冬瓜子、法夏、膽南星、山慈菇、貓爪草、金蕎麥、魚腥草、仙鶴草、蘇木、紅花、沙參、玉竹、麥冬等13味中藥組成。其中，法半夏等燥濕化痰；金蕎麥、魚腥草軟堅(jiān)散結(jié)；仙鶴草、紅花活血化瘀；沙參、麥冬益氣養(yǎng)陰?？朔脚R床用量為163 g（生藥）/d，煎煮后口服。為了在臨床更好地推廣和使用湯藥，本實(shí)驗(yàn)從動(dòng)物急性毒性實(shí)驗(yàn)和長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)兩個(gè)方面對(duì)克方進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)[1-3]。

1 材料

1.1 儀器

ADVIA 2120全自動(dòng)血液分析儀（德國Siemens公司）；7100全自動(dòng)生化分析儀（日本日立公司）；全自動(dòng)凝血分析儀（法國Stago公司）；BX41光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；BSA323S-CW分析天平（德國Sartorius集團(tuán)）。

1.2 藥品

克方[南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥化學(xué)教研室自制，棕褐色流浸膏，批號(hào)：20140916，規(guī)格：5 g（生藥）/ml]。

1.3 動(dòng)物

ICR小鼠20只，SPF級(jí)，♀♂各半，體質(zhì)量18～22 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001]；SD大鼠120只，SPF級(jí)，♀♂各半，體質(zhì)量60～80 g，購自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SCXK（浙）2014-0001]。

1.4 實(shí)驗(yàn)環(huán)境

南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物中心批準(zhǔn)使用許可證號(hào)：SYXK（蘇）2014-0001]。給藥前，動(dòng)物先飼養(yǎng)、觀察1周。給藥后，同組每5只同性別動(dòng)物合籠，用全價(jià)顆粒飼料（江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程責(zé)任有限公司供給）喂養(yǎng)，自由飲水。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（23±3）℃、濕度為50%～65%。

2 方法

2.1 急性毒性實(shí)驗(yàn)

取ICR小鼠20只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后以隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為正常對(duì)照組和克方給藥組?？朔浇o藥組小鼠每天ig給藥2次，藥液質(zhì)量濃度為5 g（生藥）/ml，每次給藥量為35 ml/kg，兩次給藥間隔8 h；正常對(duì)照組小鼠ig等體積飲用水。連續(xù)觀察14 d，記錄小鼠行為、活動(dòng)、體質(zhì)量、糞便、死亡等情況。觀察期間若發(fā)生小鼠瀕死或死亡，則及時(shí)解剖進(jìn)行尸檢觀察；未死亡小鼠于2周后處死，進(jìn)行尸檢觀察。

2.2 長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)

取SD大鼠120只（♀♂各半），適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后以隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為正常對(duì)照組和克方高、中、低劑量組，每組30只（♀♂各半）?？朔礁?、中、低劑量組大鼠每天2次以7 ml/kg分別ig 5、2.5、1.25 g（生藥）/ml克方水煎液（分別對(duì)應(yīng)成人臨床劑量的28、14、7倍劑量），正常對(duì)照組大鼠ig等體積飲用水，2次給藥間隔8 h。連續(xù)給藥12周后，每組取大鼠20只（♀♂各半），麻醉后腹主動(dòng)脈取血，作血常規(guī)、凝血四項(xiàng)及血液生化指標(biāo)測(cè)定。然后頸椎脫臼處死并解剖大鼠，作主要臟器的肉眼觀察、臟器系數(shù)計(jì)算并進(jìn)行組織學(xué)檢查。恢復(fù)期停藥2周后，將剩余大鼠按上述要求進(jìn)行同樣檢查[4-8]。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以克方350 g（生藥）/kg（5 g/ml×35 ml/kg×2次）劑量1日內(nèi)分2次ig給藥的10只小鼠，僅給藥24 h內(nèi)見小鼠自發(fā)活動(dòng)減少，給藥24 h后恢復(fù)正常。在觀察時(shí)間內(nèi)一般情況良好，毛色光滑，活動(dòng)、攝食、糞便色澤與質(zhì)地均正常，活動(dòng)無減少；且2周內(nèi)無死亡及其它異?，F(xiàn)象發(fā)生。14 d后處死小鼠，解剖無肉眼可見的病理性改變。

