耿 婭，鄧中平（上海中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全評(píng)價(jià)研究中心，上海 201203）

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在藥物性肝損傷生物標(biāo)志物研究中的應(yīng)用

耿 婭，鄧中平
（上海中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全評(píng)價(jià)研究中心，上海 201203）

臨床前藥物性肝損傷的評(píng)價(jià)存在靈敏性低和特異性差的問題，常產(chǎn)生假陰性結(jié)果和出現(xiàn)意外的毒性，是導(dǎo)致藥物終止開發(fā)甚至退市的重要原因之一。在藥物肝毒性臨床前研究中，可以利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的快速、靈敏、高通量等優(yōu)點(diǎn)，尋找和發(fā)現(xiàn)新的肝毒性生物標(biāo)志物，使藥物開發(fā)過程更為安全有效。本文對(duì)肝毒性生物標(biāo)志物的研究現(xiàn)狀，蛋白質(zhì)組學(xué)在生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)及驗(yàn)證等方面的技術(shù)發(fā)展進(jìn)行了綜述分析，并且著重歸納了該技術(shù)在中藥致肝損傷方面的生物標(biāo)志物研究中的應(yīng)用。與傳統(tǒng)評(píng)價(jià)方法相比，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)于發(fā)現(xiàn)新型肝潛在毒性生物標(biāo)志物具有不可替代的優(yōu)勢(shì)。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)結(jié)合其他組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，其在藥物肝毒性早期篩選、生物標(biāo)志物的臨床橋接等方面將取得突破性的進(jìn)展。

藥物性肝損傷；肝毒性；生物標(biāo)志物；蛋白質(zhì)組學(xué)

DOl：10.3867/j.issn.1000-3002.2016.04.013

在藥物不良反應(yīng)中，藥物性肝損傷（druginduced liver injury，DILI）約占9.5%［1］，很多臨床使用多年的中草藥所致的肝損傷病例報(bào)道也在逐年上升［2］。在DILI的臨床前評(píng)價(jià)中，由于目前常用的肝損傷評(píng)價(jià)指標(biāo)靈敏度不高及特異性差，常造成假陰性結(jié)果［3-4］，很多DILI是在臨床試驗(yàn)或藥物上市后的臨床應(yīng)用中才監(jiān)測(cè)到，對(duì)公眾健康造成了嚴(yán)重危害，導(dǎo)致藥物的終止開發(fā)甚至退市［5］。

傳統(tǒng)肝毒性研究主要采用體內(nèi)與體外評(píng)價(jià)體系，在敏感性和特異性方面存在很多局限。近年來，靶向、定量質(zhì)譜技術(shù)為檢測(cè)反映肝損傷新的生物標(biāo)志物提供了重要平臺(tái)。自2004年Wetmore和Merrick［6］首次將蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)應(yīng)用到毒理學(xué)研究以來，基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)越來越廣泛應(yīng)用到毒理學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，其中包括毒性生物標(biāo)志物的研究。本文從DILI生物標(biāo)志物的研究現(xiàn)狀，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在DILI蛋白標(biāo)志物的應(yīng)用進(jìn)展等方面進(jìn)行綜述。

1　肝毒性生物標(biāo)志物

理想的肝毒性生物標(biāo)志物應(yīng)有如下特點(diǎn)：肝特異性；其與病理變化的高度相關(guān)性；伴隨血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic pyruvic transaminase，GPT）和（或）谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-oxaloaletic transami?nase，GOT）變化的同時(shí)，能夠提供更多的肝毒性信息；適用于高通量篩選，具有便于檢測(cè)的商品化檢測(cè)平臺(tái)；便于采集樣本；不同種屬之間均發(fā)生變化，便于臨床前和臨床研究的橋接［7］。但是，現(xiàn)有肝毒性生物標(biāo)志物尚未能完全達(dá)到此標(biāo)準(zhǔn)。

1.1傳統(tǒng)肝毒性生物標(biāo)志物

傳統(tǒng)的肝毒性生物標(biāo)志物的檢測(cè)主要包括以下3方面：①與肝功能密切相關(guān)的指標(biāo)血清總膽紅素（serum total bilirubin，TBil）、血清白蛋白和凝血酶原時(shí)間等；②肝細(xì)胞毒性的生物標(biāo)志物GPT、GOT、山梨醇脫氫酶、谷氨酸脫氫酶和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶等；③評(píng)價(jià)肝膽管損傷的生物標(biāo)志物堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、γ谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶和5′-核苷酸酶等［8］。

