王鴻周，施巧婷，朱肖亭，徐照學(xué)*

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450008；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002)

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科技推廣

奶牛性控凍精技術(shù)的使用要點(diǎn)

王鴻周1，施巧婷1，朱肖亭2，徐照學(xué)1*

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450008；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002)

本文從種公牛選擇、性控精液獲得方法、管理、受配牛的選擇以及人工授精等方面，介紹了如何更好地使用性控凍精為奶牛業(yè)的發(fā)展提供服務(wù)。

種公牛；性控凍精；人工授精；奶牛業(yè)

近年來中央一號(hào)文件都將“三農(nóng)”作為首要關(guān)注問題，具體包括農(nóng)民增收、提高農(nóng)業(yè)綜合 生產(chǎn)力、新農(nóng)村建設(shè)等方面。而通過乳制品工業(yè)帶動(dòng)，大力發(fā)展奶牛養(yǎng)殖及其配套產(chǎn)業(yè)，對(duì)農(nóng)村富余勞動(dòng)力的有效平穩(wěn)轉(zhuǎn)移、廣辟增收渠道、拓展增收空間、建設(shè)現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)具有重要意義。

目前，奶牛飼養(yǎng)管理水平低，飼料結(jié)構(gòu)不合理；奶牛良種缺乏，品種不一，單產(chǎn)水平不高；原料奶品質(zhì)不高，企業(yè)規(guī)模??；奶業(yè)科技投入不足，產(chǎn)業(yè)化程度有待提高，這是制約我國奶業(yè)的發(fā)展幾個(gè)重大難題。目前推廣奶牛群體改良的方法有三種：一是利用人工授精凍精技術(shù)體系；二是胚胎移植技術(shù)；三是引進(jìn)國外良種奶牛。胚胎移植技術(shù)成本較高，且操作復(fù)雜，不適合大規(guī)模牛群改良。伴隨人工授精技術(shù)出現(xiàn)的奶牛性控凍精技術(shù)，可以根據(jù)生產(chǎn)需要控制后代性別，利用高產(chǎn)優(yōu)秀種公牛作為精液來源，與常規(guī)精液相比，使用性控凍精可以更快地得到大批的產(chǎn)奶量高、品質(zhì)優(yōu)秀的母牛后代，加快了良種奶牛的繁育進(jìn)程,并提高了奶牛單產(chǎn)和牛奶品質(zhì)。另外，研究表明，使用性控凍精不影響后代母牛的生長發(fā)育和繁殖性能，可以為養(yǎng)殖戶帶來明顯的經(jīng)濟(jì)效益，因此，性控精液在奶牛育種生產(chǎn)中具有重要的作用。課題組經(jīng)過在使用性控精液實(shí)驗(yàn)過程中不斷總結(jié)經(jīng)驗(yàn)以及查閱資料，總結(jié)出使用性控凍精技術(shù)的幾個(gè)要點(diǎn)，以期為奶牛業(yè)的發(fā)展提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 把好源頭關(guān)挑選合適的種公牛

優(yōu)秀的種公牛是性控精液發(fā)揮作用的重要前提，種公牛優(yōu)良生產(chǎn)繁殖性能的發(fā)揮及精液的品質(zhì)高低與種公牛的種質(zhì)和體質(zhì)密切相關(guān)，種公牛不同則性控精液的分離效果也不相同，在鮮精活力相同的情況下，不同奶牛品種其精液的分離效果是不同的,一般奶牛的精液分離效果比乳肉兼用牛和肉牛分離效果好，青年公牛的精液分離和解凍效果也要優(yōu)于老齡牛，另外，應(yīng)激(熱應(yīng)激、疫苗注射)會(huì)對(duì)種公牛的精液品質(zhì)和分離效果有很大的影響，熱應(yīng)激對(duì)種公牛的影響主要是促使種公牛體溫升高，導(dǎo)致種公牛食欲減退，體況下降，引起陰囊皮溫和睪丸溫度升高，加之陰囊調(diào)節(jié)溫度能力差，導(dǎo)致精子生成障礙。另外，口蹄疫疫苗注射對(duì)種公牛精子活率、精液廢棄率及制凍數(shù)量也產(chǎn)生一定程度的影響，給精液生產(chǎn)造成一定的損失[1]。所以，在生產(chǎn)中，應(yīng)挑選青年牛作為種公牛，合理安排防疫，夏季注意防暑降溫避免熱應(yīng)激，做好種公牛的飼養(yǎng)管理工作。

