李麗君　范盎然　葛東宇　吳謙　王淑艷　李根茂　陳萌　李麗娜

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·論著·

黃芪當歸對藥對特發(fā)性肺纖維化小鼠生存狀況及組織修復相關基因表達水平的影響

李麗君范盎然葛東宇吳謙王淑艷李根茂陳萌李麗娜

【摘要】目的觀察不同劑量與配伍比例的黃芪、當歸對藥對特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis， IPF)小鼠生存率、體質量及組織修復相關基因c-kit原癌基因及堿性成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor2，FGF2)和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor ，VEGF)表達水平的影響，并探討其相互關系及保護機制。方法SPF級ICR雄性小鼠80只，隨機分為正常對照組、模型組，以及6個中藥治療組(大劑量黃芪50 g當歸10g組、大劑量黃芪30 g當歸30 g組、大劑量黃芪10 g當歸50 g組、小劑量黃芪25 g當歸5 g組、小劑量黃芪15 g當歸15 g組、小劑量黃芪5 g當歸25 g組)，除正常對照組外，其余各組采用氣管內注射博萊霉素(5 mg/kg)復制小鼠肺纖維化模型，于28天處死小鼠，采用real time-PCR法檢測組織修復相關基因c-kit、FGF2及VEGF表達水平，HE染色及武兆發(fā)簡化Mallory氏染色，觀察肺組織形態(tài)變化。結果HE染色及武兆發(fā)簡化Mallory氏染色顯示，6個中藥治療組較模型組均有所改善，其中中藥治療第1、6組改善明顯，肺泡結構已基本恢復。第28天時，與模型組比較，各組小鼠體質量均呈上升的趨勢，中藥第1組小鼠體質量上升趨勢較大(P<0.05)。28天死亡率，中藥治療組小鼠的死亡率較模型組降低，其中第1組死亡率與模型組的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。模型組c-kit、FGF2、VEGFmRNA表達水平均高于對照組(P<0.05)。結論從小鼠的生存率與體質量變化及病理形態(tài)觀察，大劑量黃芪當歸5∶1組能明顯改善小鼠的生存質量，其作用機制可能與抑制VEGF mRNA的表達水平，促進c-kit及FGF2 mRNA的表達水平有關。

【關鍵詞】肺纖維化；黃芪；當歸；堿性成纖維細胞生長因子；血管內皮生長因子

肺纖維化是多種急慢性肺病發(fā)展到一定階段的共同結果，特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)屬于肺間質性疾病的一種，主要表現為肺組織的損傷與異常修復，對于IPF的發(fā)病機制和原因目前尚未完全闡明。支氣管肺泡干細胞(bronchioalveolar stem cells，BASCs)由Kim于2005年首次報道[1]。BASCs具有分化成肺泡II型上皮細胞和肺泡I型上皮細胞的能力[2]，參與肺組織的穩(wěn)態(tài)維持和損傷修復。本實驗從肺纖維化小鼠生存率BASCs存活關鍵基因c - kit原癌基因及堿性成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor2，FGF2)和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor ，VEGF)表達水平的變化，探討不同配比與劑量的黃芪當歸對IPF小鼠的保護機制。

1材料與方法

1.1　材料

1.1.1實驗動物及分組SPF級ICR雄性小鼠80只，體質量18~22 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。小鼠隨機分為正常對照組、模型組、以及6個中藥治療組C組：大劑量黃芪50 g、當歸10 g；D組：大劑量黃芪30 g、當歸30 g；E組：大劑量黃芪10 g、當歸50 g；F組：小劑量黃芪25 g、當歸5 g；G組：小劑量黃芪15 g、當歸15 g；H組：小劑量黃芪5 g、當歸25 g。

1.1.2實驗藥物實驗用中藥配方顆粒(北京康仁堂藥業(yè)有限公司)，鹽酸博萊霉素(日本化藥株式會社)，將博萊霉素用生理鹽水配制成5 mg/mL的溶液。

1.1.3主要實驗儀器及試劑GIO-3A型高速冷凍離心機(北京醫(yī)用離心機廠)，PCR儀(PE公司)，紫外分光光度計(Beck men公司)，M-MLV逆轉錄酶和DNA聚合酶(Promega公司)，SYBR Green Supermix(BIO-RAD公司)。