目前在臨床上尚無法做到僅僅通過監(jiān)測(cè)某個(gè)生物標(biāo)志物而對(duì)DILI做出判斷，通常為以上指標(biāo)聯(lián)用以判定DILI的發(fā)生。如國(guó)際臨床病理檢測(cè)聯(lián)合協(xié)調(diào)委員會(huì)建議應(yīng)測(cè)試至少包括GPT、GOT、山梨醇脫氫酶、谷氨酸脫氫酶和總膽汁酸5個(gè)指標(biāo)中的2個(gè)，以及ALP、γ谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶、5′-核苷酸酶、TBil及總膽汁酸中的2個(gè)［9］。而在美國(guó)FDA發(fā)布的藥物肝毒性評(píng)價(jià)指導(dǎo)原則中提到的“海氏法則”指出，GPT或GOT與TBil的聯(lián)合升高提示可能有嚴(yán)重肝損傷的發(fā)生［10］。這些生物標(biāo)志物在實(shí)際臨床應(yīng)用中已使用多年，由于肝毒性領(lǐng)域的發(fā)展突飛猛進(jìn)，這些傳統(tǒng)的標(biāo)志物受限于特異性、靈敏度等方面的不足，已經(jīng)不能滿足現(xiàn)代藥物安全評(píng)價(jià)的需求，因此亟需發(fā)現(xiàn)新的肝毒性生物標(biāo)志物。

1.2新型肝毒性生物標(biāo)志物

近年來，利用組學(xué)技術(shù)和芯片技術(shù)等手段為肝毒性研究帶來了更多的潛在生物標(biāo)志物。Murayama等［11］在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型精氨酸酶以及線粒體鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶早于GPT和GOT的變化出現(xiàn)峰值；Miller等［12］發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞色素c在對(duì)乙酰氨基酚及D-半乳糖胺給藥的大鼠實(shí)驗(yàn)中，伴隨GPT及GOT的變化也達(dá)到峰值，是潛在的線粒體毒性的生物標(biāo)志物；Coles等［13］發(fā)現(xiàn)，谷胱甘酞-S-轉(zhuǎn)移酶α及π異構(gòu)體［14］主要位于肝小葉中心細(xì)胞，因此對(duì)肝代謝區(qū)的損傷更加敏感，可作為肝損傷恢復(fù)評(píng)價(jià)的生物標(biāo)志物。此外還有一些新的反映肝損傷的生物標(biāo)志物，如：嘌呤核苷酸磷酸酶、對(duì)氧磷酸、激肽原、蘋果酸脫氫酶、血清F蛋白、微小RNA及一些炎癥細(xì)胞因子等，但是其中大多數(shù)仍處于零星的研究階段，尚未得到廣泛驗(yàn)證，有待在臨床前及臨床試驗(yàn)中證實(shí)。另外，針對(duì)這些新的標(biāo)志物的檢測(cè)手段也有待完善。

2　蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在DlLl生物標(biāo)志物研究中的應(yīng)用

蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù)通過檢測(cè)正常與疾病狀態(tài)下表達(dá)差異的蛋白質(zhì)而成為發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物的重要途徑。雖然蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可以成功地確定候選生物標(biāo)志物，但是為確保這些蛋白質(zhì)在特定生理?xiàng)l件下的特異性，驗(yàn)證是必要的。驗(yàn)證包含2方面的內(nèi)容，一是評(píng)估其準(zhǔn)確性、特異性和范圍等，二是被驗(yàn)證的標(biāo)志物與臨床特征和結(jié)果的相關(guān)性。傳統(tǒng)的驗(yàn)證方法通常應(yīng)用基于免疫學(xué)技術(shù)的方法，如：免疫印跡法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)或免疫組織化學(xué)技術(shù)驗(yàn)證靶蛋白，目前這些方法已被廣泛應(yīng)用。但是，當(dāng)需要驗(yàn)證多個(gè)標(biāo)志物或樣本時(shí)傳統(tǒng)方法費(fèi)時(shí)且價(jià)格昂貴，而且并不是所有潛在的生物標(biāo)志物都有合適的抗體。因此，目前質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)技術(shù)（multiple reaction monitoring，MRM）或選擇性反應(yīng)監(jiān)測(cè)技術(shù)（selective reaction monitoring，SRM）被越來越多的應(yīng)用于生物標(biāo)志物的驗(yàn)證。MRM技術(shù)可以同時(shí)對(duì)多個(gè)蛋白進(jìn)行檢測(cè)且不需要制備抗體，在生物標(biāo)志物的確認(rèn)和驗(yàn)證階段都有極其重要的應(yīng)用［15-17］。Sakamoto等［18］研究證實(shí)了通過MRM技術(shù)檢測(cè)肝細(xì)胞色素P-450酶和UDP-葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶的可靠性。

