梁偉杰，陳景福，何潔儀，宋明才，余盛龍，張穩(wěn)柱，鄭東誕，廖新學(xué)

(1. 廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院心血管內(nèi)科，2. 廣州市番禺區(qū)心血管疾病研究所，廣東 廣州　511400；3. 中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院黃埔院區(qū)心血管內(nèi)科CCU，廣東 廣州　510070；4. 中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東 廣州　510080)

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ATP敏感性鉀通道-Akt通路在硫化氫對抗高糖損傷H9c2心肌細(xì)胞中的作用

梁偉杰1,2，陳景福3，何潔儀1,2，宋明才1,2，余盛龍1,2，張穩(wěn)柱1,2，鄭東誕3，廖新學(xué)4

(1. 廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院心血管內(nèi)科，2. 廣州市番禺區(qū)心血管疾病研究所，廣東 廣州511400；3. 中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院黃埔院區(qū)心血管內(nèi)科CCU，廣東 廣州510070；4. 中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東 廣州510080)

摘要：目的研究ATP敏感性鉀通道(ATP-sensitive K+channel, KATP通道)-Akt通路在外源性硫化氫(hydrogen sulfide, H2S)對抗高糖引起的H9c2心肌細(xì)胞損傷中的作用。方法應(yīng)用Western blot法檢測心肌細(xì)胞Akt蛋白的表達(dá)水平；細(xì)胞計數(shù)盒測定心肌細(xì)胞存活率；Hoechst 33258核染色熒光顯微鏡照相測定凋亡細(xì)胞數(shù)量的變化；雙氯熒光素染色熒光顯微鏡照相法檢測胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平；JC-1染色熒光顯微鏡照相法測定線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential, MMP)。結(jié)果應(yīng)用高糖(35 mmol·L-1，HG)處理H9c2心肌細(xì)胞0～24 h，其中3 h起磷酸化(p)-Akt蛋白表達(dá)水平開始明顯下降，24 h p-Akt表達(dá)水平降至最低。在HG處理心肌細(xì)胞24 h前，應(yīng)用50μmol·L-1KATP通道開放劑吡拉地爾(pinacidil, Pin)和400 μmol·L-1硫氫化鈉(NaHS，為H2S的供體)預(yù)處理30 min均能明顯地抑制HG對p-Akt表達(dá)的下調(diào)作用。應(yīng)用1 mmol·L-1KATP通道阻斷劑格列本脲(glibenclamide, Gli)預(yù)處理心肌細(xì)胞能阻斷NaHS對HG下調(diào)p-Akt表達(dá)水平的抑制作用。此外，30 μmol·L-1Akt的抑制劑LY294002能明顯阻斷NaHS對抗HG損傷心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，表現(xiàn)為細(xì)胞存活率和MMP降低，凋亡細(xì)胞數(shù)量、ROS生成增多。結(jié)論KATP通道-Akt通路介導(dǎo)H2S對抗高糖引起的心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：ATP敏感性鉀通道；Akt通路；硫化氫；高血糖；損傷；心肌細(xì)胞

