唐陽(yáng)剛* 李敬輝徐新軍黃潔云

（1 麗珠集團(tuán)新北江制藥股份有限公司，廣東 清遠(yuǎn) 511500；2 中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東 中山 510000）

制備液相色譜法分離純化恩拉霉素預(yù)混劑中恩拉霉素A和恩拉霉素B

唐陽(yáng)剛1* 李敬輝1徐新軍2黃潔云2

（1 麗珠集團(tuán)新北江制藥股份有限公司，廣東 清遠(yuǎn) 511500；2 中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東 中山 510000）

目的 建立從恩拉霉素預(yù)混劑中分離純化恩拉霉素A和恩拉霉素B的制備高效液相色譜（Pre-HPLC）方法。方法 采用正丁醇與酸水反復(fù)萃取，利用Pre-HPLC方法對(duì)恩拉霉素精制品中的恩拉霉素A和恩拉霉素B進(jìn)行分離純化。結(jié)果 用紫外、質(zhì)譜和核磁共振法進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證，經(jīng)分析型HPLC檢查，恩拉霉素A和恩拉霉素B的純度均達(dá)98.0%以上。結(jié)論 由該法制備恩拉霉素A和恩拉霉素B簡(jiǎn)便、快速，所得產(chǎn)物純度高，適合于其對(duì)照品的制備。

恩拉霉素；制備液相色譜法；分離純化；恩拉霉素A；恩拉霉素B

恩拉霉素（enramycin）又名安來(lái)霉素、恩霉素、持久霉素，是一種由鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的多肽類抗生素，已被世界上許多國(guó)家正式批準(zhǔn)為抗生素飼料添加劑［1-3］。作為飼料添加劑，恩拉霉素具有優(yōu)良的促生長(zhǎng)和改善飼料利用率的作用，同時(shí)具有穩(wěn)定性高，腸道內(nèi)不易降解，無(wú)交叉耐藥性，無(wú)殘留等優(yōu)點(diǎn)。在當(dāng)前食品安全事件頻發(fā)的情況下，恩拉霉素因其廣譜、高效和安全而引起人們的關(guān)注［4-5］。

恩拉霉素是一種由氨基酸分子和脂肪酸分子組成的有機(jī)堿類，其中氨基酸分子組成環(huán)狀多肽結(jié)構(gòu)，脂肪酸分子位于多肽結(jié)構(gòu)末端。由于脂肪酸分子的不同，得到A、B兩種組分，恩拉霉素即為這兩種組分的混合物。恩拉霉素A和恩拉霉素B結(jié)構(gòu)非常相似，難于分離制備，目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)恩拉霉素A、恩拉霉素B對(duì)照品，恩拉霉素的研究及質(zhì)量控制、監(jiān)督管理中所需對(duì)照品依賴進(jìn)口，價(jià)格昂貴。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用反相高效制備液相色譜從恩拉霉素中分離純化得到恩拉霉素A和恩拉霉素B，為產(chǎn)品的質(zhì)量控制、質(zhì)量監(jiān)督、測(cè)試方法評(píng)價(jià)、化學(xué)量制溯源提供參考。

1　儀器和試劑

SHIMADZU HPLC儀，含SIL-20A型進(jìn)樣器，SPD-20A紫外檢測(cè)器，LC-20AT泵，LC solution工作站（日本島津公司）；Mettler toledo AL-204萬(wàn)分之一天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；SB25-12DTD型超聲清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；TGL-16B安科離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器公司）；RE-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；Bruker Autoflex Ⅲ smartbean基質(zhì)輔助激光解析電離串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（德國(guó)BRUKER公司）；Bruker AV600超導(dǎo)核磁共振波譜儀（德國(guó)BRUKER公司）。

8%恩拉霉素預(yù)混劑（批號(hào)：1101002，麗珠集團(tuán)新北江制藥股份有限公司），乙腈、甲醇（B&J）為色譜純，水為Milli-QRG純水系統(tǒng)制備的超純水（美國(guó)Millipore公司）。乙醇、正丁醇、乙醚、磷酸二氫鈉、鹽酸、氫氧化鈉（天津大茂）均為分析純。

2　方法和結(jié)果

2.1樣品制備：取8%的恩拉霉素預(yù)混劑約100 g，加入500 mL的60%乙醇攪拌均勻，用2 mol/L HCl（約90 mL）調(diào)pH至3，超聲提取30 min，減壓過(guò)濾。在濾液中加入約2 g活性炭后于水浴中煮沸15 min脫色，過(guò)濾除去活性炭，將濾液減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無(wú)醇味（約300 mL），將濃縮后的溶液用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至8，轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，用水飽和的正丁醇萃取，每次100 mL，萃取3次，合并正丁醇層，用100 mL水洗正丁醇層，重復(fù)操作一次。正丁醇層用100 mL pH為3的稀鹽酸水進(jìn)行反萃取，同法共萃取3次，合并酸水層，用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)所得酸水層pH至7.5～8，加100 mL水飽和的正丁醇萃取，重復(fù)3次，再用100 mL正丁醇飽和的水洗正丁醇層2次，將水洗后的正丁醇層減壓濃縮至小體積，加入100 mL乙醇共沸脫水，向脫水后的樣品中加入20 mL乙醚，放置于冰箱過(guò)夜，離心后得到類白色無(wú)定形沉淀，40 ℃減壓干燥12 h得類白色粉末作為供試品。