2.1體外研究

大鼠是最常用的制備原代肝細(xì)胞的嚙齒類動(dòng)物。體內(nèi)毒性研究大部分是在大鼠中進(jìn)行的，因此對(duì)大鼠體內(nèi)蛋白表達(dá)的測(cè)定可直接和大鼠體外原代肝細(xì)胞的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)相結(jié)合。毒理蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明，放線菌酮可使絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶Akt（也被稱做蛋白激酶B）失活，以及抑制增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白的合成，從而誘發(fā)增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡［19］。Kikkawa等［20］比較了利用大鼠原代肝細(xì)胞和大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的肝毒性研究，體內(nèi)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激及線粒體能量代謝調(diào)節(jié)相關(guān)的幾個(gè)蛋白的變化，這和之前在大鼠原代肝細(xì)胞模型上檢測(cè)到的氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白的改變相一致，而氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白的改變發(fā)生在化合物特異性的組織病理學(xué)變化之前。因此，氧化應(yīng)激蛋白被認(rèn)為是可能的生物標(biāo)志物。Chevalier等［21］對(duì)比大鼠原代肝細(xì)胞在過氧化物酶增殖因子萘酚平（nafenopin）和表皮生長(zhǎng)因子作用下蛋白表達(dá)變化模式的不同，找出了毒蕈堿類乙酰膽堿受體3，中間絲波形蛋白和ATP合成酶β亞基等32種萘酚平誘導(dǎo)的蛋白，用于進(jìn)一步闡明過氧化物酶體增殖因子的致癌機(jī)制，并為非遺傳毒性致癌物的早期確定提供了毒理學(xué)標(biāo)志。這些研究結(jié)果同時(shí)也表明，利用大鼠原代肝細(xì)胞進(jìn)行的蛋白質(zhì)組學(xué)研究可以有助于早期肝毒性的檢測(cè)。

HepG2細(xì)胞分泌大量的血漿蛋白，如白蛋白、血清轉(zhuǎn)鐵蛋白、載脂蛋白和纖維蛋白原等，具有特異性的肝細(xì)胞功能［22］。Thome-Kromer等［23］通過對(duì)6種肝毒性和4種非毒性藥物的體內(nèi)外蛋白質(zhì)組學(xué)比較，發(fā)現(xiàn)雖然在體的種屬特異性和肝代謝動(dòng)力學(xué)過程不能被HepG2完全取代，在體大鼠肝中檢測(cè)到的13個(gè)潛在毒性標(biāo)志蛋白，其中的8個(gè)在HepG2中也能檢測(cè)到，因此認(rèn)為肝癌細(xì)胞系仍保留了肝的部分特異性功能，可作為一個(gè)有價(jià)值的潛在毒性篩選模型。但是，需要注意的是在HepG2中某些特異性功能，如細(xì)胞色素P-450酶的活性可能缺失［24］。因此，可能不適用于需要肝進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生毒性的外源性化合物的研究。

肝的主要功能之一是合成血清蛋白，細(xì)胞和組織的分泌產(chǎn)物反映了不同的病理生理狀態(tài)，并且易于在細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行檢測(cè)，因此也可作為潛在生物標(biāo)志物的來源。Lewis等［25］研究了乙醇對(duì)HepG2/C3A細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)的影響，所有的差異蛋白的表達(dá)與已知的乙醇體內(nèi)暴露結(jié)果相關(guān)聯(lián)，包括細(xì)胞凋亡及炎癥改變，說明該模型可用于識(shí)別潛在的毒性標(biāo)志物。Gao等［26］利用細(xì)胞色素P-450 酶3A4過表達(dá)的人永生化肝細(xì)胞基質(zhì)模型，研究了4種肝毒性化合物和4種非肝毒性物質(zhì)，將這8種物質(zhì)分別與細(xì)胞共培養(yǎng)20 h后，用液質(zhì)聯(lián)用串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)培養(yǎng)基發(fā)現(xiàn)，肝毒性化合物有2種蛋白BMSPTX-265和BMS-PTX-837的分泌明顯增加。隨后對(duì)20種化合物進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，這20種化合物BMSPTX-265的梯度和已知的安全性資料完全相關(guān)；而BMS-PTX-837則正確預(yù)測(cè)了20種化合物的19種（其中1例為假陰性）。這項(xiàng)研究表明，蛋白質(zhì)組學(xué)特別是分泌蛋白質(zhì)組分析可揭示潛在的肝毒性生物標(biāo)志物。