ATP敏感性鉀通道(ATP-sensitive K+channel, KATP通道)是受細(xì)胞內(nèi)ATP濃度調(diào)控的一種內(nèi)向整流鉀通道，于1983年由Noma首先在心肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)[1]。最近，我們證實(shí)：HG可通過損傷KATP通道引起心肌細(xì)胞損傷；外源性硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)可通過調(diào)控KATP通道對抗高糖引起的心肌細(xì)胞損傷[2]。KATP通道的心肌保護(hù)可能涉及多個與其關(guān)系密切的下游信號分子通路，進(jìn)一步探討KATP通道在H2S對抗高糖引起的心肌損傷中的分子作用機(jī)制，具有重要的意義。Akt是一種分子質(zhì)量約為60 ku的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[3]，是多條信號通路的重要交叉點(diǎn)，調(diào)控細(xì)胞生長與存活、增殖與凋亡、糖類代謝等多種生物學(xué)效應(yīng)。有研究指出：在鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)大鼠模型中，Akt的活性受到明顯的抑制[4]；另有研究證實(shí)：通過激活A(yù)kt通路可對心肌起保護(hù)作用[5-6]。由此可見，Akt通路在心肌細(xì)胞的生理和病理生理過程中發(fā)揮非常重要的作用。另一方面，新型氣體信號分子H2S是KATP通道的開放劑[7]，其對脂肪細(xì)胞[8]和神經(jīng)細(xì)胞[9-10]的保護(hù)作用與其激活A(yù)kt通路有關(guān)。此外，Tang等[11]報道：H2S可通過調(diào)控KATP通道/PI3K/Akt通路保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞對抗1-甲基-4苯基吡啶離子(1-Methy-4-phenylpyridnium Ion, MPP+)引起的損傷?；谏鲜鲅芯?，我們推測，通過開放KATP通道繼而激活A(yù)kt通路可能是外源性H2S保護(hù)心肌細(xì)胞對抗HG引起的損傷一個重要機(jī)制。

為此，本研究建立高糖損傷H9c2心肌細(xì)胞模型[12]，旨在探討：(1)HG對心肌細(xì)胞Akt信號通路的影響；(2)H2S能否減輕HG對Akt活性的抑制作用；(3)KATP通道和Akt通路之間的關(guān)系如何；(4)H2S是否通過調(diào)控KATP通道-Akt通路對抗高糖引起的心肌細(xì)胞損傷。

1材料與方法

1.1材料抗總(t)-Akt抗體、抗p-Akt抗體購自Cell Signaling Technology(USA)；硫氫化鈉(NaHS)、LY294002(Akt通路抑制劑)、雙氯熒光素(2′，7′-dichlorfluorescein-diacetate，DCFH-DA)、Hoechst 33258和JC-1購自Sigma-Aldrich(USA)；吡拉地爾(pinacidil, Pin)、格列本脲(glibenclamide, Gli)由Cayman Chemical Co.(USA)供應(yīng)；細(xì)胞計數(shù)試劑盒8(cell counter kit-8, CCK-8)購自Dojindo Lab(Japan)；DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司(USA)；特級胎牛血清購自Gibco BRL(USA)。H9c2 心肌細(xì)胞由中山大學(xué)實(shí)驗動物中心提供。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗分組H9c2心肌細(xì)胞來源于大鼠胚胎期的心臟組織，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于5% CO2、37 ℃的溫箱中培養(yǎng)。實(shí)驗分為10組：(A)對照(control)組：DMEM培養(yǎng)基(5.5 mmol·L-1葡萄糖)處理心肌細(xì)胞24 h；(B)高糖(high glucose, HG)組：35 mmol·L-1葡萄糖處理H9c2心肌細(xì)胞24 h；(C)NaHS+HG組：400 μmol·L-1NaHS作用心肌細(xì)胞30 min，撤去，PBS洗2次，接著35 mmol·L-1葡萄糖處理24 h；(D)Ly294002+NaHS+HG組：30 μmol·L-1Ly294002作用心肌細(xì)胞30 min，撤去，PBS洗2次，后續(xù)實(shí)驗步驟與(C)組相同；(E)NaHS組：400 μmol·L-1NaHS作用心肌細(xì)胞30 min，撤去，PBS洗2次，接著DMEM培養(yǎng)基處理24 h；(F)Ly294002組：30 μmol·L-1Ly294002作用心肌細(xì)胞30 min，撤去，PBS洗2次，接著DMEM培養(yǎng)基處理24 h；(G)Pin+ HG組：50 μmol·L-1Pin作用心肌細(xì)胞30 min，撤去，PBS洗2次，接著35 mmol·L-1葡萄糖處理24 h；(H)Pin組：50 μmol·L-1Pin作用心肌細(xì)胞30 min，撤去，PBS洗2次，接著DMEM培養(yǎng)基處理24 h；(I) Gli+NaHS+HG組：1 mmol·L-1Gli作用心肌細(xì)胞30 min，撤去，PBS洗2次，后續(xù)實(shí)驗步驟與(C)組相同；(J) Gli組：1 mmol·L-1Gli作用心肌細(xì)胞30 min，撤去，PBS洗2次，接著DMEM培養(yǎng)基處理24 h。