1.2　方法

1.2.1動物模型制備參考文獻方法[3]制備小鼠肺纖維化模型：將各組小鼠用10%水合氯醛按小鼠體質量0.004 mL/g進行腹腔注射麻醉?？v向剪開頸部皮膚，暴露氣管，在第一、二氣管環(huán)之間緩緩注入博萊霉素(5 mg/kg)，立即將動物直立旋轉，使藥液在肺部均勻分布，手術縫合。

1.2.2給藥方法造模第二天起，6個中藥治療組給予中藥水煎液灌胃治療，灌胃劑量為0.1 mL/10 g。模型組和正常對照組給予等體積生理鹽水灌胃。每周稱重后調整給藥劑量，各組連續(xù)灌胃28天。

1.2.3標本收集與處理小鼠于給藥后第28天腹主動脈放血處死，迅速開胸，切下右肺中葉，Trizol法提取肺組織總RNA，real time-PCR法檢測c-kit原癌基因及FGF2和VEGF表達水平。右下肺葉用4%的多聚甲醛溶液固定72小時，經脫水、浸蠟、包埋后制成石蠟切片，用于HE染色及武兆發(fā)簡化Mallory氏膠原染色，觀察肺組織形態(tài)變化與膠原含量變化。

1.3　實驗數據統(tǒng)計分析

2結果

2.1　小鼠一般形態(tài)

對照組小鼠造模后皮毛光亮如初，活潑好動，肌肉豐滿，食欲旺盛，呼吸平穩(wěn)，體質量逐漸增加，該狀態(tài)一直持續(xù)；模型組小鼠造模后，絕大部分出現精神萎靡，行動緩慢，身體逐漸佝僂消瘦，食欲不振，皮毛逐漸暗淡枯搞，體溫降低，呼吸急促；中藥治療組中，C、E、H組小鼠較其他組精神狀態(tài)良好，活動基本正常，皮毛光亮，食欲旺盛，呼吸平穩(wěn)，接近對照組；D、F、G組造模后小鼠精神、食欲尚可，部分小鼠出現皮毛稀疏枯槁，活動量減少及消瘦，狀態(tài)不及成模前期，但較模型組稍好。

2.2　小鼠體質量變化情況

稱量各組小鼠第0天、7天、14天、21天、28天體質量，結果見表1。第7天時，除中藥治療E、F組外，其他各組小鼠體質量均呈下降的趨勢。中藥第C、E組體質量高于對照組(P<0.05或P<0.01)；第14天時，各組小鼠體質量均呈上升的趨勢，但均低于對照組(P<0.05或P<0.01)。第21天時，除模型組和中藥治療H組外，其余各組小鼠體質量均呈上升趨勢，但仍低于對照組，其中中藥治療C組小鼠體質量上升趨勢較大；第28天時，與模型組比較，各組小鼠體質量均呈上升的趨勢，中藥治療C、E組小鼠體質量上升趨勢較大(P<0.05)。

表1　各組小鼠不同時期體質量±s，g)

注： 與對照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與模型組比較，cP<0.05;n代表小鼠存活只數。

2.3　小鼠生存率情況

模型組7天死亡率為40%，各中藥治療組小鼠的7天死亡率較模型組均降低，其中H組死亡率與模型組的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；模型組28天死亡率為70%，各中藥治療組小鼠的28天死亡率較模型組均降低，其中C組死亡率與模型組的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結果見圖1及圖2。

A對照組　B模型組　C組(大劑量黃芪當歸5∶1)　D組(大劑量黃芪當歸1∶1)　E組(大劑量黃芪當歸1∶5)

圖2　各組小鼠生存曲線

2.4　HE染色觀察

光鏡下觀察，與對照組比較，模型組小鼠可見支氣管周圍及肺泡間隔有大量炎癥細胞浸潤，纖維化程度明顯。中藥C、H組肺泡炎明顯好轉，肺泡內未見明顯的炎性細胞，肺泡隔、細小支氣管周圍的纖維化病灶較模型組有明顯改善，肺泡結構已基本恢復。中藥D、E、F、G組肺泡炎較對照組重，但與模型組比較有不同程度地減輕，肺泡隔纖維增生灶較模型組有所改善，但不如C、H組明顯。光鏡觀察HE染色各組炎癥和纖維化程度的結果見圖3。

A對照組　B模型組　C組(大劑量黃芪當歸5∶1)　D組(大劑量黃芪當歸1∶1)　E組(大劑量黃芪當歸1∶5)