迄今，尚未見利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在人干細(xì)胞來源的肝細(xì)胞上進(jìn)行藥物毒性研究［27］。一方面是由于誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞在從來源細(xì)胞誘導(dǎo)成干細(xì)胞后，仍保留了部分來源細(xì)胞的表達(dá)特征；另一方面，將誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)成肝細(xì)胞的分化過程也很難完全重現(xiàn)肝細(xì)胞的表達(dá)譜，從而使該來源的肝細(xì)胞在毒理學(xué)研究方面有一定的局限性。但是，上述缺點(diǎn)如可以通過技術(shù)進(jìn)步得到改善甚至解決，那么人干細(xì)胞來源的肝細(xì)胞在個(gè)體化毒性測(cè)試方面會(huì)是很好的來源，使得針對(duì)個(gè)體的個(gè)性化研究成為可能。

2.2體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

在外源性化合物的肝毒性研究中，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)通常為28 d或90 d重復(fù)劑量毒性實(shí)驗(yàn)，甚至長(zhǎng)達(dá)6～9個(gè)月。而蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和傳統(tǒng)的毒性檢測(cè)技術(shù)相比，可能在更早的時(shí)間點(diǎn)或更低的劑量發(fā)現(xiàn)潛在的毒性作用。Fountoulakis等［28］用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)對(duì)乙酰氨基酚處理后的小鼠肝組織進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)35個(gè)蛋白表達(dá)發(fā)生變化，其中一些蛋白是對(duì)乙氨基酚的毒性代謝產(chǎn)物N-乙酰對(duì)苯醌亞胺的共價(jià)修飾靶蛋白，這提示了蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可鑒定毒性化合物的體內(nèi)靶蛋白。Koen等［29］進(jìn)行了進(jìn)一步研究。他們用14C-溴苯標(biāo)記的化合物喂飼小鼠，應(yīng)用雙向凝膠電泳（2-dimensional gel electrophore?sis，2-DE）技術(shù)分離肝蛋白，經(jīng)標(biāo)記的目標(biāo)蛋白可在凝膠上顯影。共檢測(cè)到33個(gè)溴苯標(biāo)記的蛋白質(zhì)，包括谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、蛋白二硫鍵異構(gòu)酶和肝型脂肪酸結(jié)合蛋白等。此外，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)還被用于對(duì)乙酰氨基酚、洛伐他丁、SKF-106689和脂多糖及雙氯芬酸鈉共注射等對(duì)肝影響的研究［30-33］。

由于不同報(bào)道中，所使用的模型、藥物以及針對(duì)的肝毒性類別的差異，在這些研究中需要將不同的藥物以及蛋白質(zhì)譜改變與所觀察到的肝毒性特征關(guān)聯(lián)起來。如Newsholme等［34］對(duì)Sprague-Dawley大鼠給予某嘧啶衍生物后，發(fā)現(xiàn)該藥物對(duì)大鼠肝毒性作用包括肝質(zhì)量顯著增加，彌散性嗜堿性粒細(xì)胞增多以及粗糙型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體增加。利用2-DE及質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)差異表達(dá)蛋白，從中發(fā)現(xiàn)12個(gè)上調(diào)蛋白和5個(gè)顯著下調(diào)蛋白，包括蛋氨酸及ATP代謝途徑中的蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶和膽固醇合成途徑中的線粒體HMG-CoA合成酶，從而揭示了這些蛋白的調(diào)節(jié)可能和上述觀察到的肝毒性有關(guān)。Yamamoto等［35］通過研究給藥后大鼠肝組織的蛋白表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白60、CA3和AK4等蛋白在4種肝毒性藥物（對(duì)乙酰氨基酚、胺碘酮、四環(huán)素和四氯化碳）介導(dǎo)的肝損傷中均發(fā)生改變，且變化與血液生化指標(biāo)及組織病理等傳統(tǒng)的毒性終點(diǎn)有關(guān)，說明蛋白質(zhì)組學(xué)分析可比較準(zhǔn)確地反映甚至預(yù)測(cè)藥物對(duì)肝的毒性。