1.3Western blot 法檢測Akt蛋白表達(dá)水平將H9c2心肌細(xì)胞接種于35 mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)至80%滿時，各實(shí)驗組給予不同的處理因素后，用預(yù)冷的PBS洗3次，加入裂解液，4 ℃靜置30 min，12 000 r·min-1離心10 min，取上清，然后采用BCA法進(jìn)行蛋白定量?？偟鞍捉?jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉60 min，隨后分別加入抗t-Akt和抗p-Akt(1 ∶1 000)抗體，4 ℃過夜，然后用TBST洗3 次，5 min/次，與相應(yīng)的二抗(1 ∶2 500)室溫孵育1.5 h，用TBST洗3次，5 min/次。將PVDF膜用發(fā)光試劑ECL顯色，暗室曝光到X線片上，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結(jié)果。實(shí)驗重復(fù)5次。

1.4CCK-8測定細(xì)胞存活率將H9c2心肌細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，當(dāng)心肌細(xì)胞生長到占培養(yǎng)孔面積大約80%時，按各分組處理后，于每孔中加入10 μL CCK-8和90 μL DMEM，輕搖，37 ℃孵育2.5 h，用酶標(biāo)儀(λ=450 nm)記錄各孔吸光度(A)。取5孔A值的平均數(shù)，按下列公式計算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率/%=A處理組/A對照組×100%。實(shí)驗重復(fù)5次。

1.5Hoechst 33258核染色檢測細(xì)胞凋亡將H9c2 心肌細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，在細(xì)胞生長到占培養(yǎng)孔面積大約80%時，按各分組處理后，用PBS沖洗3次，然后用4%多聚甲醛于4 ℃環(huán)境中固定10 min，加入含5 mg·L-1Hoechst 33258試劑，于37 ℃溫箱孵育30 min，在熒光顯微鏡下(TE-2000′ Nikon′ Japan)攝片，鑒別正常的心肌細(xì)胞和凋亡的心肌細(xì)胞，隨機(jī)選取視野，在熒光顯微鏡下攝片。實(shí)驗重復(fù)5次。

1.6DCFH-DA染色測定胞內(nèi)ROS水平將H9c2心肌細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞生長到培養(yǎng)孔面積大約80%時，經(jīng)上述各實(shí)驗組不同的處理因素后，PBS沖洗3次，用10 μmol·L-1DCFH-DA染液于37℃溫箱中孵育30 min，然后用PBS沖洗3次。在熒光顯微鏡下隨機(jī)選取5個不重復(fù)區(qū)攝片，用ImageJ 1.47i軟件分析5個視野綠色熒光強(qiáng)度的平均值，再對每組的各樣本進(jìn)行統(tǒng)計分析。實(shí)驗重復(fù)5次。

1.7JC-1染色測定MMP將H9c2 心肌細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞生長到培養(yǎng)孔面積大約80%時，上述各實(shí)驗組經(jīng)不同的處理因素作用后，用PBS沖洗3次，用10 μg·L-1JC-1的無血清培養(yǎng)基于37 ℃溫箱中孵育45 min，然后用PBS沖洗3次。在熒光顯微鏡下隨機(jī)選取5個不重復(fù)區(qū)攝片，細(xì)胞核周圍綠色的亮點(diǎn)即為攝取了JC-1的線粒體。用Image J 1.47i軟件分析5個視野綠色熒光強(qiáng)度的平均值，再對每組的各樣本進(jìn)行統(tǒng)計分析。實(shí)驗重復(fù)5次。