2.5　膠原染色觀察

油鏡下可見對照組肺泡結構正常，只有肺間質及部分支氣管周圍有少量膠原存在。模型組小鼠肺泡壁及肺泡間隔明顯增厚，肺泡結構被破壞，肺泡腔基本消失，小支氣管壁可見大量藍色膠原纖維沉積。各中藥組膠原含量較模型組均減少，表明這幾組中藥在減輕膠原纖維沉積和抗纖維化方面的都有一定的作用。其中中藥C、H組與模型組比較差異明顯，在減輕膠原纖維沉積和抗纖維化方面效果顯著。光鏡觀察武兆發(fā)簡化Mallory氏膠原染色纖維化程度的結果見圖4。

A對照組　B模型組　C組(大劑量黃芪當歸5∶1)　D組(大劑量黃芪當歸1∶1)　E組(大劑量黃芪當歸1∶5)

2.6　肺組織中c-kit及FGF2、VEGFmRNA的表達

與對照組比較，模型組肺組織c-kit、FGF2和VEGF的mRNA轉錄水平均升高(P<0.05)。中藥E、G、H組c-kit mRNA的表達低于模型組(P<0.05)，C、D、F組高于模型組(P<0.05)。FGF2 mRNA的表達，中藥D、E、G、H組明顯低于模型組(P<0.05或P<0.01)，C組高于模型組(P<0.05)。中藥E、H組VEGFmRNA表達水平較模型組降低(P<0.05)，F、G組高于模型組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。結果見表2。

表2　各組c-kit、FGF2、VEGF mRNA含量±s，pg/mL)

注： 與對照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與模型組比較，cP<0.05，dP<0.01;n代表小鼠存活只數。

3討論

許多研究結果顯示，急性肺損傷后，異常激活的肺泡上皮細胞產生的介質刺激上皮間質轉化誘導成纖維細胞灶的形成，造成疤痕和肺結構的破壞。損傷肺的修復引起彌漫性肺纖維化。干細胞作為體內未分化細胞具有很強地自我更新和向其他細胞分化的能力，在組織的自我修復中起到非常關鍵的作用。小鼠模型試驗顯示，間質干細胞遷移到肺組織內，發(fā)生類上皮樣分化，可減少博來霉素誘導的肺纖維化[10]。Wang等[11]研究人胚胎干細胞分化來源的肺泡Ⅱ型上皮細胞在博來霉素誘導的小鼠模型中的作用，結果發(fā)現這些肺泡Ⅱ型上皮細胞可以分化成為肺泡Ⅰ型上皮細胞，并阻止炎癥反應及纖維化反應的發(fā)生。

本課題組前期研究發(fā)現：BASCs在博來霉素導致的小鼠肺纖維化模型中數量顯著下降，提示BASCs的數量和功能可能與肺纖維化的發(fā)生與進展相關。實驗研究顯示：黃芪、當歸生藥和其提取物均有一定的抗肺纖維化作用，但黃芪當歸對藥及其提取物對IPF肺組織干細胞的干預作用及對IPF肺組織局部免疫微環(huán)境影響研究較少。有研究顯示，黃芪及含有黃芪當歸的藥物對c-kit陽性細胞具有促進增殖的作用，且對c-kit和干細胞因子(stem cell factor，SCF)蛋白表達具有一定的促進作用[4-6]，而SCF/c-kit信號恰恰是BASCs存活的必要條件。本實驗發(fā)現中藥C、D、F組能促進c-kit的表達，提示黃芪當歸可能通過c-kit通路調節(jié)BASCs的功能，抑制肺纖維化的進展。

FGF2能促進新生血管形成，啟動創(chuàng)傷愈合過程[7]。有研究發(fā)現，小鼠肺組織中FGFR各亞型的表達隨年齡增長而下降，其中FGF2表達量最高，也成下降趨勢，鼠齡較大的小鼠其肺組織更多的表現出纖維化改變，這可能與衰老過程中FGFR的表達水平下調有關[8]。推測大劑量黃芪當歸5∶1組的治療作用與上調FGF2基因、促進組織修復有關。