鑒于不同組學(xué)技術(shù)在靈敏度及特異性等方面的互補(bǔ)性，Eun等［36］利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)來檢測(cè)5種已知會(huì)引起DILI的藥物〔吡嗪酰胺（pyra?zinamide，雷尼替丁（ranitidine），依那普利（enala?pril），氯丙嗪（carbamazepine，chlorpromazine）〕，對(duì)大鼠轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)譜的影響，通過兩者之間的比較，得到60種在2種方法中有一致表現(xiàn)的分子，這也將有助于新的DILI生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)。

上述研究主要基于體內(nèi)的整體蛋白質(zhì)表達(dá)，對(duì)細(xì)胞內(nèi)低豐度蛋白或疏水性蛋白如膜蛋白等，可以先對(duì)亞細(xì)胞器如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和微粒或細(xì)胞膜等的蛋白質(zhì)組進(jìn)行分離富集，從而避免了某些低豐度蛋白在全細(xì)胞蛋白裂解液中可能檢測(cè)不到的缺點(diǎn)［37］，并且針對(duì)某亞細(xì)胞器的蛋白質(zhì)組學(xué)研究可以更加精確地了解該亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的功能。Zgoda等［38］對(duì)苯巴比妥及3-甲基膽蒽（3-methylcholantrene）誘導(dǎo)所致肝毒性的小鼠進(jìn)行了細(xì)胞質(zhì)及微粒體亞細(xì)胞水平的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，從而發(fā)現(xiàn)這2種藥物對(duì)細(xì)胞質(zhì)及微粒體亞細(xì)胞水平上的蛋白質(zhì)譜有不同的作用。Venkatraman等［39］利用2-DE和藍(lán)色非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)研究了大鼠乙醇性肝損傷的肝線粒體蛋白質(zhì)組，對(duì)43個(gè)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行鑒定，包括涉及到能量代謝的β-氧化循環(huán)酶、氧化磷酸化系統(tǒng)的核編碼亞基、線粒體蛋白和氨基酸代謝。盧德趙等［40］也利用凝膠內(nèi)差異顯示電泳技術(shù)，研究激素誘導(dǎo)的腎陽虛大鼠肝線粒體蛋白質(zhì)組，發(fā)現(xiàn)腎陽虛動(dòng)物熱休克蛋白60和熱休克蛋白70、肌氨酸脫氫酶、氨甲酰磷酸合成酶、亞硫酸鹽氧化酶、ATP合酶、醛脫氫酶和NADH脫氫酶表達(dá)增加，而丙酮酸脫氫酶、α-酮戊二酸脫氫酶、脂酰輔酶A脫氫酶和鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)降低。這些指標(biāo)可能成為研究激素誘導(dǎo)的肝毒性的潛在標(biāo)志物。Lee等［41］也利用基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)在給予小鼠曲格列酮后，線粒體內(nèi)谷胱甘肽等蛋白的變化介導(dǎo)了曲格列酮的肝毒性。

由于肝合成大多數(shù)循環(huán)血漿蛋白，在肝細(xì)胞受損時(shí)血漿中的這類蛋白也會(huì)發(fā)生變化。因此，平行研究血漿與組織是研究肝毒性的有力手段。Wang等［42］利用2-DE和基質(zhì)輔助激光解吸電離-串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)對(duì)經(jīng)Z24（抗血管生成化合物，抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移）處理過和未經(jīng)處理的大鼠肝蛋白的差異表達(dá)和血漿蛋白的差異表達(dá)進(jìn)行了平行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給藥5 d后在血漿中檢測(cè)到的Z24肝毒性潛在的生物標(biāo)志物，可能為胎球蛋白B和精氨琥珀酸合成酶。Merrick等［43］在對(duì)乙酰氨基酚暴露后24 h的大鼠血清中也發(fā)現(xiàn)了這2種差異表達(dá)蛋白。Meneses-Lorente等［44-45］也利用2-DE和質(zhì)譜技術(shù)探究血漿中與脂肪變性相關(guān)的蛋白組成在給予某化合物前后的變化，發(fā)現(xiàn)在5 d的給藥時(shí)間內(nèi)，某些標(biāo)志物的變化早在給藥后6 h即出現(xiàn)，早于傳統(tǒng)生物標(biāo)志物的變化。這些新發(fā)現(xiàn)的標(biāo)志物，包括乙酰輔酶A生產(chǎn)途徑中的丙酮酸脫氫酶、苯丙氨酸羥化酶、2-氧代異戊酸脫氫酶以及三羧酸循環(huán)中的亞硫酸鹽氧化酶。另外，分子伴侶類似蛋白以及受葡萄糖調(diào)節(jié)的蛋白78的下調(diào)也與血漿對(duì)氧磷酶、白蛋白和過氧化物氧還酶peroxiredoxinⅣ等分泌蛋白的表達(dá)降低相符合。這些特征均可以用作潛在肝脂肪變性相關(guān)的生物標(biāo)志物的篩選。除了用肝勻漿以及血清作為蛋白質(zhì)組學(xué)研究DILI的來源，也有利用尿液蛋白作為研究DILI的來源［46-47］。