應(yīng)嚴(yán)把性控凍精的質(zhì)量，根據(jù)提供性控凍精的種公牛系譜檔案選擇具有優(yōu)秀遺傳品質(zhì)，無遺傳缺陷的種公牛精液，并對(duì)肉牛個(gè)體的生殖系統(tǒng)發(fā)育情況、交配能力、性欲、射精量、精子形態(tài)、精子密度、精子活力和精液分離等進(jìn)行檢查，一般情況下，挑選原精活力高于75%的種公牛精液進(jìn)行分離，若原精活力低于75%時(shí)，則分離效果和凍后活力效果不佳[2]。由于不同種公牛個(gè)體精子對(duì)分離處理的耐受性不同，所以，雖然有些種公牛個(gè)體精液品質(zhì)優(yōu)良，但分離效果差就不適合作性控精液分離，應(yīng)挑選分離效果和凍后活力理想的種公牛進(jìn)行性控凍精生產(chǎn)。有研究表明，種公牛的精子形態(tài)與受胎率有一定關(guān)系，發(fā)現(xiàn)頭部越長越窄的精子，受胎率越高[3]。在生產(chǎn)中可以加強(qiáng)對(duì)有此類精子種公牛的挑選。

2 性控精液獲得方法

目前，性控精液的獲得方法主要是流式細(xì)胞儀法，此法依據(jù)X精子和Y精子頭部DNA含量的差異以及熒光染料Hoechst33342可以特異性地與精子DNA螺旋相結(jié)合，從而將X精子和Y精子有效分離，有研究表明，牛精液中X精子和Y精子的DNA含量差異大更加容易分離，目前X精子的分離準(zhǔn)確度可達(dá)90%以上。流式細(xì)胞儀分離法其主要流程包括采集精液-精液品質(zhì)檢測(cè)-合格者染色-流式細(xì)胞儀分離-性控精液冷凍-解凍。

在精液分離冷凍處理過程中，精細(xì)胞可能受到許多因素的干擾，如：采集到處理的間隔時(shí)間、高度稀釋、核染色、機(jī)械壓力(通過檢索儀時(shí)、激光照射、離心、冷凍等)。有研究表明，采集到處理的間隔時(shí)間越長，分離處理的效果越差，間隔時(shí)間一般不應(yīng)超過24小時(shí)，造成分離效果下降的原因，可能是在間隔時(shí)間內(nèi)，環(huán)境因素會(huì)造成線粒體產(chǎn)生的活性氧(ROS)增加，較高的 ROS 水平將會(huì)使精子線粒體發(fā)生膨脹，誘導(dǎo)線粒體膜通透性發(fā)生改變，釋放細(xì)胞色素C及其他凋亡相關(guān)因子損傷精子，損傷的精子又進(jìn)一步增加 ROS 的生成，最終導(dǎo)致精液品質(zhì)下降。另外，在精液冷凍解-凍過程中會(huì)造成部分精子的損傷和死亡，從而，產(chǎn)生更多對(duì)精細(xì)胞有害的ROS，精細(xì)胞的氧化損傷程度與精子冷凍效果有密切關(guān)系。為此，研究者一直以來，致力于研究精液冷凍保存的方法，探索選擇合適的染色液、稀釋液、鞘液、收集液、保存液、抗氧劑種類以及合適的冷凍保存方式，來提高精液冷凍保存的效果。稀釋液的種類和配方對(duì)精液的冷凍效果非常重要，組成稀釋液的主要成分包含糖類、鹽類、蛋白類及一些抗凍保護(hù)劑。常用的糖類有葡萄糖、蔗糖、乳糖和果糖等，稀釋液的糖類物質(zhì)不僅為精細(xì)胞提供能量，還具有一定的防凍作用，甘油是一種常用的抗凍保護(hù)劑，因?yàn)楦视蜐舛葘?duì)精子活力和頂體完整率有一定影響，對(duì)精細(xì)胞有一定的毒害作用，因此在運(yùn)用中應(yīng)注意控制其濃度。有研究發(fā)現(xiàn)，卵黃配合抗凍劑甘油對(duì)精液的冷凍保存也具有重要的作用。一般，卵黃的適宜添加量在15%～20%，再進(jìn)行充分?jǐn)嚢杌靹?。添加抗氧化劑主要是抑制精?xì)胞內(nèi)的自由基的生成，預(yù)防不飽和酸發(fā)生過氧化，從而對(duì)精細(xì)胞膜起到保護(hù)作用。添加的抗氧化劑種類主要有維生素和一些酶類，維生素C和維生素E在具有重要的抗氧化作用，Hu[4]等研究表明，稀釋液中添加維生素E能夠增強(qiáng)牛精子抗氧化酶活性，可以使精子冷凍-解凍后的質(zhì)量得到提高，其添加的適宜劑量為1.5 mg/ml。趙憲林等[5]研究在冷凍稀釋液中添加維生素C對(duì)荷斯坦種公牛X精子的影響發(fā)現(xiàn)，隨著解凍時(shí)間的延長，維生素C能夠減緩精子的死亡，而解凍時(shí)間短則效果不明顯，其適宜添加量為4～6 mg/mL,并且發(fā)現(xiàn)荷斯坦公牛X精子在解凍后，其精子活率、質(zhì)膜完整率及頂體完整率都有顯著提高。趙憲林等[6]對(duì)奶牛性控凍精生產(chǎn)工藝進(jìn)行改進(jìn)發(fā)現(xiàn)，改進(jìn)后的精子活率、頂體完整率、母牛受胎率、犢牛性別控制準(zhǔn)確率以及精液中抗氧化物酶活性都有顯著提高，在大幅度降低成本的同時(shí)加快了分離速度，并且提高了每支細(xì)管中的有效精子含量。值得注意的是，在冷凍處理前可以對(duì)精子進(jìn)行優(yōu)選，將死精畸形精進(jìn)行剔除，可以有效降低冷凍處理后的死精數(shù)，使得ROS產(chǎn)生減少，從而提高精液品質(zhì)。