3.2 長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 一般情況 在克方70、35、17.5 g（生藥）/kg 3個(gè)劑量連續(xù)對(duì)大鼠ig給藥12周及恢復(fù)期2周內(nèi)，各組大鼠一般情況均良好，外觀、行為、排泄物等方面均未見異常變化。

3.2.2 體質(zhì)量與攝食量 體質(zhì)量測(cè)定結(jié)果表明，克方高劑量組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢，從第2周開始體質(zhì)量與正常對(duì)照組大鼠比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；其余各組大鼠體質(zhì)量與正常對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。攝食量檢查結(jié)果表明，克方高劑量組大鼠的攝食量減少，雄性大鼠從第2周開始、雌性大鼠從第3周開始，其攝食量與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；其余各組大鼠的攝食量與正常對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3.2.3 血常規(guī) 給藥12周后，克方高、中、低劑量組雄性大鼠的紅細(xì)胞分布寬度（RDW）、平均血紅蛋白分布寬度（HDW）均顯著降低，克方高、中劑量組雌性大鼠網(wǎng)織紅細(xì)胞（RET）水平顯著升高，與正常對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）?；謴?fù)期，克方高、中、低劑量組雄性大鼠平均血小板體積（MPV）升高，克方高、中、低劑量組雌性大鼠平均血紅蛋白濃度（MCHC）降低，與正常對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。以上指標(biāo)的變化均在本實(shí)驗(yàn)室正常生理值范圍內(nèi)，與供試品無相關(guān)性。

3.2.4 血液生化 給藥12周后，克方高劑量組雄性大鼠尿素氮（BUN）水平升高，雌性大鼠天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酸（AST）水平升高；克方中、低劑量組雄性大鼠總膽紅素（TBIL）水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）?；謴?fù)期內(nèi)各組大鼠血液生化指標(biāo)均未見異常，這提示臨床用藥要密切注意這一項(xiàng)指標(biāo)的變化。其余有變化的血液生化指標(biāo)都是由于SD偏小所致，同時(shí)變化幅度均在10%內(nèi)，與供試品無相關(guān)性。

3.2.5 凝血四項(xiàng) 給藥12周后，克方中、低劑量組大鼠凝血酶原時(shí)間（PT）明顯縮短，與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；克方給藥組大鼠的其余凝血指標(biāo)與正常對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3.2.6 臟器系數(shù) 給藥12周及恢復(fù)期，各組大鼠心、肝、脾、肺、胸腺、腎、腎上腺、腦、子宮、卵巢、睪丸、附睪等臟器系數(shù)與正常對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3.2.7 尸檢及病理組織學(xué) 經(jīng)肉眼觀察，正常對(duì)照組和克方高、中、低劑量組大鼠各主要臟器均未見異常變化。光學(xué)顯微鏡觀察，克方高劑量組出現(xiàn)8只大鼠膀胱黏膜上皮細(xì)胞輕、中度變性和壞死、脫落，其中3只大鼠膀胱內(nèi)可見大量沉積物，與正常對(duì)照組比較有明顯差異。這提示克方在所設(shè)高劑量下對(duì)大鼠膀胱有一定的毒性；其余各臟器未見實(shí)質(zhì)細(xì)胞變性、壞死，未見間質(zhì)血管擴(kuò)張、充血、炎細(xì)胞浸潤(rùn)等病理變化。恢復(fù)期未見大鼠膀胱及其他臟器有病變，這說明克方在所設(shè)劑量下對(duì)大鼠有膀胱靶向毒性且具有可逆性。