相較于體外實(shí)驗(yàn)，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)更能反映整個(gè)機(jī)體的變化，更接近實(shí)際情況。由于體內(nèi)系統(tǒng)是一個(gè)復(fù)雜的模型，藥物對(duì)肝的作用機(jī)制可能受到給藥途徑及其他器官等各種因素的制約，從而使得體內(nèi)實(shí)驗(yàn)所發(fā)現(xiàn)的肝毒性生物標(biāo)志物可能與體外實(shí)驗(yàn)的發(fā)現(xiàn)有所不同。如Macdonald等通過比較野生型和過氧化物酶體增殖因子激活受體無效小鼠在過氧化物酶體增殖因子作用下的蛋白表達(dá)，找出18種差異蛋白，包括有抗凋亡作用的葡萄糖調(diào)控蛋白94的組成性過表達(dá)［48］。兩種系統(tǒng)各有優(yōu)劣，如體內(nèi)實(shí)驗(yàn)保留了復(fù)雜體內(nèi)系統(tǒng)內(nèi)部的相互作用，而體外實(shí)驗(yàn)則可利用人來源的細(xì)胞。

2.3蛋白質(zhì)組學(xué)在中藥肝毒性生物標(biāo)志物中的應(yīng)用

中草藥是我國(guó)的傳統(tǒng)治療藥物，而40.3%的DILI為中草藥所致。因此，對(duì)中藥肝毒性的研究是正確使用中藥的基礎(chǔ)，也是中藥國(guó)際化的必由之路。利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究中藥對(duì)于各種疾病的影響已經(jīng)有諸多報(bào)道［49-50］，但是迄今利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的研究主要集中在藥物處理后血漿蛋白圖譜的變化，關(guān)于中藥肝毒性的研究報(bào)道較少。Goto等［51］對(duì)大鼠給予3%桂枝茯苓丸或3%當(dāng)歸芍藥散后，質(zhì)譜研究發(fā)現(xiàn)有3個(gè)質(zhì)譜峰在2種藥物處理后均有所增加。對(duì)血虛癥小鼠給予四物湯后，利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)也發(fā)現(xiàn)血清中有12個(gè)蛋白下調(diào)，4個(gè)蛋白（肌細(xì)胞增強(qiáng)蛋白，馬達(dá)蛋白，肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白和DNA依賴的蛋白激酶）上調(diào)［52］。扶正化瘀方灌胃治療大鼠肝纖維化，取肝組織進(jìn)行蛋白質(zhì)譜研究，從而發(fā)現(xiàn)30個(gè)差異表達(dá)蛋白，包括多種與代謝相關(guān)的蛋白［53］。另外，還有血府逐瘀湯治療氣滯血瘀證模型大鼠后血清蛋白質(zhì)的變化的報(bào)道［54］。