3 管理要到位

牛場的正常運(yùn)行主要是靠人來執(zhí)行的，不管是大型牛場還是小型牛場，首先要建立一個(gè)統(tǒng)一的指揮系統(tǒng)，行使決策權(quán)，來有效地組織生產(chǎn)，協(xié)調(diào)各部門有序的工作，制定生產(chǎn)目標(biāo)對(duì)生產(chǎn)活動(dòng)進(jìn)行計(jì)劃、組織、指揮、協(xié)調(diào)和控制等一系列工作，保證生產(chǎn)順利進(jìn)行，并取得好的效益。明確分工，分配好各崗位的任務(wù)，各司其職，制定完善的的獎(jiǎng)罰制度，并嚴(yán)格執(zhí)行，做到獎(jiǎng)罰分明，營造良好的工作環(huán)境和條件，使員工能夠安心工作。沒有不負(fù)責(zé)的人，只有制度的執(zhí)行力不夠和不完善，在完善的制度之下，牛場員工才能上下一心為牛場發(fā)展盡職盡責(zé)。

4 受配牛的選擇和管理

奶牛性控凍精價(jià)格較高，奶牛場應(yīng)慎重選擇受配牛，就目前來說，應(yīng)主要選擇大于16月齡，體重中上等(350千克左右)，發(fā)情規(guī)律，體況良好的青年初配母牛作為受配牛，因其沒有生理負(fù)擔(dān)，營養(yǎng)狀況和子宮內(nèi)環(huán)境也相對(duì)較好，受胎率較高。一般牛場中對(duì)經(jīng)產(chǎn)母牛的子宮維護(hù)工作往往不是太好，加之性控精液的精子活力也較低，往往導(dǎo)致受胎率偏低，并且影響繁殖周期，增加養(yǎng)殖成本。若要經(jīng)產(chǎn)牛做受配牛，一定要選擇發(fā)情周期正常，無流產(chǎn)、傳染性疾病，營養(yǎng)狀況良好，生殖道恢復(fù)正常，子宮內(nèi)環(huán)境較好的高產(chǎn)奶牛，并且其受胎率最好在三胎以內(nèi)。注意在選受配牛之前一定要注意對(duì)生殖疾病的檢查，有病的牛堅(jiān)決不用。

所選受配母牛應(yīng)按照飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)一的飼養(yǎng)管理，提前進(jìn)行防疫接種，為避免受配母牛因營養(yǎng)不良，維生素及微量元素等缺乏所導(dǎo)致的受孕率低。日糧中必須注意添加礦物質(zhì)和維生素，保證受配母牛日糧的全價(jià)性。