4 討論

急性毒性實(shí)驗(yàn)中因克方毒性較小，預(yù)實(shí)驗(yàn)中無法測(cè)定其半數(shù)致死濃度（LD50），故測(cè)定其最大耐受量。在本實(shí)驗(yàn)中，小鼠灌服克方，一日最大耐受量為35 ml/（kg·d）×2次[350 g（生藥）/（kg·d），以正常人體質(zhì)量為65 kg計(jì)，相當(dāng)于成人臨床劑量的140倍]。小鼠給藥后24 h內(nèi)見自發(fā)活動(dòng)減少。其原因可能由于高劑量的藥物灌服后引起胃腸反應(yīng)且方中紅花、麥冬等有一定的中樞抑制作用導(dǎo)致。本方中的魚腥草、仙鶴草、蘇木、紅花、玉竹等藥均可單獨(dú)測(cè)出其LD50，組方配伍后無法測(cè)出克方ig給藥后的LD50，這表明克方配伍可有效降低單味藥毒性?？赡苡幸韵聝蓚€(gè)原因：一是方中山慈菇和貓爪草的解毒作用；二是方中冬瓜子、魚腥草、紅花、沙參、玉竹、麥冬等藥均有不同程度的免疫促進(jìn)作用，個(gè)藥間相互作用降低了整方毒性。根據(jù)本研究結(jié)果可知，克方在臨床140倍用量下未見對(duì)小鼠有明顯毒性反應(yīng)，這提示臨床用藥較為安全。

長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)中體質(zhì)量、攝食量的結(jié)果檢查可見，克方高劑量組大鼠攝食量減少、體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢?？赡苡幸韵聨讉€(gè)原因：（1）可能與所設(shè)克方高劑量組給藥的質(zhì)量濃度較高，影響了大鼠的胃腸活動(dòng)有關(guān)；（2）方中冬瓜子、法半夏等對(duì)胰蛋白酶有抑制作用，影響了大鼠進(jìn)食后的消化；（3）方中仙鶴草對(duì)大鼠在位小腸的蠕動(dòng)也有部分抑制作用，降低了小腸的收縮幅度和張力，影響動(dòng)物進(jìn)食后的排泄活動(dòng)。可見，可能是由于上述幾個(gè)因素影響了高劑量組大鼠的攝食量，進(jìn)而導(dǎo)致該組大鼠的體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢。

由血液生化指標(biāo)的檢查結(jié)果可見，給藥12周后僅見受試大鼠血清中BUN、TBIL、AST升高，這表明該方可能對(duì)肝、腎有一定的影響，這可能是由于半夏的肝、腎損傷毒副作用導(dǎo)致。但方中所用半夏為炮制品，毒副作用大大減輕，且停藥2周后，大鼠血液生化指標(biāo)恢復(fù)正常，這表明克方對(duì)動(dòng)物肝、腎功能指標(biāo)的影響具有可逆性，并提示臨床用藥時(shí)應(yīng)密切關(guān)注患者肝、腎相關(guān)指標(biāo)的變化，定期監(jiān)測(cè)。

由凝血四項(xiàng)的檢查結(jié)果可見，所設(shè)克方中、低劑量組連續(xù)給藥12周后，克方中劑量組大鼠PT縮短了0.56 s，低劑量組大鼠PT縮短了0.95 s，與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；然而克方高劑量組大鼠PT與正常對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），這可能與中藥多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)有關(guān)。方中法半夏、仙鶴草、麥冬等含有促凝血成分，而紅花中的紅花黃色素具有抗凝血作用，且抗凝血作用隨劑量的增加而增強(qiáng)。隨著克方給藥質(zhì)量濃度的升高，紅花中紅花黃色素的抗凝血作用增強(qiáng)，逆轉(zhuǎn)了法半夏、仙鶴草、麥冬等藥物的促凝血作用?？朔礁?、中、低劑量組大鼠連續(xù)ig給予克方12周后與正常對(duì)照組比較，凝血四項(xiàng)指標(biāo)僅見PT縮短，且都在正常值范圍內(nèi)；恢復(fù)期大鼠凝血四項(xiàng)指標(biāo)均無異常，且方中法半夏的凝血作用具有動(dòng)物種屬專一性，對(duì)人不產(chǎn)生促凝作用?？梢姡朔綄?duì)凝血四項(xiàng)的影響極小。