3　結(jié)語

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用在肝毒性化合物的分類中取得了令人興奮的成果，并根據(jù)這些分類揭示了潛在的蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物［55］。體外細(xì)胞模型在毒理學(xué)研究中已證明有很好的前瞻性，這些肝細(xì)胞模型的分泌蛋白質(zhì)組中包含了豐富的潛在生物標(biāo)志物，在培養(yǎng)基中易于測(cè)量，因此與臨床檢測(cè)具有良好的橋接性。利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)尋找肝毒性生物標(biāo)志物的過程中，也可結(jié)合在不同樣本之間發(fā)現(xiàn)的潛在標(biāo)志物。如肝組織或尿液中發(fā)現(xiàn)的潛在標(biāo)志物，可借鑒用于研究其在血漿中的變化；并且由于DILI可能表現(xiàn)在各個(gè)不同組織器官中，在多個(gè)組織中的研究也將有助于更加了解DILI損傷機(jī)制。在初步確立某些潛在標(biāo)志物后，需要在臨床及肝毒性相關(guān)的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中進(jìn)一步探索其可用性，從而使該標(biāo)志物具有更好的預(yù)測(cè)和診斷功能。同時(shí)，值得注意的是，單一蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的測(cè)定可能存在假陽性，因此可在獲得典型肝毒性藥物誘導(dǎo)的差異蛋白后，將這些生物標(biāo)志物進(jìn)行組合，并以此區(qū)分化合物特異性的毒性機(jī)制。另外，基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在某些物質(zhì)的檢測(cè)方面可能存在如下技術(shù)難點(diǎn)：①需要更高效的分離技術(shù)，有效的質(zhì)譜碎裂，快速準(zhǔn)確的質(zhì)譜鑒定法。如基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)到的肽段較少，不利于搜庫，無法進(jìn)行混合蛋白質(zhì)鑒定等；非標(biāo)記定量技術(shù)分析復(fù)雜樣品的能力有限，而標(biāo)記法則費(fèi)用昂貴，周期較長(zhǎng)等；②在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中起重要作用但豐度相對(duì)較低的磷酸化蛋白，需要通過富集再利用高分辨率質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)，而很多有潛力成為肝損傷生物標(biāo)志物的小分子代謝物質(zhì)，較難利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，也需要依靠其他檢測(cè)手段進(jìn)行補(bǔ)充。在迄今為止的研究中，除了某些蛋白質(zhì)的變化比較穩(wěn)定可以成為潛在的肝毒性生物標(biāo)志物，很多蛋白質(zhì)的變化只是在零星的文獻(xiàn)中得到報(bào)道，重復(fù)性比較差。這些物質(zhì)要作為新型生物標(biāo)志物，需要更具特異性和靈敏度的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)以及更大的樣本量去驗(yàn)證。隨著組學(xué)技術(shù)的發(fā)展和數(shù)據(jù)庫的整合，蛋白質(zhì)學(xué)組數(shù)據(jù)也可以和其他組學(xué)數(shù)據(jù)互補(bǔ)，如在基因表達(dá)譜與蛋白質(zhì)表達(dá)譜之間進(jìn)行比較互相驗(yàn)證，從而獲得更加可靠的生物標(biāo)志物，在DILI早期評(píng)價(jià)和臨床橋接等方面取得突破性的進(jìn)展［56］。

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（本文編輯：沈海南）

Application of proteomics to screening biomarkers of drug-induced liver injury

GENG Ya，DENG Zhong-ping
（Center for Drug Safety Evaluation and Research，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，China）

The preclinical safety assessment of hepatotoxicity drugs has a low sensitivity and low specificity.Related tests often generate false negative results and unexpected toxicity，which is one of the major reasons for the cessation of development and withdrawal from the market.Proteomics enjoys advantages of rapidness，high sensitivity and high throughout，and therefore can be used in the search for new biomarkers of hepatotoxicity in preclinical studies，leading to the development of safer drugs and a more efficient drug discovery process.In this review，the current preclinical biomark?ers of liver toxicity and development of proteomic technologies in the discovery and validation of bio?markers of drug-induced liver injury are described，in general the application of proteomics to Chinese medicine-induced liver toxicity in particular.Compared with traditional methods，proteomic technologies show promising results for the discovery of novel hepatotoxic markers.Proteomics，in conjugation with other omics techniques，will play a major role in the early stage of hepatotoxicity screening and will prove to be a good bridge in clinics in the future.

drug-induced liver injury；hepatotoxicity；biomarkers；proteomics

Foundation ltem：The project supported by National Science and Technology Major Project（2012ZX09505001-002）

DENG Zhong-ping，E-mail：dzp@shutcm.edu.cn，Tel：（021）51322401

R966，R575

A

1000-3002-（2016）04-0381-08

國(guó)家科技重大專項(xiàng)（2012ZX09505001-002）

耿 婭，女，博士研究生，主要從事中藥肝毒性研究。

鄧中平，E-mail：dzp@shutcm.edu.cn，Tel：（021）51322401

2015-12-22接受日期：2016-02-23）