5 人工授精

5.1 受配母牛的發(fā)情鑒定

準(zhǔn)確的母牛的發(fā)情鑒定對(duì)保證性控凍精的受胎率有重要影響，牛的發(fā)情時(shí)間短、情況復(fù)雜，應(yīng)根據(jù)母牛生理特點(diǎn)正確掌握母牛性周期的規(guī)律，根據(jù)發(fā)情各階段的特點(diǎn)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)發(fā)情母牛，摸清排卵規(guī)律，識(shí)別異常發(fā)情，準(zhǔn)確判定母牛發(fā)情所處時(shí)期，發(fā)情母牛主要表現(xiàn)為陰門腫脹、興奮不安、頻頻排尿、內(nèi)壁潮紅、有粘液排出、不時(shí)發(fā)出叫聲、嗅聞、接受爬跨和爬跨其他母牛，進(jìn)入發(fā)情旺期后，被爬跨時(shí)站立不動(dòng)。也可以通過直腸檢查法來鑒定母牛的發(fā)情時(shí)期，發(fā)情母牛子宮會(huì)明顯變軟，并有稍微增大；卵巢變大；卵泡質(zhì)地變軟且有波動(dòng)感，注意直腸檢查切不可用力捏卵泡，手法要輕柔。

5.2 適時(shí)輸精

性控精子在生殖道內(nèi)保持受精能力約8 h，精子獲能時(shí)間需2～4 h，最佳輸精時(shí)間應(yīng)在排卵前3～5 h輸精，此時(shí)排卵后輸精管內(nèi)聚集的獲能精子活力旺盛，增加了卵子的受精機(jī)會(huì)。有些散養(yǎng)戶往往會(huì)因?yàn)榘l(fā)情觀察不及時(shí)，而錯(cuò)過最佳的輸精時(shí)間，導(dǎo)致受胎率下降。生產(chǎn)中一定要準(zhǔn)確把握奶牛的發(fā)情時(shí)間，做好發(fā)情牛的記錄，做到不漏配不復(fù)配。

5.3 做好消毒工作

輸精前應(yīng)將輸精器械進(jìn)行嚴(yán)格消毒，若連續(xù)輸精，輸精槍每次使用完畢，應(yīng)用75%酒精棉球進(jìn)行擦洗，再用吸水紙擦干輸精人員的手臂也要進(jìn)行消毒，使用正規(guī)的長臂手套，注意更換，做到每操作一頭牛用一個(gè)手套，防止交叉感染。

5.4 解凍程序

凍精解凍要做到“三快”：快取、快投、快融解。從液氮罐中取出凍精細(xì)管，立即置于39～40℃水浴10～20s解凍。提取凍精時(shí)要迅速，提桶不得超出液氮罐口。取用時(shí)間超過 5 秒應(yīng)將提桶放回液氮內(nèi)，浸氮后再提取，以防凍精離開液氮時(shí)間過長，造成二次凍傷，影響精子活力，自水浴取出的細(xì)管，擦干后剪去一端裝入輸精槍，套上無菌塑料套膜。

5.5 輸精

首先將發(fā)情母牛保定在配種架內(nèi)，無條件的可將牛拴系于牛舍內(nèi)或樹樁上。輸精員首先觀察陰道內(nèi)有無炎性分泌物流出，有病的則不能輸精，留下記錄，以后再做治療處理。輸精員左手戴一次性塑料長臂手套，外面淋潤滑劑，如肥皂、石蠟油等，側(cè)身站立于牛體后面，先用手撫摸肛門，五指并攏成錐狀，以緩慢旋轉(zhuǎn)的動(dòng)作伸入直腸內(nèi)，排除積糞。助手用肥皂水洗凈外陰部并用一次性吸水巾擦干，或用75%酒精消毒并擦干，與此同時(shí)，開始進(jìn)行精液解凍，并裝槍，待裝槍完畢交給輸精員，然后助手站牛體側(cè)面用雙手拇指和食指各捏一半陰唇向上提拉，使輸精員清楚看到陰道口，待輸精員將輸精器插入后，助手立即用手抓住牛尾向上繞圈再拉向一邊，以有利于輸精員輸精操作。輸精員用右手持輸精器以30°角度(與水平面)通過陰唇插入陰道，當(dāng)輸精器碰到陰道上壁時(shí)，再以水平角度向前輕而緩慢地插入，避開尿道口，然后將左手伸入直腸內(nèi)，沿前下方輕輕觸摸，找到子宮頸并捏住子宮頸陰道端(注意不要把握過前，造成子宮口游離下垂，使輸精器不易插入)，這時(shí)開始兩手配合，右手把輸精器前端送到左手所捏部位，然后左右手配合搖動(dòng)，避免輸精器停留在陰道穹隆，使輸精器前端進(jìn)入子宮頸口，有時(shí)陰道壁可阻止輸精器插入，可通過后移輸精器或把子宮頸前移再緩慢插入，左手繼續(xù)前移改變子宮頸方向，使輸精器越過褶壁輪，槍頭插入子宮頸深部5～8 cm深的部位，注意不可盲目插入太深，以免弄破子宮內(nèi)膜造成子宮出血，一般到達(dá)有卵泡側(cè)子宮角基部或深部即可。這時(shí)，讓助手或自己用右手將輸精器內(nèi)精液緩慢推出，隨即慢慢抽出輸精器。若精液推出受阻，可以將輸精器稍向后退，并將精液注入。若發(fā)現(xiàn)輸精槍上有大量精液殘留，需要進(jìn)行重新輸精。待輸精器抽出后，左手最好在直腸內(nèi)停留幾秒，對(duì)子宮頸進(jìn)行按摩，可防止精液逆流。若遇到子宮頸難以插入的牛，可以用消過毒的擴(kuò)宮棒進(jìn)行擴(kuò)張，然后再進(jìn)行輸精操作。不可對(duì)一只牛操作時(shí)間過長，若超過十五分鐘還是難以插入就應(yīng)放棄，以免損傷奶牛的子宮。