病理檢查發(fā)現(xiàn)，連續(xù)給藥12周后，所設(shè)克方高劑量組大鼠出現(xiàn)8只大鼠膀胱黏膜上皮細(xì)胞輕、中度變性和壞死、脫落，其中3只大鼠膀胱內(nèi)可見大量沉積物，與正常對(duì)照組比較有明顯差異。停藥2周后大鼠可恢復(fù)正常，這提示克方毒性的膀胱靶向性與可逆性。方中13種不同比例配伍的中藥尚未見有膀胱毒性的報(bào)道，且有研究證明方中魚腥草對(duì)膀胱炎有顯著的治療效果[9-10]。本實(shí)驗(yàn)所設(shè)高劑量達(dá)到臨床人用劑量的28倍，可能是由于隨著給藥的劑量增加，超過了治療量而產(chǎn)生了膀胱毒性，所設(shè)中、低劑量克方分別對(duì)應(yīng)臨床人用量的14、7倍，臨床人用量更接近所設(shè)低劑量，未見有明顯膀胱毒性。這提示臨床使用中應(yīng)嚴(yán)格控制使用劑量，謹(jǐn)遵醫(yī)囑。

綜上所述，克方毒副作用較小。臨床使用過程中應(yīng)在臨床醫(yī)師指導(dǎo)下定期監(jiān)測(cè)肝、腎功能指標(biāo)變化。由于方中含有仙鶴草，而仙鶴草中鶴草酚與食用油同服可增加鶴草酚的毒性，故建議臨床使用時(shí)叮囑患者清淡飲食。在克方安全性較好得到實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后，本實(shí)驗(yàn)后續(xù)將進(jìn)一步探討克方的有效性，并探討其可能的作用機(jī)制。

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Study on Acute Toxicity and Long-term Toxicity of Kefang

ZHANG Guangji，YANG Fan，SHI Le，YIN Lian，XU Li（College of Pharmacy，Nanjing University of TCM，Nanjing 210023，China）

OBJECTIVE：To investigate acute toxicity and long-term toxicity of Kefang（KF），and to provide reference for clinical trial and rational drug use.METHODS：20 ICR mice were randomly divided into KF group（350 g/kg）and normal control group（drinking water），with 10 mice in each group；they were given relevant medicine intragastrically，twice a day（every 8 h），for consecutive 14 d；acute toxicity test was conducted.120 SD rats were randomly divided into normal control group（drinking water），KF high-dose，medium-dose and low-dose groups[5，2.5，1.25 g（crude drug）/ml]，with 30 rats in each group（half male and half female）；treatment groups were given relevant medicine intragastrically twice a day（every 8 h），for consecutive 12 weeks；long-term toxicity was conducted.RESULTS：The maximum tolerated dose of KF was 350 g/kg，which was equal to 140 times as clinical human dosage.Compared to normal control group，body weight of rats in KF high-dose group increased slowly and food intake decreased（P＜0.05 or P＜0.01）；red blood cell distribution width（RDW），hemoglobin distribution width（HDW），mean hemoglobin concentration（MCHC）of male rats were all decreased，while mean platelet volume（MPV）and reticulocyte（RET）were increased（P＜0.05 or P＜0.01）；these indicators were all in normal physiological range of our laboratory. BUN，TBIL，AST and ALT acitivies of KF high-dose groups increased（P＜0.05 or P＜0.01），and no abnormal change was found during recovery period；12 weeks after medication，prothrombin time of KF medium-dose and low-dose groups shortened（P＜0.05 or P＜0.01）；mild and middle degeneration and necrosis，denudation of bladder epithelial cells were found in 8 rats of KF high-dose group，no abnormality was found during recovery period.CONCLUSIONS：There was no obvious toxic effect on the mice in the dose of 140 times of the clinical dose.Continuous 12-week administration of KF will influence liver and renal metabolism of rats；KF shows reversibility toxicity to bladder.No deeper lesions or delayed lesions is found in rats during recovery period.

Kefang；Acute toxicity；Long-term toxicity；Rat；Mice

R994.1

A

1001-0408（2016）34-4777-03

2016-05-30

2016-09-09）

（編輯：林 靜）

江蘇省社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目（No.BE2011848）；2015年度南京中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新風(fēng)險(xiǎn)基金項(xiàng)目（No.CX201505）

＊碩士研究生。研究方向：新藥安全性評(píng)價(jià)。E-mail：15861812316 @163.com

#通信作者：教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：代謝性疾病藥理和毒理學(xué)研究、新藥安全性評(píng)價(jià)。E-mail：xuliglp@126.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.34.08