2結(jié)果

2.1高糖抑制心肌細(xì)胞p-Akt蛋白的表達(dá)水平應(yīng)用35 mmol·L-1葡萄糖(高糖，HG)分別處理H9c2心肌細(xì)胞0～24 h，其中，3 h開始p-Akt蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)，6、9、12 h時進(jìn)一步降低(P<0.01)，HG作用24 h時，p-Akt降至最低水平(P<0.01)(Fig 1)。但是，HG對心肌細(xì)胞的t-Akt的表達(dá)水平無明顯的影響。

2.2KATP通道開放劑減輕高糖對心肌細(xì)胞p-Akt蛋白表達(dá)的抑制Fig 2顯示，HG作用心肌細(xì)胞24 h可使p-Akt蛋白的表達(dá)明顯減少，與對照組比較，差異有顯著性(P<0.01)。在HG作用心肌細(xì)胞前，應(yīng)用50 μmol·L-1KATP通道開放劑Pin預(yù)處理心肌細(xì)胞30 min，p-Akt蛋白的表達(dá)較HG處理組明顯增多，兩者差異有顯著性(P<0.01)。50 μmol·L-1Pin本身對心肌細(xì)胞p-Akt蛋白的基礎(chǔ)表達(dá)水平無明顯的影響(Fig 2)。

2.3KATP通道介導(dǎo)H2S對HG誘導(dǎo)的p-Akt蛋白表達(dá)水平下降的抑制作用Fig 3顯示，應(yīng)用HG處理心肌細(xì)胞24 h可使p-Akt蛋白表達(dá)明顯減少，與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。在HG處理心肌細(xì)胞前，應(yīng)用400 μmol·L-1NaHS預(yù)處理30 min，p-Akt蛋白的表達(dá)水平有所上升，與HG處理組比較，差異有顯著性(P<0.01)。但是，在NaHS預(yù)處理前，應(yīng)用1 mmol·L-1KATP通道阻斷劑Gli作用心肌細(xì)胞30 min，p-Akt蛋白表達(dá)明顯下降，與NaHS預(yù)處理組比較，差異有顯著性(P<0.01)。單純應(yīng)用400 μmol·L-1NaHS或1 mmol·L-1Gli本身對心肌細(xì)胞p-Akt蛋白的基礎(chǔ)表達(dá)水平無明顯的影響。

H9c2 cardiac cells were exposed to HG over a 24 h time period.**P<0.01vscontrol

A: Control; B: Glucose 35 mmol·L-1; G: Pin 50 μmol·L-1+Glucose 35 mmol·L-1;H: Pin 50 μmol·L-1.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsthe HG-treated group

2.4Akt通路介導(dǎo)H2S對高糖引起的心肌細(xì)胞毒性的抑制作用Fig 4顯示，應(yīng)用400 μmol·L-1NaHS預(yù)處理心肌細(xì)胞30 min能使細(xì)胞存活率升高，與HG組處理組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。但是，應(yīng)用30 μmol·L-1LY294002(Akt的抑制劑)預(yù)處理心肌細(xì)胞30 min，心肌細(xì)胞存活率較NaHS預(yù)處理組明顯降低，兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。NaHS或LY294002本身對細(xì)胞存活率無明顯的影響。

A: Control; B: Glucose 35 mmol·L-1; C: NaHS 400 μmol·L-1+Glucose 35 mmol·L-1; I: Gli 1 mmol·L-1+NaHS 400 μmol·L-1+Glucose 35 mmol·L-1; E: NaHS 400 μmol·L-1; J: Gli 1 mmol·L-1.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsthe HG-treated group;△△P<0.01vsthe NaHS+HG-treated group

A: Control; B: Glucose 35 mmol·L-1; C: NaHS 400 μmol·L-1+Glucose 35 mmol·L-1; D: LY294002 30 μmol·L-1+NaHS 400 μmol·L-1+Glucose 35 mmol·L-1; E: NaHS 400 μmol·L-1; F: LY294002 30 μmol·L-1.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsthe HG-treated group;△△P<0.01vsthe NaHS+HG-treated group