VEGF是近年來發(fā)現的一種特異的作用于血管內皮細胞的生長因子，具有促進血管內皮細胞分裂、增殖、促進血管形成，并具有促進血管通透性增加和維持血管正常狀態(tài)和完整性的作用[9]。血管生成是組織損傷后進行修復的必要條件之一，也是肺部纖維化的重要病理改變。研究顯示，在BLM導致的大鼠肺損傷區(qū)域，VEGF免疫反應細胞明顯增加，并隨著肺纖維化發(fā)展過程中各類細胞數量的增加，VEGF表達量亦增加[14]。 本實驗中藥治療C、D、E、H組均降低了VEGF基因的表達水平， 其中E組

效果最明顯，提示黃芪當歸能夠調節(jié)損傷的肺臟局部的血管生成，減輕肺纖維化程度。

本研究以經典的方法成功制備了IPF小鼠模型，并將不同劑量與配比黃芪當歸對藥應用于IPF小鼠。結果顯示，模型組小鼠體質量及生存率明顯降低，HE染色和武兆發(fā)簡化Mallory氏染色顯示肺組織有明顯的炎癥表現。經過黃芪當歸對藥治療28天后，與模型組比較，各中藥治療組小鼠肺組織炎癥表現明顯緩解，體質量及生存率顯著上升，綜合比較，大劑量黃芪當歸5∶1組效果顯著，其作用機制可能與抑制VEGF，促進c-kit及FGF2 mRNA的表達水平有關。

參考文獻

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(本文編輯： 董歷華)

作者單位： 100029北京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院[李麗君(碩士研究生)、范盎然、葛東宇、吳謙(碩士研究生)、王淑艷、李根茂、陳萌、李麗娜]

Influence of the pair drugs of astragalus and angelica on the IPF living conditions and tissue repair related gene expression level in miceLILi-jun，FANAng-ran，GEDong-yu，etal.BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100029，China

Correspondingauthor：LIWei-hua，E-mail：liweihua@medmail.com

【Abstract】ObjectiveTo observe the influence of different doses and compatibility proportion of the pair drugs of astragalus and angelica on the survival rate，weight and tissue repair kit and FGF2 c - related genes，level of VEGF expression of IPF mice and discuss the relationship between the pair drugs and the protection mechanism. Methods80 SPF ICR male mice were randomly divided into the normal control group，the model group，the traditional Chinese medicine treatment group and 6 (Three groups of large dose of astragalus membranaceus and angelica: 1.50 g and 10 g; 2.30 g and 30 g; 3.10 g and 50 g. Three groups of small doses of Astragalus and Angelica: 4.25 g and 5 g; 5.15 g and 15 g; 6.5 g and 25 g). Except the normal control group，other groups by intratracheal injection of bleomycin (5mg/kg) to replicate the model of pulmonary fibrosis in mice，the mice were sacrificed after 28 days. The expression levels of the repair of FGF2 and VEGF related gene c-kit were tested by RT-PCR; the morphological changes of lung tissue were observed by HE staining and Wu Zhaofa simplified Mallory’s staining. ResultsThe result of HE dyeing and reduction Wu Zhaofa Mallory showed that six Chinese medicine treatment groups were improved compared to the model group and the Chinese medicine group of 1 and 6 showed significant improvement, and the alveolar structure have been restored. Compared to the model group, mice weight of each group showed ascendant trend, and Chinese medicine group of 1 showed significantly larger trend of weight gain in mice (P<0.05). Mice mortality was reduced in the Chinese medicine treatment groups compared to the model group, and the group 1 showed significant difference(P<0.05). Expression levels of c-kit，FGF2，VEGF mRNA in the model group were significantly higher than the control group(P<0.05). ConclusionThe results showed that the large dose of astragalus and angelica group of 5∶1 can obviously improve the quality of the survival of mice and its mechanism may be related to inhibit the expression of VEGF mRNA level, and promote the c-kit and FGF2 mRNA expression level.

【Key Words】Pulmonary fibrosis；Astragalus membranaceus；Angelica；Fibroblast growth factor 2；Vascular endothelial growth factor

(收稿日期：2015-03-24)

通訊作者：李麗娜(1973- )，女，博士，副教授，副主任醫(yī)師。研究方向：經方治療疑難病的分子機制。E-mail：lilina1024@126.com

作者簡介：李麗君(1987- )，女，2012級在讀碩士研究生。研究方向：經方治療疑難病的分子機制。E-mail：798985179@qq.com

基金項目：北京中醫(yī)藥大學自主選題(2013-SYJS-113)

【中圖分類號】R285.5

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1674-1749.2015.12.005