牛場內(nèi)應(yīng)挑選有責(zé)任心、工作經(jīng)驗(yàn)豐富、對(duì)卵巢和子宮有熟練手感的的輸精員，進(jìn)行性控凍精的輸精，不要經(jīng)常更換配種員，嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，做好配種記錄，以防止近親繁殖。在輸精時(shí)也可同時(shí)肌注25μg LHRH-A3，可以顯著提高奶牛性控精液人工授精的受胎率[7]。對(duì)于養(yǎng)殖戶比較分散的地區(qū)，配種員應(yīng)配備小型的液氮罐，將性控精液裝在液氮罐里再到養(yǎng)殖戶進(jìn)行現(xiàn)場解凍，可以避免因?yàn)樾钥鼐航鈨龊笤谕饷嫱Ａ魰r(shí)間過長，造成精液活力下降。

6 小結(jié)

牛性控凍精改良技術(shù)在生產(chǎn)實(shí)踐中具有重大的利用價(jià)值，可以使養(yǎng)殖者獲得更大的經(jīng)濟(jì)效益，現(xiàn)在，市場上性控凍精的價(jià)格還比較昂貴，加之有些地區(qū)基層優(yōu)秀技術(shù)人員不足，飼養(yǎng)管理不當(dāng)，生產(chǎn)管理粗放，影響性控凍精的推廣應(yīng)用。建議提高對(duì)性控凍精技術(shù)實(shí)踐效果宣傳力度，通過重點(diǎn)區(qū)域、重點(diǎn)小區(qū)的示范使用，使廣大養(yǎng)殖戶意識(shí)到性控凍精的使用價(jià)值，從而慢慢接受并使用性控凍精；政府各部門制定優(yōu)惠政策，加大對(duì)奶牛養(yǎng)殖的扶持力度，調(diào)動(dòng)奶農(nóng)的養(yǎng)殖積極性[8]；加大對(duì)性控凍精技術(shù)的研究資金投入，著力降低性控凍精生產(chǎn)的成本。

目前，研究者也在致力于將性控凍精技術(shù)和其他技術(shù)結(jié)合起來的研究中，應(yīng)用性控凍精和超排技術(shù)生產(chǎn)奶牛性控胚胎是可行的[9]，以低產(chǎn)奶牛、黃牛和肉牛作為受體，將高產(chǎn)奶牛的性控胚胎進(jìn)行胚胎移植，可加速擴(kuò)繁高產(chǎn)奶牛群。相信在未來的發(fā)展中，在政府和各級(jí)部門以及研究者、廣大養(yǎng)殖戶的共同努力下，我國奶牛業(yè)定會(huì)取得更大的成就。

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The Key Utilization Point of Dairy Cow Frozen Sex-control Sperm Technology

WANG Hong-zhou1, SHI Qiao- ting1, ZHU Xiao-ting2, XU Zhao-xue1*

(1.InstituteforAnimalHusbandryandVeterinary,HenanAcademyofAgriculturalSciences,Zhengzhou,Henan450008,China;2.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou,Henan, 450002,China)

This essay expounded that how to use frozen sex-controlled sperm technology to make the development of the dairy industry better from the bull selection, the obtained method and management of frozen sex-control sperm, the selection of receptor cow and artificial insemination.

breeding bull; frozen sex-control sperm; artificial insemination; dairy industry

2015-11-12修改日期:2015-11-30

王鴻周(1990-)，男，河南濮陽人，碩士，研究方向：家畜胚胎工程。

*通訊作者：徐照學(xué)(1961-)，男，陜西華縣人，研究員，博士，主要從事家畜繁殖育種技術(shù)研究。E-mail:xuzhaoxue11@163.com。

S823.2

A

1001-9111(2016)01-0065-04