2.5Akt通路介導(dǎo)H2S對高糖致心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用Fig 5中Hoechst核染色的檢測結(jié)果顯示，正常的H9c2心肌細(xì)胞的染色質(zhì)分布均勻，呈現(xiàn)彌散均勻的低密度熒光(Fig 5A)。心肌細(xì)胞經(jīng)HG處理24 h，呈現(xiàn)典型的凋亡特征(即細(xì)胞核呈現(xiàn)濃縮致密的固縮形態(tài)或顆粒熒光)的細(xì)胞數(shù)量增多(Fig 5B)，與正常對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。應(yīng)用400 μmol·L-1NaHS預(yù)處理心肌細(xì)胞30 min，凋亡細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，與HG處理組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，F(xiàn)ig 5C)。然而，在NaHS預(yù)處理前，采取30 μmol·L-1Akt的抑制劑LY294002預(yù)處理心肌細(xì)胞30 min能使心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量增加，與NaHS預(yù)處理組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，F(xiàn)ig 5D)。NaHS或LY294002本身對細(xì)胞凋亡數(shù)量無明顯的影響(P>0.05)。

A: Control; B: Glucose 35 mmol·L-1; C: NaHS 400 μmol·L-1+Glucose 35 mmol·L-1; D: LY294002 30 μmol·L-1+NaHS 400 μmol·L-1+Glucose 35 mmol·L-1; E: NaHS 400 μmol·L-1; F: LY294002 30 μmol·L-1.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsthe HG-treated group;△△P<0.01vsthe NaHS+HG-treated group

2.6Akt通路介導(dǎo)H2S對高糖致心肌細(xì)胞內(nèi)ROS堆積的抑制作用Fig 6B顯示，采用HG作用H9c2心肌細(xì)胞24 h可使胞內(nèi)DCFH的平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity，MFI，能間接反映ROS水平)明顯增強(qiáng)，與正常對照組(Fig 6A)相比，差異有顯著性(P<0.01)。然而，在HG作用前，應(yīng)用400 μmol·L-1NaHS預(yù)處理心肌細(xì)胞30 min，可使MFI由(30.1±0.95)%降低至(14.1±1.13)%，兩者差異有顯著性(P<0.01，F(xiàn)ig 6C)。但是，先給予30 μmol·L-1Akt的抑制劑LY294002預(yù)處理心肌細(xì)胞30 min，再采用NaHS預(yù)處理，心肌細(xì)胞的MFI增加至(28.9±0.86)%，與NaHS預(yù)處理組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，F(xiàn)ig 6D)。NaHS或LY294002本身對心肌細(xì)胞ROS的生成無明顯的影響(P>0.05)。

A: Control; B: Glucose 35 mmol·L-1; C: NaHS 400 μmol·L-1+Glucose 35 mmol·L-1; D: LY294002 30 μmol·L-1+NaHS 400 μmol·L-1+Glucose 35 mmol·L-1; E: NaHS 400 μmol·L-1; F: LY294002 30 μmol·L-1.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsthe HG-treated group;△△P<0.01vsthe NaHS+HG-treated group

2.7Akt通路介導(dǎo)H2S對高糖致心肌細(xì)胞線粒體膜電位丟失的抑制作用Fig 7顯示，采用HG作用H9c2心肌細(xì)胞24 h，可使胞內(nèi)JC-1的平均熒光強(qiáng)度(MFI，是反映MMP大小的指標(biāo))從(20.1±0.59)%(正常對照組，F(xiàn)ig 7A)降低至(9.3±0.61)%(Fig 7B)，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。采用400 μmol·L-1NaHS預(yù)處理心肌細(xì)胞30 min，可使MFI升高至(13.1±0.86)%(Fig 6C)，與HG處理組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。但是，在NaHS干預(yù)前，應(yīng)用30 μmol·L-1Akt的抑制劑LY294002預(yù)處理心肌細(xì)胞30 min，心肌細(xì)胞MFI降低至(9.5±0.70)%(Fig 7D)，與NaHS預(yù)處理組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。單純NaHS或LY294002本身對心肌細(xì)胞MMP無明顯的影響(P>0.05)。