2.2色譜條件

2.2.1制備型HPLC。色譜柱：GRACE-Apollo C18（150 mm×10 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（B）-0.5%醋酸（A）（35∶65，v/v）；流速：4 mL/min；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：1 mL；檢測(cè)波長(zhǎng)：267 nm。

2.2.2分析型HPLC。色譜柱：Phenomenex Luna C18（200 mm× 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（B）-0.05 mol/L磷酸二氫鈉（A）（30∶70，v/v）；流速1 mL/min；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：267 nm。

2.3純品的制備：取恩拉霉素樣品約1 g，用15 mL pH=3的50%甲醇超聲5 min，經(jīng)4000 r/min離心，取上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液進(jìn)樣，進(jìn)行高效液相制備色譜分離，按上述制備色譜條件洗脫，收集7.8～9.5 min和14～16 min兩段組分。

2.4制備組分的純度檢查：取收集的兩份制備組分溶液按“2.2.2”項(xiàng)下分析HPLC條件進(jìn)樣，經(jīng)面積歸一化法計(jì)算，化合物A的純度為99.23%，化合物B的純度為98.86%。將純度大于98%的經(jīng)化合物A和化合物B分別以40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮至干，用甲醇超聲溶解，過(guò)濾，置于真空干燥箱內(nèi)40 ℃減壓揮干，最后得到2種類白色粉末。

2.5結(jié)構(gòu)鑒定?；衔顰：類白色粉末，UV（MeOH）λmax nm：231，272 nm；質(zhì)譜［MALDI-TOF/MS（m/z）］：m/z為：2355.891；其UV、MS與恩拉霉素A文獻(xiàn)報(bào)道［7］一致?；衔顱：類白色粉末，UV（MeOH）λmax nm：231，272nm；質(zhì)譜［MALDI-TOF/MS（m/z）］：m/z為：2369.945；，其UV、MS與恩拉霉素B的文獻(xiàn)報(bào)道［7］一致。

3　討 論

3.1由于樣品為預(yù)混劑，含大量發(fā)酵用培養(yǎng)基及敷料，因此需要進(jìn)行必要的前處理，根據(jù)恩拉霉素易溶于酸水，調(diào)整堿性后溶于水飽和正丁醇這一性質(zhì)，試驗(yàn)中采用正丁醇與酸水反復(fù)萃取的方法獲得以恩拉霉素A和恩拉霉素B為主的樣品。

3.2高效制備液相色譜法分離制備化合物不僅能夠得到高純度的化合物單體，而且產(chǎn)率高，操作方便，便于收集，制備出的產(chǎn)品可作為對(duì)照品。該色譜分離方法為在抗生素中分離高純度的化合物單體提供了參考。

［1］Higashide E，Hatano K，Shibata M，et al.Enduracidin，a New Antibiotic I，S treptom yces fungicidicus No.B5477，an Enduracidin Producing Organism［J］.Antibiotics，1968（21）：126-137.

［2］Asai M，Muroi N，Sugita H，et al.Enduracidin，a New Antibiotic II.Isolation and Characterization［J］.Antibiotics，1968（21）：138-146.

［3］顧欣，蔡金華，劉雅妮，等.飼料中恩拉霉素的微生物學(xué)含量測(cè)定方法研究［J］.中國(guó)獸藥雜志，2008，42（9）：17-21.

［4］卜仕金.多肽類抗生素飼料添加劑——安來(lái)霉素［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2003，39（4）：48-50.

［5］萬(wàn)文倩，楊文革，胡永紅.微生物檢測(cè)法 測(cè)定安來(lái)霉素發(fā)酵液生物效價(jià)［J］.飼料檢測(cè)，2010（3）：41-43.

［6］周岷江，嚴(yán)玉寶，胡娟，等.恩拉霉素的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)獸藥雜志，2007，41（12）：42-44.

［7］黃萍，萬(wàn)有能，鄧紅，等.恩拉霉素在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用進(jìn)展［J］.四川畜牧獸醫(yī)，2010（10）：29-30.

R917

B

1671-8194（2016）26-0022-02

2012年清遠(yuǎn)市產(chǎn)學(xué)研結(jié)合項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2012D021211001）

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