A: Control; B: Glucose 35 mmol·L-1; C: NaHS 400 μmol·L-1+Glucose 35 mmol·L-1; D: LY294002 30 μmol·L-1+NaHS 400 μmol·L-1+Glucose 35 mmol·L-1; E: NaHS 400 μmol·L-1; F: LY294002 30 μmol·L-1.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsthe HG-treated group;△△P<0.01vsthe NaHS+HG-treated group

3討論

Akt信號通路是細(xì)胞內(nèi)多條信號通路的交叉點(diǎn)，參與多種病理生理過程。有報道指出：鏈脲霉素誘導(dǎo)的大鼠糖尿病心肌病與Akt活性受到抑制有關(guān)[4]。本文在HG處理的H9c2心肌細(xì)胞模型觀察到，HG呈時間依賴性地抑制心肌細(xì)胞Akt的活性，這從細(xì)胞水平上進(jìn)一步證實(shí)高血糖對心肌細(xì)胞Akt通路的抑制作用。

最近，我們證實(shí)，抑制KATP通道是HG損傷心肌細(xì)胞的重要機(jī)制之一。有報道指出，KATP通道位于Akt通路的上游，KATP通道-Akt通路激活與減輕心肌缺血/再灌注損傷有關(guān)[5-6]，KATP通道開放劑可通過激活A(yù)kt通路對心肌起保護(hù)作用[6]。但是，在HG損傷心肌細(xì)胞的情況下，開放KATP通道能否對抗HG對Akt通路的抑制作用，迄今尚未見報道。為了探討此重要的學(xué)術(shù)問題，本文觀察了KATP通道開放劑(Pin)對HG抑制Akt通路活性的影響。結(jié)果表明，Pin能明顯地減輕HG對心肌細(xì)胞Akt通路的抑制作用。結(jié)合我們近期的研究結(jié)果[2]及上述的結(jié)果(HG抑制Akt通路的活動)，提示HG可通過抑制KATP通道-Akt通路損傷心肌細(xì)胞。

重要的是，我們進(jìn)一步探討了KATP通道-Akt通路在外源性H2S保護(hù)心肌細(xì)胞對抗HG損傷中的作用。越來越多的研究證實(shí)，H2S具有心肌保護(hù)作用，不僅能保護(hù)心肌細(xì)胞對抗缺血/再灌注引起的損傷[13-14]，也能抑制化學(xué)性缺氧引起的心肌細(xì)胞損傷[15]。最近，我們發(fā)現(xiàn)外源性H2S可通過激活心肌細(xì)胞KATP通道抑制HG誘導(dǎo)的損傷[2]，表明KATP通道介導(dǎo)H2S的心肌細(xì)胞保護(hù)作用。Tang等[11]證實(shí)，H2S可通過調(diào)控KATP通道-Akt通路對抗MPP+引起的神經(jīng)細(xì)胞毒性及細(xì)胞凋亡。但是，KATP通道-Akt通路在H2S對抗HG引起的心肌細(xì)胞損傷中的作用如何，目前尚未明確。為此，本研究觀察了NaHS預(yù)處理對HG抑制Akt通路活動的影響。研究結(jié)果表明，外源性H2S能明顯地減輕HG對心肌細(xì)胞Akt通路的抑制作用，提示通過激活A(yù)kt通路可能是H2S心肌細(xì)胞保護(hù)的另一個重要機(jī)制。此外，Akt通路的抑制劑LY294002 能拮抗H2S對HG引起的心肌細(xì)胞損傷的抑制作用，表現(xiàn)為細(xì)胞存活率降低、凋亡細(xì)胞數(shù)量與ROS 生成及MMP丟失增多。因此，前文[2]及本研究的上述結(jié)果清晰地表明，KATP通道-Akt通路在外源性H2S抑制HG引起的細(xì)胞毒性、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激及線粒體損傷中起著重要的作用。

綜上所述，抑制KATP通道-Akt通路可能是HG損傷心肌細(xì)胞的重要機(jī)制之一；外源性H2S可通過調(diào)控KATP通道-Akt通路對抗HG引起的心肌細(xì)胞損傷。

(致謝：本實(shí)驗在中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院科技樓完成，全體作者均參與實(shí)驗。在此，非常感謝實(shí)驗室各位老師和師兄師姐、師弟師妹在實(shí)驗中提供的幫助，尤其感謝中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室馮鑒強(qiáng)教授對本實(shí)驗設(shè)計、文章書寫給予的悉心指導(dǎo)！)

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Role of ATP-sensitive potassium channels-Akt pathway in hydrogen sulfide inhibiting high glucose-induced injury in H9c2 cardiac cells

LIANG Wei-jie1,2, CHEN Jing-fu3, HE Jie-yi1,2, SONG Ming-cai1,2,YU Sheng-long1,2, ZHANG Wen-zhu1,2, ZHENG Dong-dan3, LIAO Xin-xue4

(1.DeptofCardiology,CentralHospitalofPanyuDistrict,Guangzhou511400,China;2.CardiovascularInstituteofPanyuDistrict,Guangzhou511400,China;3.CardiacCareUnitofDepartmentofCardiology,HuangpuDivision,theFirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510070,China;4.DeptofCardiology,theFirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China)

Key words:ATP-sensitive potassium channels; Akt pathway; hydrogen sulfide; hyperglycemia; injury; cardiomyocyte

Abstract:AimTo investigate the role of ATP-sensitive potassium channels-Akt pathway in exogenous hydrogen sulfide(H2S) inhibiting the high glucose(HG)-induced injury in H9c2 cardiac cells.MethodsThe expression level of Akt protein was tested by Western blot assay. The cell viability was measured by cell counter kit-8(CCK-8 assay). The number of apoptotic cells was tested by Hoechst 33258 nuclear staining followed by photofluorography. The intracellular levels of reactive oxygen species(ROS) were detected by DCFH-DA staining followed by photofluorography. Mitochondrial membrane potential(MMP) was examined by JC-1 staining followed by photofluorography.ResultsH9c2 cells were treated with 35 mmol·L-1glucose(high glucose, HG) for 0～24 h respectively. After treating for 3 h, the expression level of phosphorated(p)-Akt protein began to be obviously reduced, the maximum reduced expression level was observed after the cells were exposed to HG for 24 h. Pretreatment of the cells with 50 μmol·L-1pinacidil(Pin, a KATPchannel opener) or 400 μmol·L-1NaHS(a donor of H2S) prior to exposure to HG considerably blocked the down regulation of p-Akt expression level induced by HG. However, pretreatment with 1 mmol·L-1KATPchannel blocker glibenclamide(Gli) obviously attenuated the inhibitory effect of NaHS on HG-induced down-regulation of p-Akt expression level. On the other hand, the protective effects of NaHS against the HG-induced cardiomyocyte injury were markedly blocked by 30 μmol·L-1Ly294002(an inhibitor of Akt), as indicated by the decrease in cell viability and MMP dissipation as well as the increases in the number of apoptotic cells and ROS generation.ConclutionKATPchannels-Akt pathway mediates the protective effect of H2S against the HG-induced cardiac injury.

收稿日期:2015-12-30,修回日期:2016-02-12

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81270296)；廣東省財政科技項目(No 2014SC107)

作者簡介：梁偉杰(1981-)，男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：心血管介入和心血管疾病的保護(hù)機(jī)制，Tel: 020-34859342，E-mail：279096515@qq.com； 廖新學(xué)(1965-)，男，博士，主任醫(yī)師、博士生導(dǎo)師，研究方向：心血管疾病的損傷與保護(hù)機(jī)制，通訊作者，Tel: 020-87332628，E-mail：liaoxinx@mail.sysu.edu.cn

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.04.018

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)04-0530-07

中國圖書分類號：R322.11；R329.24；R542.2

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-3-18 11:22網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160318.1122.036.html